翁珊珊 郑翠苹(通讯作者) 吴圣豪 胡型忠 范玉芳温州市中心医院(温州医科大学定理临床学院)血液化疗科 浙江 温州 ３２５０００ 本课题受浙江省公益性技术应用研究项目(编号:２０１４C３３１５９)资助 本课题无经济利益冲突
【摘要】 目的 探讨PD－１/PD－L１在多发性骨髓瘤中的表达及临床意义.方法 采用流式细胞术检测初治MM 治疗前后及健康体检者外周血T 细胞表面PD－１的表达,并对其与MM 的临床分期及临床疗效进行相关性分析.结果 ① 初治MM 外周血T 细胞上PD－１的表达较健康体检者高,且治疗后明显下降,差异有统计学意义(P＜０．０５);②PD－１的表达水平与疾病分期呈正相关,与临床疗效呈负相关,差异有统计学意义(P＜０．０５).结论PD－１/PDL１信号途径可能参与了MM 的免疫逃逸及恶性增殖,有望成为MM 免疫治疗的新靶点及预后指标. 【关键词】 多发性骨髓瘤; PD－１; 免疫治疗【中图分类号】R７３３．３【文献标识码】A 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１０－００５２－０２
多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)是造血系统恶性克隆性疾病,其发病率居血液系统恶性肿瘤第二位,传统化疗方法完全缓解率不高,中位生存期只有２－２．５年[１].其原因之一可能为骨髓瘤细胞通过某种机制逃避机体的免疫监视和杀伤.导致MM 免疫功能紊乱的一个因素是程序性死亡－１(proＧcesseddeath－１,PD－１)的蛋白质.PD－１是B７家族的一个具有抑制作用的共刺激分子,主要表达于活化的T 淋巴细胞、B 淋巴细胞和巨噬细胞表面,在T(细胞的激活和耐受中起了关键作用[２].其配体为程序性死亡分子１配体－１ Programmeddeath１－ligand,PD－L１)[３].二者结合后,由PD－１ 传递负性调控信号诱导肿瘤抗原特异性T 细胞的凋亡和免疫无能,促使肿瘤的免疫逃逸[４－６]. 由此可推测,可通过细胞免疫水平的干预为抗骨髓瘤免疫治疗方案的实施提供基础,但是逆转骨髓瘤相关的免疫仍然面临严峻的挑战[７].本研究报道了PD－１在初治多发性骨髓瘤中的表达,并探讨其临床意义.
１ 资料与方法１．１ 资料选取２０１３年１０月至２０１５年３ 月我院收治的３０ 例初发MM 患者,年龄３８－７８岁,中位年龄６５岁;Ⅰ期３例,Ⅱ期１６例,Ⅲ期１１例[依据MM 国际临床分期系统(ISS)],其诊断标准及疗效评价统一参照?中国多发性骨髓瘤诊治指南?及国外诊断及疗效评价标准.所有患者要接受的治疗方案为含硼替佐米的BCD 方案((硼替佐米１．０－１．３mg/m２d１,d４,d８,d１１;环磷酰胺０．３g/m２,每疗程的d１、d１１静脉注射;地塞米松２０mg/d,每疗程的第１－２天、第４－５天、第８－９天及第１１－１２天静脉滴注,每２８d为１个疗程,根据患者年龄、一般状况、重要脏器功能等,适当调整药物剂量)化疗４个疗程.患者年龄、性别等一般情况具有可比性,差异无统计学意义(P ＞ ０．０５).所有入选患者在研究前７d未接受任何治疗.健康志愿者来自我院体检人员１５例,均无肿瘤、外伤、感染、传染病及自身免疫性疾病史,其中男性９例,女性６ 例,年龄４０－６５岁,中位年龄５０岁.本研究获得医院伦理委员会批准,所有入选患者均签署知情同意书和治疗同意书. １．２ 主要仪器及试剂CD８－PECY７、CD４PECY５、CD４５RAFITC、CD２７APC、PD－１－PE 及相匹配的对照抗体、PBS(HyClone)分离洗涤液均购自BD 公司;溶血剂(溶血素︰蒸馏水＝１︰ ９实验室自制);流式细胞仪FACSCalibur购自美国BD公司. 釆用flowjo流式分析软件对结果进行数据分析.
１．３ 方法１．３１ PD－１的测定 抽取初治MM 患者及健康体检者外周静脉血,肝素抗凝,用溶血素对标本进行溶血分离淋巴细胞,PBS洗１次,加入CD４/CD８、CD４５RA、CD２７和PD－１表面分子抗体,室温避光染色２０min,离心弃上清, 细胞用PBS洗涤２次,悬浮于５００μlPBS中,室温避光保存.用流式细胞仪分析,获取细胞数不少于５００００个,并用flowjo流式分析软件对结果进行分析.１．３２ 治疗后PD－１的测定 在患者接受化疗４个周期后,抽取患者外周血,肝素抗凝备用.操作方法及流程同上.１．３３ 临床疗效评价 ３０例MM 患者均在治疗４ 个周期后进行疗效评价,将疗效分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)、疾病进展(PD).１．３４ 统计学分析 使用SPSS１７．０统计软件进行分析,对正态分布的数值变量以均数±标准差(x±SD)表示;两样本均数的比较采用t检验和Spearman 相关性分析;以P＜０．０５为差异有统计学意义. ２ 结果２．１ 用流式细胞术对健康体检者PD－１的表达进行检测,得到了CD４＋ T 细胞表面PD－１平均表达水平为(６．６７±１．４２)％,CD８＋T 细胞表面PD－１ 细胞表面PD－１平均表达水平为(３．０±０．８２)％.见表１,图２. ２．２ 流式细胞术结果显示,初治多发性骨髓瘤患者广泛高表达PD－１,CD４＋T细胞表面平均表达水平为(２５．８±３．７３)％;CD８＋ T 细胞表面平均表达水平为(１４．７±１．９８)％,与健康体检者相比明显上调,差异具有统计学意义(P＜０．０５).见表１,图２. ２．３ 与治疗前相比,治疗后MM 患者PD－１的表达下降,CD４＋ T 细胞表面平均表达水平为(１６．６０±３．８８)％;CD８＋ T 细胞表面平均表达水平为((９．５７±１．９０)％),差异具有统计学意义(P＜０．０５).见表１,图２. 表１ 研究对象外周血PD－１表达量(X±s)或M(P２５－P７５)
３ 讨论研究表明,MM 作为免疫效应细胞肿瘤,存在体液免疫和细胞免疫的缺陷与失调[８].异常的浆细胞不仅能快速增殖,而且能模拟一些免疫系统信号通路,有利于肿瘤免疫耐受微环境的形成,削弱了免疫治疗和临床常规治疗肿瘤的有效性.特别是由于化疗无法彻底清除瘤细胞,因而残留骨髓瘤细胞易诱发复发和耐药[９].所以,免疫功能缺陷与失调在MM 发生和发展过程中起关键作用.PD－１通过限制T细胞的活化和增殖,抑制T 细胞的免疫效应功能.当PD－１与其配体PD－L１结合后,胞质区ITSM 结构域中的酪氨酸发生磷酸化,募集SHP－２磷酸酶,使下游的Syk 和磷脂酰肌醇３ 激酶发生去磷酸化, 从而传递抑制性信号.二者的结合既可抑制淋巴细胞的增殖和活化及CD４ ＋T 细胞向Th１和Th１７细胞分化,又可抑制炎性细胞因子的释放,起到免疫负调控的作用[１０－１２]
近几年研究发现,在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤等众多恶性肿瘤中PD－１均广泛高表达,且参与了肿瘤的免疫逃逸[１３],在MM 中也可见少量研究.william 和其同事在动物实验中发现,来自MM 老鼠模型的T 细胞高表达PD－１,其激活效应T 细胞的能力明显削弱,阻断PD—１后效应T 细胞的活化效能显著增强.本实验以往所有关于PD－１与PD－L１之间相互作用的研究都高度提示了其在MM 患者中可能存在同样的作用,有望为MM 免疫逃逸机制及其靶向治疗提供重要的实验依据. 本研究同时检测了健康体检者和MM 患者PD－１的表达,结果发现,在健康体检者中存在少量CD４＋PD－１＋T 细胞和CD８＋PD－１＋ T 细胞.这与王九平等[１４]的发现一致.目前尚不清楚正常人T 细胞PD－１表达的意义, 可能与免疫耐受的维持有关.而与健康对照组相比,在MM 患者中,CD４＋T 细胞和CD８＋ T 细胞表面PD－１的表达均增高;采用Spearman秩相关分析可以发现,PD－１的表达与骨髓瘤临床分期、疾病严重程度成正相关.这与Benson等的临床试验结果也一致.对这３０例MM 患者治疗４个周期后进行疗效评价,根据患者的临床症状、实验室指标及分期指南给患者的疾病活动度进行评分,发现达到CR为１０例,PR为１０例,SD 为５例,PD 为５例,我们可以得出,治疗有效并达到缓解的MM 患者PD－１表达明显下降,而治疗后疾病未缓解者PD－１的表达无明显下降,由此可以证明PD－１的表达水平与疗效呈负相关. 近年来,针对PD－１/PD－L１ 的阻断抗体也相继用于各种肿瘤的治疗[１５－１９],特别是在淋巴瘤、黑色素瘤的治疗中取得了惊喜的疗效.PD－１抗体(nivolumab)治疗难治和复发霍奇金淋巴瘤的临床试验结果显示,８７％ (２０/２７)患者有效,其中１７％ CR,７０％ PR.而应用Nivolumab治疗初治黑色素瘤１年生存率为７２．９％,无进展生存为５．１月,
均明显优于达卡巴嗪组.另一项应用BMS－９３６５５８阻断PD－１ 的临床试验显示,非小细胞肺癌的有效率为１８％,黑色素瘤为２８％,肾细胞癌为２７％.Iwai等人[７]可能是第一个用骨髓瘤小鼠模型证明抑制PD－１/PD－L１信号通路能抑制MM 瘤细胞生长的团队. 而Rosenblatt等也发现PD－１抗体CT－０１１能激活MM 患者树突状细胞、增强T细胞功能,从而发挥抗肿瘤活性. 本课题充分显示了PD－１在多发性骨髓瘤中高表达,且具有一定的临床意义,进一步推测了PD－１/PD－L１信号途径参与了MM 的免疫逃逸,阻断此途径可有效帮助衰竭T 细胞,促进抗肿瘤免疫应答.这为揭示MM 细胞免疫缺陷机制提供了重要线索,为其免疫耐受、临床治疗提供了重要理论依据,有望成为MM 免疫治疗的新靶点及预后指标.
参考文献[１] Raab MS,PodarK,BreitkreutzI,etal．Multiple myeloma[J]．Lancet,[ ２００９,３７４(９６８６):３２４－３３９． ２] HutchinsonL．Haematologicalcancer:PD－１blockade:openingthedoor[ toattack．NatRevClinOncol,２０１５;１２(２):６５． ３] Barber DL,Wherry EJ,Masopust D,etal．RestoringfunctioninexhaustedCD８Tcellsduringchronicviralinfection．Nature,２００６;４３９([ ７０７７):６８２－６８７． ４] YamamotoR,NishikoriM,KitawakiT,etal．PD－１– PD－１ligandinteraction contributes to immunosuppressive microenvironment of[ Hodgkinlymphoma[J]．Blood,２００８,１１１(６):３２２０－３２２４． ５] IwamuraK,KatoT,MiyaharaY,etal．siRNA－mediatedsilencingofPD－１ligandsenhancestumor－specific human T －celleffector[ functions[J]．GeneTher,２０１２,１９(１０):９５９－９６６． ６] BlankC,KuballJ,VoelklS,etal．BlockadeofPD－L１(B７－H１)augＧmentshumantumor－specificTcellresponsesinvitro[J]．IntJCancer,[ ２００６,１１９(２):３１７－３２７． ７] Ritchieds,Quachh,Fieldingk,etal．Drug－mediatedandcellularimmuＧ[ notherapyinmultiplemyeloma．[J]．Immuntherapy,２０１０,２:２４３－２５５． ８] BraunT,FenauxP．MyelodysplasticSyndromes(MDS)andautoimmunedisorders(AD):causeorconsequenceBestPractResClinHaematol,[ ２０１３;２６(４):３２７－３３６． ９] Murray ME,GavileCM,NairJR,etal．CD２８－mediatedpro－survivalsignalinginduces chemotherapeutic resistancein multiple myeloma．[ Blood,２０１４;１２３(２４):３７７０－３７７９． １０] IwaiY,Ishida M,TanakaY,etal．InvolvementofPD－L１ontumorcellsintheescapefromhostimmunesystemandtumorimmunotherapybyPD－L１blockade．ProcNatlAcadSciUSA,２００２;９９ (１９):１２２９３[ －１２２９７． １１] DulosJ,CarvenGJ,vanBoxtelSJ,etal．PD－１blockadeaugmentsTh１andTh１７andsuppressesTh２responsesinperipheralbloodfrompatientswithprostateandadvancedmelanomacancer．JImmunother．２０１２;３５([ ２):１６９－１７８． １２] YokosukaT,TakamatsuM,Kobayashi－ImanishiW,etal．Programmedcelldeath１formsnegativecostimulatorymicroclustersthatdirectlyinＧhibitTcellreceptorsignalingbyrecruitingphosphataseSHP２[J]．JExp[ Med,２０１２,２０９(６):１２０１－１２１７． １３] 韩丽娟,李汝平,张明智,等.B７家族及其受体PD－１在人NK/T 细胞淋巴瘤中的表达及临床意义．[J],中国肿瘤临床,２０１４,４１(６):３６３[ －３６７． １４] 王九平,张野,聂青和,等．PD－１分子对慢性丙型肝炎患者T 细胞免疫功能的影响[J]．肝脏,２００９,１４(３):２００－２０３． [１５] TopalianSL,DrakeCG,PardollD M．TargetingthePD－１/B７－H１ (PD－L１)pathwaytoactivateanti－tumorimmunity[J]．CurrentOpinion[ inImmunology,２０１２,２４(２):２０７－２１２． １６] SznolM,ChenL．AntagonistantibodiestoPD－１andB７－H１(PD－L１)inthetreatmentofadvancedhumancancer[J]．ClinicalCancerResearch,[ ２０１３,１９(５):１０２１－１０３４． １７] DuraiswamyJ,FreemanGJ,CoukosG．TherapeuticPD－１pathwayblockadeaugments withother modalitiesofimmunotherapy T－cellfunctionto preventimmune declinein ovarian cancer[J]．Cancer[ Research,２０１３,７３(２３):６９００－６９１２． １８] HamidO,RobertC,DaudA,etal．Safetyandtumorresponseswithlambrolizumab(anti– PD － １)inmelanoma[J]．New[ EnglandJournalofMedicine,２０１３,３６９(２):１３４－１４４． １９] BrahmerJR,HornL,GandhiL,etal．Nivolumab(anti－ PD－１,BMS－９３６５５８,ONO－４５３８)inpatients(pts)withadvancednon－small－celll[ungcancer(NSCLC):Survivalandclinicalactivitybysubgroupanalysis C]．ASCOAnnualMeetingProceedings,２０１４,３２(１５suppl):８１１２．
论文作者:翁珊珊 郑翠苹(通讯作者) 吴圣豪 胡型忠 范玉芳
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年9月供稿
论文发表时间:2016/2/23
标签：细胞论文; 免疫论文; 患者论文; 骨髓瘤论文; 疗效论文; 表面论文; 统计学论文; 《中国综合临床》2015年9月供稿论文;