郑权[1]2003年在《应用两步氯化钙转化法高效制备双自杀基因重组腺病毒及其应用》文中进行了进一步梳理背景 大肠癌是严重威胁人类的主要肿瘤之一。目前的治疗手段主要以手术治疗为主，辅以全身或局部化疗和放疗。但术后肿瘤易复发，尤其是肝脏转移极易发生。据报道，大肠癌肝转移病人经手术治疗后5年生存率不到30％。随着分子生物学及基因工程的迅速发展，基因治疗已成为恶性肿瘤的有效治疗手段之一，在众多的基因治疗方法中，自杀基因疗法引起了许多学者的兴趣，成为近年基因治疗的研究热点。但传统的载体如逆转录病毒和脂质体等的转染效率和表达效率不高，再加上单一的自杀基因疗法易产生耐药性等原因，因而自杀基因疗法的效果欠佳。腺病毒作为新兴的载体因其转染效率和表达效率高而日益受到重视，成为肿瘤基因治疗的主要载体之一。 目的 传统的细胞内同源重组腺病毒载体制备方法步骤繁多、工作量大，而且成功率较低。He等采用细菌内同源重组法制备重组腺病毒，使制备过程大为简化，但对实验室的要求高，成功率仍不高(20％)。本研究的目的是构建CMV启动子驱动下的双自杀基因重组腺病毒，应用于大肠癌的治疗。 方法 本研究在细菌内同源重组法基础上设计了两步氯化钙转化法以提高成功率。利用PCR扩增出CD和TK基因，经适当改造后插入pAdtrackCMV中构建成转移质粒pAdtrackCMV-CDTK，经酶切线性化后，转化用氯化钙制备的感受态AdEasier-1细菌，获得重组腺病毒质粒。最后将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒，并用PCR鉴定所得病毒。滴度测定后，体外感染Lov。大肠癌细胞，进行杀伤实验。结果 结果显示，以JM 1 09细菌为模板，PCR扩增出的E. eoli CD基因和以pREps一TK中的TK基因模板，PCR扩增出的HSV- 1 TK基因经序列测定均与报道一致。应用氯化钙法由pAdtrackCMv- cDTK转化AdEasier一1细菌，可获得极高比例的(20/20)阳性重组腺病毒克隆。PCR检测表明已成功构建了含CD、TK融合基因的重组腺病毒。CD、TK融合基因全长2439bP，编码813个氨基酸。重组腺病毒感染Lovo细胞24h后，50%Lovo细胞可出现绿荧光表达。加入5一FC和GCV的一组，4d后可见绿荧光表达的Lov。细胞被杀死，而无绿色荧光表达的Lov。细胞也有部分被杀死，即旁观者效应。而不加前药的对照细胞，观察到绿荧光表达，但未见细胞杀伤。 结论 实验表明，应用两步法成功构建了CMV启动子驱动下的双自杀基因重组腺病毒，为进一步开展肿瘤的双自杀基因治疗研究奠定了基础。应用改进后的AdEasy系统构建腺病毒相比于传统AdEasy系统，方法更简便、成功率更高、实验周期更短。
郑权, 黄宗海, 汤福祥, 黄媛媛, 车小燕[2]2003年在《应用两步氯化钙转化法高效制备双自杀基因重组腺病毒》文中提出目的构建巨细胞病毒(CMV)启动子驱动下的双自杀基因重组腺病毒。方法应用PCR扩增出CD和TK基因,经适当改造后插入pAdtrack CMV中构建成转移质粒pAdtrack CMV-CDTK,经酶切线性化后,转化用氯化钙制备的感受态AdEasier-1细菌,获得重组腺病毒质粒。最后将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒,滴度测定后,体外感染血管内皮细胞ECV304。结果PCR检测表明已成功构建了含CD、TK融合基因的重组腺病毒,为进一步开展肿瘤的双自杀基因治疗研究奠定了基础。结论应用改进后的AdEasy系统构建腺病毒相比于传统AdEasy系统,方法更简便、成功率更高、实验周期更短。
林荣凯[3]2005年在《双自杀基因重组腺病毒靶向治疗大肠癌的体外实验研究》文中认为研究背景 在世界范围内,大肠癌的发病率居恶性肿瘤的第叁位。它恶性程度高,进展快,转移早。如何有效治疗大肠癌,抑制转移,是目前肿瘤基因治疗的一个难点。在众多治疗方法中,自杀基因治疗是其中研究较多的领域。自杀基因(suicide gene),又称为前药敏感基因(prodrug sensitive genes),是病毒和细菌等原核生物含有的一类基因,其编码的酶能将原来无毒的或微毒的药物前体转化成具有细胞毒性的代谢物进而杀伤宿主细胞。如TK基因通过编码生成的胸苷激酶特异地将核苷类似药物前体(GCV)磷酸化,进而在细胞内代谢成叁磷酸丙氧鸟苷,后者抑制细胞DNA聚合酶的功能或竞争性的渗入细胞DNA,使其合成终止,导致细胞死亡;CD基因则通过编码胞嘧啶脱氨酶将无毒的前体药物5-FC代谢成抗DNA合成的化疗药5-FU从而杀伤细胞。该疗法不但能直接杀伤转基因的肿瘤细胞,还可利用其独特的“旁观者效应”杀伤周围大量未转基因的瘤细胞,具有先转染后治疗、可靶向作用、可诱导免疫等优点,使该治疗方法在肿瘤的基因治疗中具有独特的优势。但同时,目的基因转导率低、反复治疗后肿瘤细胞具有抗药性和类型不同的肿瘤细胞各自敏感的自杀基因治疗系统不同等缺点严重影响了自杀基因治疗的应用效果。如何采取更有效的自杀基因
参考文献：
[1]. 应用两步氯化钙转化法高效制备双自杀基因重组腺病毒及其应用[D]. 郑权. 中国人民解放军第一军医大学. 2003
[2]. 应用两步氯化钙转化法高效制备双自杀基因重组腺病毒[J]. 郑权, 黄宗海, 汤福祥, 黄媛媛, 车小燕. 第一军医大学学报. 2003
[3]. 双自杀基因重组腺病毒靶向治疗大肠癌的体外实验研究[D]. 林荣凯. 第一军医大学. 2005