潘红平[1]2004年在《动物腔前卵泡分离培养的研究》文中提出1．探讨了水牛和小鼠的各级腔前卵泡在卵巢中的分布规律、形态特征及超微结构特点。(1)水牛和小鼠卵巢中各级卵泡的分布具有明显的区域性，原始卵泡和初级卵泡分别位于血管稀少的皮质最外层和中层，而次级卵泡位于富含血管的皮质最内层。(2)水牛成年牛的原始卵泡的直径明显大于胎牛和青年牛(p＜0.05)，而叁者的卵母细胞直径和颗粒细胞数没有差别；成年牛的初级卵泡的直径和卵母细胞直径显着大于胎牛和青年牛，颗粒细胞数也显着较多(p＜0.05)。胎牛的次级卵泡的直径和卵母细胞直径显着小于成年牛和青年牛，颗粒细胞数也显着较少(p＜0.05)，次级卵泡的颗粒细胞在2—4层时分布不均，一侧较多，而另一侧较少。(3)7d、14d和28d小鼠的原始卵泡的直径、卵母细胞直径和颗粒细胞数均没有差异，赤道面颗粒细胞数约为10个。7d小鼠初级卵泡和次级卵泡直径和卵母细胞直径显着小于14d和28d小鼠，颗粒细胞也少(p＜0.05)。(4)水牛和小鼠腔前卵泡的基膜由两层薄而光滑的纤维状结构组成，线粒体中有帽状结构，卵母细胞的细胞器集中于细胞核附近。 2．探讨了不同分离方法对水牛腔前卵泡分离效果的影响。梳刮法平均每个水牛卵巢回收所得的腔前卵泡数(152.35±44.81)明显高于剪碎法(32.62±14.81)和显微分离法(8.95±3.44，p＜0.05)，且其平均每个卵巢的处理时间(39.05±4.27min)明显少于剪碎法(46.43±4.15min)和显微分离法(44.55±7.82min，p＜0.05)。梳刮法分离所得的腔前卵泡，其中原始卵泡最多(占41.25％)，其次为初级卵泡(占38.79％)，而次级卵泡最少(仅占19.95％)。结果表明，梳刮法能有效地分离回收水牛卵巢的腔前卵泡。 3．探讨了水牛胎牛、青年牛和成年牛卵巢腔前卵泡的分离效果。每个胎牛、青年牛和成年牛的卵巢分别获得943.43±143.13、249.50±40.11和128.50±19.99个腔前卵泡，胎牛卵巢获得的腔前卵泡数量明显多于青年牛和成年牛(p＜0.05)，表明水牛胎牛卵巢可分离得到较多的腔前卵泡。 4．探讨了剪碎结合酶消化法的水牛卵巢腔前卵泡分离效果。水牛卵巢先用眼科手术剪刀将其剪碎，然后分别用浓度为0(对照)、0.02％、0.04％、0.08％的胶原酶消化20min回收腔前卵泡，每个卵巢分别获得33.56±6.15、40.38±6.12、47.75±6.84和52.69±6.15个腔前卵泡，酶消化组的腔前卵泡数量明显多于单纯剪碎组(p＜0.05)，表 中文摘要明酶消化有助于提高剪碎法的腔前卵泡分离效率。 5.探讨了不同分离方法对小鼠卵巢腔前卵泡的分离效果的影响。梳刮法平均每个小鼠卵巢回收所得的腔前卵泡数明显高于剪碎法和显微分离法(61.00士9.12vs26.30士506和14.1肚4.61，p<0.05)，且其每个卵巢的平均处理时间明显少于剪碎法和显微分离法(30.80士3.glmin vs 39.10士4.olmin和38.40士3.50min，p<0.05)，梳刮法分离所得的小鼠腔前卵泡，次级卵泡最多(占83.61%)，其次为初级卵泡(占12.13%)，而原始卵泡最少(仅占4.26%)，表明梳刮法也能有效地分离回收小鼠卵巢的腔前卵泡。 6.探讨了分离方法和水牛年龄对水牛腔前卵泡的体外发育能力的影响。用梳刮法、剪碎法和显微分离法获得的水牛卵巢腔前卵泡体外培养48h和72h，其存活率差异不显着(p>0.05)。体外培养72h，胎牛腔前卵泡存活率明显低于青年牛和成年牛 (34.69%vs 52.67%、52.03%，P<0.05)。剪碎结合酶消化法分离得到的水牛卵巢腔前卵泡在体外培养72h后的存活率随着胶原酶浓度的增加而逐渐下降，浓度达到0.08%时下降达到显着性水平。结果表明，分离操作方法对水牛腔前卵泡的培养存活率没有影响，但酶消化处理则降低腔前卵泡分离后的培养存活率;水牛胎牛分离得到的腔前卵泡比青年牛和成年牛分离得到的腔前卵泡更难培养。 7.探讨了卵泡培养密度对水牛腔前卵泡的体外发育能力的影响。培养到IOd，单独培养(每孔放1个卵泡)的卵泡存活率(30.36%)与直径增长(7 .71士2.29林m)显着低于群体培养A(每孔放2一3个卵泡，51.61%、10.19士3.24林m)和群体培养B(每孔放4一5个卵泡，52.24%、10.94士3.80林m，p<0.05)，表明水牛腔前卵泡的群体培养效果优于单独培养效果。 8.探讨了卵泡大小对水牛卵巢腔前卵泡的体外发育能力的影响。体外培养10d，起始直径为101一120和扒21林m的卵泡的存活率显着高于叁60、61一80林m和81一10如m的卵泡的存活率，起始直径扒21林m的卵泡的直径增长显着高于且20林m的卵泡的直径增长(p<0.05)，表明直径较大水牛腔前卵泡的体外培养效果优于直径较小的腔前卵泡。 9.确定了水牛腔前卵泡体外培养胎牛血清(F Cs)的最佳浓度。体外培养10d，10%FCS组的卵泡存活率显着高于对照组和1%FCS组(p< 0.05)，卵泡的直径增长了14.36士4.90林m，亦显着高于对照组和1%FCS组、5%FCS组和20%FcS组的直径增长(P<0.05)，表明水牛腔前卵泡体外培养的适宜FsH浓度是10%一巧%。 10.比较了不同培养方法的水牛腔前卵泡体外培养效果。培养10d，叁维培养法的卵泡存活率显着高于微孔板培养法和二维培养法(p<0.05)，且卵泡直径平均增长了13.03士5.37林m，亦显着高于微孔板培养法和二维培?
张耀君[2]2010年在《小鼠和牛腔前卵泡体外分离培养的研究》文中研究指明哺乳动物卵巢含有大量处于不同发育阶段的卵母细胞,其中多数卵母细胞存在于无腔阶段的卵泡中,但大部分卵泡在无腔阶段(腔前卵泡)中闭锁、退化,没有得到相应的利用,这无疑是动物遗传和育种资源的极大浪费。因此,腔前卵泡的开发无疑是解决这一难题的有效途径。腔前卵泡的体外培养技术已取得了一定的发展,建立了多种培养体系,有其各自的优缺点,研究者一直在摸索合适的培养模型,以期找到一种能够模拟体内卵泡发育的环境条件和模式。影响腔前卵泡体外培养的因素很多,总结以前的成功经验,本研究从其中几个方面进行研究,旨在摸索出一套适合小鼠腔前卵泡体外生长发育的分离培养体系。1.通过石蜡切片-HE染色技术,研究不同发育时期小鼠卵巢内卵泡的分布状况及发育规律,选择适合发育时期的小鼠,为高效地将腔前卵泡分离出来奠定基础,还可为体外培养过程中卵泡发育结果鉴定的提供参考。研究结果显示：随着小鼠的发育,卵巢发育由最初的无皮质髓质之分到皮质髓质明显可分,卵泡发育从只能看见聚集呈条索状到发育成原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡,直至有腔卵泡的形成。从数量上看,原始卵泡逐渐减少,初次级卵泡逐渐增多,有腔卵泡数量也从无到有从少到多。卵巢由最初的无卵泡发育到有许多大小不等、处于不同发育时期的卵泡、大部分有腔样结构。生后10天～15天的小鼠的腔前卵泡最多,且此时的卵巢结缔组织、脂肪组织等都比较少,易于分离得到数量多且结构完整的腔前卵泡。另外,各级卵泡的分布在卵巢中具有区域性,卵巢皮质的最外层分布有大量的原始卵泡,密度较高,初级卵泡次之,次级卵泡则多数位于最内层,在皮髓的交界处分布相对较多。叁级卵泡和成熟卵泡会突出于表皮。从本实验研究结果来看,选择生后15天左右的小鼠的卵巢作为本研究体外分离腔前卵泡的材料比较理想。2.通过腔前卵泡的分离时间、数量、正常率、回收率等评价标准来比较酶-机械结合法和显微分离法这两种分离方法,旨在找出一种适合于从生后15天小鼠卵巢中分离腔前卵泡的有效分离方法,为更好地进行小鼠腔前卵泡的体外培养做好关键的第一步。研究结果显示：酶-机械分离法回收得到腔前卵泡的数量明显多于单纯的机械分离方法(显微分离法),且选择胶原酶浓度为0.1%分离的数量更多且正常卵泡数多。显微分离法所需时间较长,数量少,但体外培养6天后卵泡存活率更高。综合考虑,本实验选择采用显微分离方法分离生后15天小鼠腔前卵泡用做体外培养。3.通过建立一个适于小鼠腔前卵泡体外发育无血清培养系统,探索添加FSH、LH、VC对小鼠卵泡／卵母细胞体外生长发育的影响,旨在摸索一套适合小鼠腔前卵泡体外生长发育的培养体系。结果表明：腔前卵泡随着体外培养时间的延长,卵泡越来越大,卵泡直径和其中的卵母细胞直径都增加,但是卵母细胞增长的没有卵泡增长的快。且各浓度组在培养的第4天时,卵泡及卵母细胞直径增长最快。且第4天与第2,6,8天的卵泡增长值存在显着性差异(P<0.05)。无血清基础培养液中联合添加FSH400+LH 200、VC50ug/ml能够较大程度的促进卵泡及其中的卵母细胞增长,提高卵泡的存活率及成腔率,第八天后添加hCG和EGF进行培养24h,发生的GVBD率和排出PB1率比对照组要高。4.运用DNA琼脂糖凝胶电泳技术和RT-PCR技术来分别检测上述所选的无血清培养系统培养的不同时间的腔前卵泡凋亡情况及其Bcl-2/Bax在mRNA层次的基因表达情况,从分子生物学方面对该无血清培养系统进行评价。结果表明：在卵泡培养的第0天和第2,第6天,无论基础培养液还是上述的联合添加的完全培养液,bax和bcl-2基因都有表达,且随着培养时间的延长其表达越来越强,但是在培养的初中期bax的表达与bcl-2相当。只是在第6天时,对照组中表达稍强些。从培养的效果来看,实验组与对照组在培养的同期相比,实验组的Bax、Bcl-2基因表达均比对照组要强。DNA琼脂糖凝胶电泳检测卵泡凋亡结果显示：不论对照组还是实验组,都没出现典型的细胞凋亡的特征。表明本实验采用的基础培养液中联合添加FSH400mIU/mL、LH200mIU/mL和VC50ug/ml后用于体外腔前卵泡的培养是可行的。5.本研究还对牛卵巢中腔前卵泡和有腔卵泡的分布和形态学特征进行了研究,同时对牛卵巢中的腔前卵泡进行了体外分离和体外成熟培养,结果表明：牛卵泡的分布具有明显的区域性,与小鼠卵巢中卵泡的分布一致。体外培养试验中得到了释放第一极体的成熟卵母细胞。
靳双星[3]2005年在《猪腔前卵泡分离培养初步研究》文中研究说明卵泡是哺乳动物卵巢上的基本结构和功能单位,是卵母细胞生长和成熟的微环境。在卵泡发生过程中,卵巢上尽管有大量的原始卵泡存在,但真正能发育到排卵前的卵泡很少,造成遗传资源的巨大浪费。为了开发利用这一卵泡资源,我们对猪腔前卵泡分离培养方法及腔前卵泡卵母细胞的体外成熟培养进行了研究,目的是为了进一步挖掘猪的遗传潜力,为体外受精、动物克隆和转基因等胚胎生物技术研究提供大量的优质卵源。 分离方法研究:本研究以分离到的卵泡数量、分离时间和卵泡在体外培养叁天后的存活率为指标比较了两种机械方法分离猪腔前卵泡的效果。结果表明:用针刮法分离猪腔前卵泡的数量(φ<50μm:203600±59000;50μm≤φ≤1501μm:29.40±10.34;φ>150μm:9.30±3.29)显着高于剪碎法(φ<50μm:38900±12000;50μm≤φ≤150μm:13.954±3.70;φ>150um:4.954±1.61)(p<0.01),而且针刮法分离时间比剪碎法短(16.16±1.43min vs 20.30±1.48min,p<0.01)。体外培养叁天后,腔前卵泡存活率在两种方法之间没有明显差异(81.00% vs 78.97%,p>0.05)。说明应用针刮法分离猪腔前卵泡能有效保护卵母细胞和颗粒细胞的正常形态以及基膜的完整性,从而使分离到的猪腔前卵泡维持正常的生理活性。 基础培养液选择研究:本研究以卵泡生长快慢、卵泡腔形成状况和卵泡存活率为指标比较了M199和NCSU23两种基础培养液的培养效果,结果表明,培养在M199中的腔前卵泡生长速度显着快于培养在NCSU23中的腔前卵泡(5d:31.01±15.79 vs 21.73±12.69,p<0.01:10d:44.69±25.90 vs 33.25±17.35,p<0.05),培养在两组的猪腔前卵泡前5d的生长率都极显着地高于后5d的生长率(M199:31.01±15.79 vs 13.68±11.50,p>0.01;NCSU23:21.734±12.69 vs 11.52±9.19,p<0.01)。而腔前卵泡的成腔率和存活率没有明显差异。因此,选择M199培养液来研究不同培养方法和不同FSH浓度对腔前卵泡体外培养的影响。 培养方法研究:采用96孔培养板法、凹窝培养法和颗粒细胞铺层培养法对猪腔前卵泡进行体外培养。结果表明,培养在凹窝培养体系的腔前卵泡生长率显着低于96孔培养板法(5d:26.44±17.38 vs 19.18±9.37,p<0.05),但凹窝培养体系可以显着增加腔前卵泡的存活率(81.58% vs 55.88%,p<0.05),同时也证明颗粒细胞铺层培养法对腔前卵泡生长没有影响。 FSH添加剂量研究:本实验比较了M199培养液中叁种FSH浓度(0.5、1、2IU/mL)对腔前卵泡的影响。结果表明:FSH浓度为2IU/mL时腔前卵泡的生长率最高,0.5IU/mL和2 IU/mL两组之间,在卵泡生长率(5d:25.96±19.15 vs 36.59±16.28,p<0.05;10d:40.87±33.02 vs 60.73±26.58 p<0.01)、成腔率(9.09% vs 31.70%,p<0.05)和存活率(54.55% vs 81.48%,p<0.05)上存在着显着差异。叁个处理组腔前卵泡生长率,前5d和后5d相比差异极显着(0.5IU/mL组:25.69±19.15 vs 14.91±13.91,p<0.01;1IU/mL组:33.00±20.35 vs 17.65±15.17.p<0.01;2IU/mL组:36.59±16.28 vs 24.14±11.48,p<0.01)。 猪腔前卵泡卵母细胞体外成熟培养研究:为考察猪腔前卵泡卵母细胞最佳成熟方式,我们以极体排出情况为判断标准,采用一步法和两步法成熟猪腔前卵泡卵母细胞。结果表明:
冯贵雪[4]2003年在《水牛腔前卵泡分离培养的初步研究》文中研究表明本研究对水牛卵泡在卵巢中的分布规律及组织学特征、水牛腔前卵泡的分离与培养方法进行了系统研究。 (1)用常规石蜡切片法研究水牛卵泡在卵巢中的分布规律与结构特征。结果表明，各级卵泡的分布具有明显的区域性：原始卵泡位于卵巢皮质的最外层，形成原始卵泡层，初级卵泡位子皮质的中层，次级卵泡位于富含血管的皮质最内层；原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡的直径分别为36.9±7.7，48.7±8.9和91.9±27.3μm；与之对应卵母细胞的直径分别为19.6±6.0，27.3±7.1，49.1±17.4μm；原始卵泡和初级卵泡的颗粒细胞数为10.8±2.3个和18.1±3.1个。 (2)对水牛腔前卵泡的分离方法进行了系统摸索。结果发现，梳刮法(M1)可从每个水牛卵巢分离得到腔前卵泡152.4±44.8枚、显着多于剪碎法(M2，32.6±14.8)和显微分离法(M3，9.0±3.4)。进一步试验发现，M1所用工具的针距以500～750μm较为合适。电镜分析结果表明，M1法不损伤卵泡的基膜。用该法分离黄牛腔前卵泡，每个卵巢可得到腔前卵泡1195.2±685.0枚。由此表明，M1能有效分离水牛和黄牛的腔前卵泡。 (3)探讨了维生素C、FSH和EGF对水牛腔前卵泡发育的影响。结果发现，维生素C能维持后期卵泡的形态，对卵泡增长及存活没有影响，FSH能促进卵泡的体外增长，但对卵泡形态及存活没有影响，当与维生素C协同作用时，促卵泡增长的作用增强；EGF能促进培养初期水牛腔前卵泡的增长，且与FSH有协同作用。 (4)探讨了不同大小水牛腔前卵泡(60～180μm)的体外培养效果。发现随着卵泡的直径增加，体外存活率升高，增长的幅度上升，异常率下降。 (5)比较了普通培养法、二维培养法(琼脂糖铺底)和叁维培养法(琼脂糖包埋)的水牛腔前卵泡培养效果。结果发现，叁维培养法适宜培养60～100μm的卵泡，而二维法有利于100～140μm卵泡的体外发育。
刘晓明[5]2015年在《小鼠卵巢中六种microRNAs和细胞周期检验点蛋白Chk1/2的功能和调控机制研究》文中进行了进一步梳理哺乳动物卵泡发育和卵母细胞成熟过程由多种细胞因子和调控途径的参与,是一个复杂的调控网络,涉及细胞增殖、凋亡、周期及细胞分化调控,而基因转录过程中转录水平(如micro RNA调控)及翻译后水平调控(如SUMO化修饰)发挥着重要作用。利用本课题组已经获得的小鼠出生后至初情期不同时期及超数排卵过程中的micro RNA深度测序结果,本课题选择了可能参与调控细胞周期检验点激酶1(Chk1,DNA损伤检验点和正常细胞周期调控)、p53(细胞凋亡调控)及类泛素分子SUMO-1(蛋白质翻译后修饰)表达的6种micro RNAs(miR-15a、miR-16、miR-410、miR-485、miR-495和mir-133a),研究了这6种micro RNAs在不同大小卵泡中的表达规律及对卵泡刺激素FSH和黄体生成素LH的反应性;micro RNAs在体外培养腔前卵泡或颗粒细胞中的作用及机制;Chk1/2在卵泡发育、颗粒细胞生长和卵母细胞成熟过程中的作用和调控机制;检测并验证了调控p53、Chk1及SUMO-1的几种micro RNAs。研究结果如下:1.所选6种microRNAs在卵泡发育过程中的表达规律、作用和调控途径(1)不同直径大小卵泡中6种microRNAs的表达规律。分离并检测了腔前卵泡(100-130μm和200-280μm)和有腔卵泡(排卵前期卵泡450-550μm和围排卵期卵泡500-600μm)中micro RNA的表达规律。Q-PCR结果显示miR-410和miR-495在较大直径的腔前卵泡(200-280μm)内的表达显着性低于其它3个时期卵泡内的表达(P<0.01;P<0.05);miR-485在较大直径腔前卵泡(200-280μm)内的表达低于其它3个时期卵泡内的表达,同时其在有腔卵泡(500-600μm)内的表达显着高于腔前卵泡内的表达(P<0.01);miR-15a和miR-133a在较小腔前卵泡(100-130μm)内表达量最高,随着卵泡直径增加其表达水平显着性降低(P<0.001;P<0.001);miR-16在有腔卵泡内的表达水平显着性的高于腔前卵泡内的表达水平(P<0.01)。(2)FSH和LH对体外培养颗粒细胞中6种micro RNAs表达水平的调控。21日龄雌性小鼠卵巢分离获得的颗粒细胞(3w-GCs)进行体外培养,添加FSH培养6 h后,miR-485、miR-495、miR-15a和miR-133a的表达水平与0 h相比显着性降低(P<0.001),miR-410和miR-16的表达水平显着性升高(P<0.001;P<0.05);21日龄雌性小鼠腹腔注射PMSG 48 h后卵巢分离获得的颗粒细胞(pre-GCs)体外培养过程中添加lh,3h后mir-410、mir-485和mir-133a的表达水平与0h相比显着性升高(p<0.001),mir-15a和mir-16的表达水平显着性降低(p<0.05);lh培养24h后,mir-410、mir-485和mir-133a的表达水平降低。此外,利用microrna模拟物转染颗粒细胞过表达mir-485和mir-495,同时添加fsh培养。q-pcr结果显示fsh也可以显着下调模拟物对mir-485或mir-495的过表达水平(p<0.01;p<0.001)。(3)6种micrornas对腔前卵泡体外生长影响的初步研究。12-14日龄雌鼠卵巢分离得到的100-130μm直径腔前卵泡经过2d的预培养后,分别转染microrna模拟物过表达该种microrna,继续培养4-6d,每隔2d检测卵泡直径。结果显示转染mir-485模拟物过表达后,在前期(培养4d)实验组和对照组卵泡直径和卵泡生长速率没有显着差异,而培养到第6d过表达mir-485组卵泡直径显着低于对照组(p<0.01),其第4-6d卵泡的生长速率也显着低于对照组(p<0.05);转染mir-495模拟物过表达后,培养4d实验组和对照组卵泡直径没有显着差异,然而其第2-4d卵泡生长率显着低于对照组(p<0.05)。这些结果说明mir-485和mir-495可能抑制腔前卵泡的生长,这一结果与较小直径腔前卵泡高表达而较大直径腔前卵泡低表达mir-485和mir-495的结果一致。转染mir-133a、mir-15a和mir-16模拟物过表达后,对卵泡的生长和生长速率均没有显着性影响。但是,过表达该3种micrornas后,其第4-6d卵泡生长率均高于对照组。(4)6种micrornas对体外培养有腔卵泡颗粒细胞增殖和凋亡的影响。分别利用microrna模拟物或抑制物转染体外培养的排卵前卵泡颗粒细胞,转染48h后检测细胞增殖或凋亡情况。结果显示:过表达mir-485可以促进颗粒细胞增殖(p<0.001),抑制颗粒细胞凋亡(p<0.01);过表达mir-495抑制颗粒细胞的增殖(p<0.01),诱导颗粒细胞凋亡(p<0.01),使细胞周期阻滞在s期(p<0.01);过表达mir-133a可以抑制颗粒细胞的增殖(p<0.01),使细胞周期阻滞在g1期(p<0.01),而降低mir-133a可以促进颗粒细胞的增殖(p<0.001);过表达mir-15a可以促进颗粒细胞的增殖(p<0.001)。这些结果暗示这些micrornas可能通过对颗粒细胞增殖和凋亡的调控参与卵泡生长和闭锁调控。(5)mir-495对体外培养颗粒细胞中雌激素分泌的影响。体外培养的颗粒细胞经microrna模拟物转染48h后检测培养液中雌激素的含量。结果发现:过表达mir-495可以显着降低培养液中雌激素水平(p<0.001),同时,q-pcr检测相关基因表达发现mir-495模拟物可以抑制颗粒细胞中类固醇激素合成相关基因(cyp11a1、cyp19a1和star)mrna表达水平。这一结果暗示mir-495可能通过调控颗粒细胞中类固醇激素合成酶的表达而参与雌激素的合成和分泌,进而影响卵泡的生长和发育。(6)靶基因筛选和验证。利用双荧光素酶报告系统和颗粒细胞体外培养体系,成功筛选并验证了3个micrornas的靶基因。mir-485可以与p533’utr结合,并在转录水平调控p53mrna和蛋白的表达水平;mir-15a和mir-16可以与chk1mrna的3’utr结合,其中mir-16可以同时降低chk1的mrna和蛋白水平表达,推测其可能通过与chk1的3’utr区结合并介导其mrna降解,从而降低其蛋白表达水平,而mir-15a只能降低chk1的蛋白表达而对其mrna表达水平无显着影响,暗示mir-15a可能是通过结合chk1的3’utr后抑制其mrna翻译而调控chk1蛋白表达水平;mir-133a可以与sumo-1基因的3’utr结合,降低sumo-1蛋白表达水平,暗示mir-133a可能通过抑制sumo-1mrna翻译而调控其蛋白表达水平。2.chk1/2在小鼠腔前卵泡发育,颗粒细胞生长和卵母细胞成熟过程中的作用和调控机制研究(1)利用chk1/2特异性抑制剂azd7762抑制chk1/2后阻碍腔前卵泡的体外生长。腔前卵泡体外培养4d,抑制剂培养卵泡同对照组卵泡相比表现不生长或负生长的现象。通过显微镜观察卵泡的形态,发现抑制剂培养卵泡表现为卵泡闭锁。(2)抑制chk1/2后颗粒细胞生长阻滞。不同浓度chk1/2抑制剂azd7762培养颗粒细胞3d,结果发现抑制chk1/2后可以显着性的抑制颗粒细胞的增殖(p<0.001),具有时间和剂量依赖性;细胞周期被阻滞在s和g2期(p<0.001)。chk1/2抑制剂培养2d后可以显着性诱导颗粒细胞的凋亡(p<0.05)。同时,增殖相关基因pcna的mrna和蛋白表达水平被chk1/2抑制剂显着性的下调(p<0.01;p<0.01);凋亡相关基因bax的mrna和蛋白表达水平被chk1/2抑制剂显着性的上调(p<0.001;p<0.05)。(3)抑制chk1/2后可以降低卵母细胞的体外成熟率。卵母细胞体外成熟培养初期添加chk1/2或chk1抑制剂(azd7762和sb218078),结果发现抑制chk1/2或chk1对gvbd率没有显着性的影响,但是却显着性的降低pb1率(p<0.05);通过不同培养时间添加抑制剂AZD7762的方法,发现卵母细胞被阻滞在减数分裂的中期或前中期。(4)抑制Chk1/2破坏卵母细胞体外成熟培养过程中纺锤体的组装和染色体的凝集,改变α-tubulin、γ-tubulin、Securin和CREST的定位,诱导phospho-P38-MAPK表达升高。(5)抑制Chk1/2可以破坏成熟卵母细胞纺锤体形态并抑制卵母细胞激活率。超数排卵获得成熟卵细胞在含Chk1/2抑制剂AZD7762中继续培养1-2 h。发现培养1 h后卵母细胞纺锤体形态正常,而培养2 h卵母细胞中纺锤体结构显示严重异常。成熟卵母细胞在体外激活前添加Chk1/2抑制剂后再激活培养,其第二极体排放率和原核形成率均显着低于对照组(P<0.01;P<0.001)。总之,本论文揭示了6种micro RNAs在大小不同直径腔前卵泡和有腔卵泡中的表达规律及体外培养颗粒细胞中所选micro RNAs对FSH和LH的反应规律,初步探讨了其在腔前卵泡体外生长和颗粒细胞增殖、凋亡、周期和雌激素合成和分泌中的作用,检测并验证了参与调控p53、Chk1和SUMO-1表达的几种micro RNAs,并对Chk1/2在卵泡发育、颗粒细胞生长和卵母细胞成熟过程中的作用和调控机制进行了研究。该研究结果将为进一步深入探讨micro RNAs如何通过调控p53、Chk1及SUMO-1表达而参与调控卵泡生长和闭锁、颗粒细胞增殖和凋亡及分化奠定重要理论基础,为理解哺乳动物卵泡发育、排卵和卵子成熟机制提供理论参考。
潘红平, 石德顺, 冯贵雪, 梁明振, 蒙超衡[6]2004年在《哺乳动物腔前卵泡的研究进展》文中指出哺乳动物的卵巢中 ,含有数万个卵泡 ,其中绝大部分为原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡等腔前卵泡。然而能发育到成熟并排卵的卵泡为数甚少 ,约 99.9%的卵泡在腔前卵泡阶段闭锁、退化 ,这无疑是动物遗传和育种资源的极大损失。目前 ,卵母细胞是体外受精、胚胎移植
吕丽华[7]2004年在《山羊胚胎体外培养体系的优化以及胚胎干细胞分离培养技术的研究》文中研究表明本文研究山羊卵母细胞体外培养、体外受精及胚胎体外培养程序的优化,目的是为建立一套完善的山羊胚胎体外生产体系。从而为该技术走出实验室,在实践中得以应用提供理论依据。同时探讨山羊胚胎干细胞的分离培养技术,为核移植、转基因等胚胎工程后技术的应用奠定基础。试验一研究山羊卵母细胞体外成熟的培养方法,以提高山羊卵母细胞的成熟率。使用微滴法培养,探讨山羊卵母细胞的回收、成熟液的调整对比、添加不同激素、以及不同抗氧化物质等对山羊卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,选用胞质均一致密,外围至少有3 层以上卵丘细胞包裹的A 级卵母细胞,添加浓度为1 μg/ml 的E 2、5 μM 的?-ME,成熟培养27h 可显着提高卵母细胞体外培养的成熟率。使用国产绒促激素完全可以代替进口的FSH 和LH 用于山羊卵母细胞体外成熟培养,在相同效果的前提下可大大降低成本。试验二研究山羊体外受精条件的优化,为提高体外成熟卵母细胞的受精质量和数量提供理论基础。比较体外受精方法,不同获能物质的影响表明不同精子获能中,肝素效果比较稳定。Percoll 法处理精子卵裂率要显着高于上浮法,但是囊胚率和囊胚细胞数并没有提高。上浮法的精子镜检活力要好于Percoll 法分离的精子。但是,总体受精率、发育率还很低。试验叁通过优化培养程序,筛选培养液,以建立适合山羊胚胎体外发育的培养体系。通过共培养方法对共培养体系、换液程序、以及不同培养液的研究表明,在山羊胚胎培养中,基础培养液选用配制简单的SOF(CR1 也可使用),添加BSA/FCS,并采用正确换液程序,即48h 前是SOF+BSA,之后换为SOF+FCS 可获得理想的囊胚率和卵裂率。共培养条件下颗粒细胞和输卵管细胞对胚胎的发育并没有明显差异,但就发育率而言,显着优于无共培养体系。由此,说明共培养细胞类型对胚胎发育影响不大,但可以很好地克服胚胎的8~16-细胞阻滞。试验四利用透射电镜研究山羊体内胚和体外胚的超微结构,旨在对体外胚胎质量及其培养体系进行评价,为进一步提高体外胚胎的质量提供超微结构方面的理论依据。结果表明山羊体外胚胎质量要比体内发育胚差,包含有大量脂滴、畸形线粒体以及空泡化严重、细胞间隙连接较少且松散、核质比下降等。试验五以体内受精胚、体外受精胚和孤雌激活胚叁种不同来源的囊胚为材料,分离山
潘红平, 石德顺, 冯贵雪[8]2004年在《动物腔前卵泡的研究新进展》文中指出限制胚胎生物技术进展的一个重要因素是卵母细胞来源匮乏,而哺乳动物卵巢腔前卵泡的开发能有效解决这一难题。目前只有小鼠腔前卵泡卵母细胞经体外IVC能产生后代,但该培养系统用于培养大家畜的腔前卵泡效果并不理想。本文旨在回顾哺乳动物腔前卵泡分离、培养及其添加物的研究历史及现状,为今后的研究提供有益的启示和参考。
李洁云[9]2016年在《热应激对小鼠卵巢卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的影响及其机理研究》文中进行了进一步梳理夏季雌性哺乳动物的繁殖性能普遍降低,这与热应激改变卵巢卵泡发育和颗粒细胞功能有关。热应激可分为急性和慢性两种类型。尽管有研究报道热应激损伤卵巢功能,但慢性热应激影响卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的研究未见报道。本研究以小鼠为模型,分别开展以下叁部分实验：第一部分：探讨急性热应激对中小卵泡发育的影响。实验选择20只7周龄的雌性CD-1小鼠,随机分成2组。实验开始前对小鼠进行同期超排处理,实验期间,实验组小鼠每天置于37℃,相对湿度50%～50%的生化培养箱中热应激处理10h,其余时间和对照组一样,置于25℃的鼠房中饲养,热应激处理持续6天。期间,每天检测小鼠的肛温和体重,第6天热应激结束后对小鼠进行超排处理,收集卵母细胞和卵巢,观察超排卵数及卵泡闭锁情况。研究结果表明：急性热应激可提高小鼠肛温和超排卵母细胞数量,并降低体重。第二部分：探讨慢性热应激诱发卵泡闭锁的机理。将48只体况相似的3周龄CD～1雌鼠随机分成两组,实验组小鼠每天置于42℃,相对湿度50%～60%的生化培养箱中热应激处理3h,其余时间和对照组小鼠饲养条件一致,记录每天的采食量,实验期为4周。分别在第7、14、21和28天热应激结束后称重,之后两组各随机选取6只小鼠,处死后收集血浆,测定雌二醇水平。同时摘取卵巢,一侧卵巢用于分析卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡情况,另一侧用于检测热应激相关蛋白表达水平。研究结果表明：慢性热应激降低小鼠采食量、体重和血清雌二醇水平,增加卵巢组织热休克蛋白HSP70的表达,持续21天的慢性热应激增加有腔卵泡的闭锁率及颗粒细胞凋亡水平。第叁部分：探讨热应激影响卵泡颗粒细胞凋亡的机理。(1)分离小鼠有腔卵泡,37℃或42℃培养24h,之后收集卵泡检测HSP70和芳香化酶蛋白的表达水平。(2)分离小鼠卵巢颗粒细胞,37℃或42℃无血清培养12h或24h,之后检测细胞培养液中雌二醇水平和颗粒细胞HSP70、芳香化酶和Bim蛋白的表达水平。(3)分离小鼠卵巢,37℃或41℃处理2 h,分离颗粒细胞,一部分用于检测HSP70、Bim、断裂caspase-3和caspase-3蛋白的表达,另一部分进行有血清(24h)和无血清(6h)的培养,观察颗粒细胞表型变化,收集细胞分析相关蛋白表达水平。此外,有血清组还进行台盼蓝、Hochest和TUNEL分析。(4)分离小鼠卵巢,37℃或41℃处理2h,分离原始卵泡和生长卵泡继续培养6h,然后收集卵泡分析HSP70的表达。研究结果表明：有腔卵泡热应激诱导HSP70表达并抑制芳香化酶表达；颗粒细胞热应激诱导HSP70表达,显着提高芳香化酶水平,降低培养液中雌二醇含量；卵巢热应激诱导分离培养颗粒细胞HSP70表达,增加有血清组颗粒细胞的凋亡及HSP70、Bim和断裂Caspase-3蛋白的表达；卵巢热应激后,原始卵泡HSP70表达水平显着高于生长卵泡。综上结果,可得如下结论：(1)37℃热应激6天可增加小鼠超排卵母细胞数量,促进中小卵泡发育；(2)42℃热应激21天可抑制小鼠颗粒细胞芳香化酶表达,降低血清雌二醇水平,提高有腔卵泡闭锁率和颗粒细胞凋亡水平。(3)Bim和caspase-3参与了热应激诱导的小鼠颗粒细胞凋亡。
赵丹[10]2018年在《雌激素和TGF-β1对鸡原始卵泡和生长卵泡发育的调节作用及其机理的研究》文中研究说明家禽的卵巢中,同时存在不同直径的卵泡。卵泡作为卵巢的基本功能单位,其发育是一个受到精密调节的循序渐进过程。卵泡由卵母细胞和卵泡细胞(颗粒细胞和膜细胞)组成,卵泡之间和卵泡细胞之间的相互调节,形成了一个错综复杂的系统。在卵泡发育的过程中,绝大部分的卵泡发生闭锁而不能发育至排卵。产蛋量是评价家禽品种及个体质量的关键指标,对于不同发育阶段的卵泡进行深入研究,显得尤为重要。本实验以鸡为研究对象,通过观察和研究鸡卵巢中卵泡库的动态变化,建立卵巢和卵泡的体外培养模型,研究雌激素(17β雌二醇,E2)和转化生长因子β1(TGF-β1)在雏鸡和青年鸡卵巢发育中的调节作用并探究其机制,为家禽繁殖性能的研究提供理论依据。1.鸡卵巢早期发育的组织学研究家禽卵泡的发育是一个连续且快速发育的复杂过程,本章通过采用组织学方法研究胚胎期、出壳后早期、1～4wk以及1～4月龄的鸡卵巢组织的形态变化。结果表明:出壳后3～4d内,生殖细胞簇破裂形成原始卵泡,进而原始卵泡转变发育为生长卵泡。对1～4wk的雏鸡卵巢形态观察,卵巢中从没有卵泡结构发育至卵泡充满于整个卵巢组织的皮质。与此同时,卵泡中的颗粒细胞从扁平变至立方,从单层增殖到多层,膜层从无到有。卵泡的数目统计结果表明,4wk雏鸡中生长卵泡的数目约是1wk雏鸡的4倍。在雏鸡卵巢中观察到多核卵泡的有趣现象,卵巢中的多核卵泡可以分为叁类:1)对称卵泡,同体积卵母细胞的多核卵泡;2)不对称卵泡,一大一小卵母细胞的多核卵泡;3)融合卵泡,后期形成的融合卵泡,此类卵泡通过卵泡体外培养实验得到了验证。1～4月龄的鸡卵巢组织体积显着增大,已有少数小白卵泡(SWF)凸出于卵巢组织表面。同时,卵母细胞和卵泡的直径发生了显着变化。以上结果表明,鸡卵巢早期的发育是以卵泡库的动态变化为主,卵母细胞和卵泡细胞的生长发育为中心的生长过程。2.E2对鸡原始卵泡发育和激活的影响原始卵泡库的建立,对卵泡的选择和排卵以及维持雌性动物的繁殖性能是至关重要的。卵泡库形成的过程受到内/自/旁分泌因子的精确调节。类固醇激素和激素受体在家禽生殖和发育中具有重要作用。17β雌二醇(E2)对雌性动物的卵巢发育具有重要调节作用。在本实验中,对出生后3天(3d)的雏鸡体内注射不同剂量浓度的E2(0.025、0.25或2.5 mg/kg),处理4天后观察E2对雏鸡卵巢发育的调节作用。形态学观察结果表明2.5 mg/kg剂量浓度的E2,与对照组相比,分别增加了 28.5%的生长卵泡和8.9%的激活卵泡数(P<0.05)。同时,E2处理后增加了卵泡和卵母细胞的直径和面积。E2对卵泡发育的促进作用可被雌激素受体抑制剂他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)减弱。TAM组与E2组相比,降低了14.3%的生长卵泡数(P<0.05)和5.8%的激活卵泡数。PCNA免疫组织化学染色结果进一步证实,E2能促进卵巢中卵泡细胞的增殖,统计结果表明E2处理组中阳性颗粒细胞比对照组上调了 14%,阳性卵泡间质细胞比对照组上调了21.5%。免疫印迹实验检测PCNA蛋白,E2处理组中,该蛋白的表达量显着上调(P<0.001)。采用RT-PCR检测了体内外实验中雌激素受体和钙粘蛋白基因的表达,结果表明E2处理后,相关基因的表达均有一定程度的上调。以上研究结果表明E2通过增加雌激素受体和E及N型钙粘蛋白的表达,促进卵泡颗粒细胞和间质细胞的增殖,从而促进雏鸡原始卵泡的发育和激活。3.TGF-β1对鸡原始卵泡发育中的调节作用在雌性的生殖使命中,原始卵泡的形成和激活对于原始卵泡库的库容是非常重要的。卵泡发育的过程受到多种细胞因子、激素和信号通路的精密调节。TGF-β1超家族中的很多家族成员对卵巢功能的维持具有重要的调节作用。TGF-β1和TGFRβ1定位表达于多种物种的卵巢细胞中。在禽类中,TGF-β1是否具有调节生殖细胞簇的破裂和原始卵泡的发育研究较少。在本实验中,出壳后5d的雏鸡体内注射不同剂量的TGF-β 1(2.5,12.5和62.5 μg/kg或PBS作为对照,0.1 mL)处理3天,探究TGF-β1在早期雏鸡卵巢中卵泡发育的调节作用。卵泡数目的统计结果表明12.5 μg/kg的TGF-β1处理雏鸡卵巢,显着增加了生殖细胞簇的单位面积数量和降低了原始卵泡和生长卵泡的数量(P<0.05)。TGF-β1处理后下降了卵泡和卵母细胞的直径与面积。细胞增殖核抗原PCNA免疫组织化学染色结果表明颗粒细胞和间质细胞的阳性率分别比对照组减少了 16.2%(P<0.05)和2.48%(P<0.001)。PCNA免疫印迹结果也同样证实了 TGF-β1对早期卵泡发育的负调节作用。采用卵巢组织体外培养模型进行实验,10 ng/mL的TGF-β1处理培养的卵巢组织后生殖细胞簇的数量有所增加,原始卵泡和生长卵泡的数量相对减少(P<0.05)。但是TGF-β1对早期卵泡发育的负调节作用能被TGF-β1受体的抑制剂SD208拯救。荧光定量检测了相关基因的表达情况,其中类固醇激素合成酶和细胞周期调节蛋白的表达在SD208处理后,相比TGF-β1处理组表达量上调。以上研究结果表明TGF-β1通过抑制卵泡细胞的增殖和卵泡早期发育相关调节基因的表达,抑制生殖细胞簇过度破裂,维持原始卵泡库的库容。4.鸡生长卵泡的分离和体外培养模型的建立在哺乳动物中,卵母细胞和不同级别大小的卵泡已经得到成功分离和建立体外培养模型。在禽类中,由于禽类生长卵泡的体积远远大于哺乳动物生长卵泡的体积,导致建立培养模型的难度增加。在本实验中,采用叁种不同的分离家禽卵泡的实验方法,分别是酶消化法(胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶)和机械分离法,通过比较分离得到的卵泡质量和数量,建立最佳的卵泡培养模型。采用机械分离法分离得到83.5%的完整卵泡,而胰蛋白酶消化法和Ⅰ型胶原酶法分别分离得到63.4%和54.7%的完整卵泡。酶消化法可以分离得到的卵泡数量是275.7个/卵巢(Ⅰ型胶原酶法)和261.0个/卵巢(胰蛋白酶法),显着高于机械分离法(126.0个/卵巢)。将机械分离法得到的卵泡(800 μm)用于卵泡培养模型的研究。立体培养模型(3D)中的卵泡在体外培养7d后全部存活,平面培养模型(2D)中的卵泡在培养7d后仅有92.6%的卵泡存活。此外,通过掺入BrdU检测培养卵泡的细胞增殖和TUNEL标记凋亡细胞,结果表明3D模型中增殖细胞的数量明显高于2D模型;3D模型中凋亡细胞的数量显着低于2D模型。电镜观察培养卵泡的显微结构,3D模型中颗粒细胞紧密有序的排列,2D模型的颗粒细胞排列松散。卵泡刺激素(FSH)处理3D培养模型中的卵泡3d后,类固醇激素合成酶、细胞因子和细胞周期调节蛋白的基因表达水平均显着上调。以上结果表明,采用机械分离法对家禽卵泡进行分离的效率显着高于酶消化法,同时立体培养模型比平面培养模型更适合卵泡的体外生长。5.E2和TGF-β1对体外培养卵泡发育的调节作用在卵泡研究中,对原始生殖细胞和等级卵泡的研究较多,而对生长卵泡的研究较少。卵泡的发育是一个受到多种细胞因子和类固醇激素精密调节的复杂过程。本实验中,通过检测分离的叁个级别卵泡(400、800和1600 μm)中孕酮(P4)、睾酮(T)和雌二醇(E2)的水平,检测结果表明P4的含量随着卵泡的发育逐渐增加;T的含量随着卵泡的发育逐渐降低;E2的含量在叁个级别的卵泡中无显着差异。利用卵泡的体外立体培养模型,E2(0、10、100、1000 ng/mL)作用于培养卵泡5d,通过BrdU染色标记阳性增殖细胞,结果表明100ng/mL处理组能显着促进细胞增殖。TUNEL标记凋亡细胞实验表明该剂量组能明显抑制细胞凋亡。荧光定量检测相应激素受体(ERα、FSHR、LHR)和类固醇激素合成酶(Cyp19α1)的基因表达变化,结果表明E2(100ng/mL)能显着上调以上基因的表达水平。ERα的特异性阻断剂ICI182780,处理培养卵泡后能阻断E2对卵泡的调节效应,BrdU标记阳性增殖细胞减少,下调ERα和FSHR的基因表达水平。E2和 TGF-β1(100 ng/mL)联合作用于卵泡,对卵泡的体外生长发挥协同作用。用TGFβR1的特异性阻断剂SD208与TGF-β1联合作用于培养卵泡后,能显着下调Nr5α1和Cyp19α1以及细胞周期调节蛋白的基因的表达水平。以上研究结果表明E2和TGF-β1通过促进细胞增殖和相关激素受体的表达水平促进卵泡发育。类固醇激素和细胞因子的联合作用,能发挥协同作用促进卵泡生长。本实验通过观察鸡卵巢组织的形态学变化,阐明家禽卵巢的发育是以卵泡库的动态变化为主,卵母细胞和卵泡细胞的发育为中心的发育过程;通过建立卵巢组织的体外培养模型,研究雌激素(E2)和转化生长因子β1(TGF-β1)对早期雏鸡卵巢中原始卵泡的形成和激活的调节作用;通过比较多种分离卵泡的方法和培养模型,揭示机械分离法结合叁维培养是适宜家禽较大体积生长卵泡的体外生长发育。通过将E2和TGF-β1联合作用于体外培养卵泡,能发挥协同作用促进卵泡的生长发育。这些结果将为研究家禽卵泡生长发育的调节机理及提高家禽繁殖性能奠定重要的理论基础。
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