王亚玲[1]2003年在《水稻防卫反应基因P450 CYP72A基因簇和调控因子SGT1的研究》文中研究说明水稻作为全世界栽培最为广泛的粮食作物之一和单子叶的模式植物，其抗病性研究非常重要。近十年来，植物防卫反应研究取得较大进展的是“gene for gene”分子模型的建立以及一系列R基因的克隆。但由于小种专化性，这些进展并没有给实际应用带来太大的突破。因此人们将目光转向抗病信号转导的下游分子。 植物P450广泛参与植物的生长发育以及防卫反应。本文根据以前的结果，在水稻的基因组中找到了一个可能与水稻防卫反应有关的P450基因簇，并将其归入CYP72A家族，各成员分别命名为CYP72A17～23。本文对这个基因簇进行了结构及进化树分析，并分别研究了这七个成员受病原菌侵染及发育和组织的表达特异性。结果显示该CYP72A基因家族各个成员之间的相互差异比较大，可以分为两个不同的进化亚组。七个成员中，CYP72A18、19、23受到病原菌侵染的诱导，而且在H7R、H7S两个近等基因系中有明显的不同；除CYP72A20外的六个成员均具有发育和组织特异性表达；CYP72A20在所有的研究中都没有检测到，可能是一个假基因。本研究对P450在水稻生长发育和防卫反应中的作用，以及P450基因簇的研究提供了基础。 SGT1参与了植物抗病信号转导过程中的蛋白降解，这一发现是目前植物抗病研究中最为瞩目的进展。我们在水稻基因组中克隆了它的同源基因OsSGT1，并构建了基因组克隆和cDNA克隆正义及反义的植物转基因表达载体，并将它们导入粳稻品种TP309，得到了相应的阳性转基因植株，相关的抗病性检测正在进行之中。与此同时，我们还构建了OsSGT1的原核表达载体，得到了大肠杆菌中超表达的OsSGT1蛋白。利用纯化的原核表达的OsSGT1免疫兔子获得其单抗的试验也在进行当中。这些工作为研究水稻SGT1的作用以及获得广谱抗病性的转基因水稻打下了坚实的基础。
李文奇[2]2012年在《转hrf1基因水稻抗白叶枯病机理研究及水稻抗病相关基因Oscyp71Z2的功能分析》文中认为水稻白叶枯病是由黄单胞病菌侵染引起的水稻叁大病害之一,每年造成10%到80%的产量损失,威胁着世界粮食安全。目前,大量使用化学农药已经严重破坏了生态环境。同时,水稻品种抗性易于丧失对水稻抗病育种提出更高的要求。经济有效且环境友好的控制病害途径之一就是利用生物技术创制持久的、广谱抗性水稻栽培品种。而鉴定水稻抗病相关基因是培育抗病水稻新品种的基础。进一步发掘具有潜在利用价值的激发子蛋白编码基因为通过改善水稻自身防御体系来控制病害提供了可利用的资源。来源于白叶枯菌株JXOⅢ的harpinxoo蛋白通过激活多重防卫反应,如系统获得抗病性(system acquired resistance, SAR)、过敏反应(hypersensitive response, HR),从而增强植物对多种病害的抗性。然而,仍旧不清楚植保素以及信号分子活性氧是否也在harpinxoo蛋白所激发的水稻抗病信号通路中起作用。在前期研究工作中,本实验室获得的部分转编码harpinXoo基因hrfl水稻T3代纯合体增强了对白叶枯病的抗性。在此基础之上,本研究选择转hrfl基因水稻T3代纯合体NJH12用来分析hrfl异源表达增强水稻白叶枯病抗性的机理。本研究表明,在水稻中异源表达harpinxoo蛋白编码基因hrf1激发了植保素生物合成通路,同时抑制了内源H202产生,并增强了对白叶枯病菌的抗性。在水稻中异源表达hrfl基因显着诱导植保素合成相关基因表达,促使快速持续地大量合成植保素。随着抗氧化酶活性的变化,转基因系的ROS-清除能力升高,H202量显着减少。通过扫描电镜和能谱分析,转基因水稻的硅含量显着升高,并且有部分的硅质体的分布也发生变化。在接菌的条件下,转基因系的防卫反应相关基因的表达量也显着升高。这些结果为更好地理解防卫反应在hrfl介导的白叶枯病抗性中所起到的作用提供了证据,并且也为获得非特异性病害抗性转基因植物提供了可利用的资源。从转hrf1基因水稻NJH12芯片数据中筛选到一个表达倍数高达114.6倍的抗病相关基因。随后经生物信息学分析该基因是一个细胞色素P450基因,命名为Oscyp71Z2,是CYP71Z亚家族成员之一。从水稻品种日本晴中克隆Oscyp71Z2全长基因、Oscyp71Z2RNAi靶片段以及启动子上游序列分别构建超量表达载体、RNAi载体以及启动子/GUS融合载体,利用农杆菌介导法转化水稻日本晴。常规PCR和Southern blot结果表明T-DNA区已整合到水稻基因组中。Northern blot和Western blot结果表明超量表达株系Oscyp71Z2的转录本和蛋白量较野生型高,RNAi株系中Oscyp71Z2的蛋白量较野生型低,而转录本却都未检测到。GUS活性实验表明该基因主要在叶片、节、主根和颖片中表达。本研究表明,Oscyp71Z2超量表达株系在孕穗期减少了白叶枯病菌的病斑面积,并抑制了白叶枯病菌在水稻叶片中的定殖。同时,随着植保素合成相关基因的表达量升高,超量表达株系的植保素迅速、大量地积累。进一步分析活性氧清除能力的升高,导致超量表达株系的H202产生受到抑制。另一方面,Oscyp71Z2RNAi株系对白叶枯病菌抗性与野生型没有显着差异,但部分抑制了植保素积累。这些结果表明,Oscyp71Z2可能通过调控植保素和H202生物合成通路从而在水稻白叶枯病菌不亲合互作中起到重要作用。
胡海燕[3]2006年在《水稻苗/穗瘟防卫反应相关基因的分离与鉴定》文中研究说明水稻对稻瘟病的抗性存在较大的差异,一些品种不但具有广谱抗性且具有全生育期抗性,而另一些品种不但对不同病原菌小种的抗性反应不同,而且不同生育期对同一病原菌小种的抗性反应也不同。为了探讨小种特异抗性和生育期特异抗性的分子基础,第一,选用穗期对稻瘟病抗/感反应差异的一对水稻品系,利用抑制消减杂交(SSH),分离水稻对穗瘟防卫反应相关基因;第二,选用一个具有小种特异抗性的水稻品种,分离水稻.稻瘟病非亲和/亲和互作中差异表达的基因,并对筛选到的差异表达基因在不同生育期的表达进行了RT-PCR分析。为了进一步研究差异表达基因的功能,还构建了水稻抗稻瘟病苗期和穗期两个全长cDNA文库。选用遗传背景相近、对叶瘟抗性相同但对穗瘟抗性不同的两个水稻株系,利用SSH构建穗瘟抗/感消减cDNA文库,经差异筛选及序列分析,共获得90个独立的差异表达cDNA克隆。利用RT-PCR分析了26个所筛选到的cDNA克隆在抗/感植株接种后的表达,17个基因的表达差异得到验证。对这些基因在穗期抗/感植株中接种稻瘟菌后的表达谱进行RT-PCR分析,它们在抗/感植株中受稻瘟菌感染后或被诱导或被抑制,但在抗/感植株中被诱导和被抑制所发生的时间以及程度不同。推测Ca~(2+)信号传导途径在水稻防卫穗瘟过程中起着重要的调节作用,以同一水稻品种中156接种不同稻瘟菌小种,通过SSH构建水稻-稻瘟菌非亲和/亲和互作消减cDNA文库,结合差异筛选,经序列测定及RT-PCR分析,共获得25个独立的经验证的差异表达cDNA克隆,并对它们在苗期水稻-稻瘟病菌非亲和/亲和互作早期的表达谱进行了分析,被检测基因在非亲和/亲和互作零点的表达水平相同,而在接种后,它们的表达发生变化,说明所有这些变化都是由于接种引起的;在两种不同的互作反应中,大部分基因的表达变化趋势一致,但存在程度的差异;少数基因表达变化在两种互作中不一致,说明这些表达的变化仅仅与接种的不同小种有关,肯定了所分离到的基因及其表达变化的可靠性。部分基因在穗期受不同稻瘟病菌小种侵染后也发生变化,但变化趋势与苗期有所不同。信息学功能分析表明,苗期和穗期所筛选到的参与水稻稻瘟病防卫反应的基因,都涉及到病原菌或环境胁迫应答、信号传导、转录、蛋白合成与修饰、代谢、转座等生物学功能。本研究表明,无论在穗期或苗期,还是寄主特异或小种特异抗性的防卫反应中,大多数参与水稻对稻瘟病防卫反应的基因在抗病和感病反应过程中都被诱导或被抑制,这些基因可能作为基础抗性基因参与到防卫反应过程中,但由于它们表达发生变化的时间和程度的差异而导致了抗性反应的不同;而少数基因在抗/感反应过程中受病原菌侵染后的表达变化趋势存在较大差异,甚至呈现完全相反的变化趋势,这些基因可能在抗病反应过程中起主要的调节作用。但苗期和穗期对稻瘟病的防卫反应存在一定的差异,因此推测,由于一些参与防卫反应的基因不但受病原菌小种的诱导,而且也受水稻本身生长发育的调节,从而产生了病原菌小种特异抗性和寄主生育期特异抗性。
阮班普[4]2017年在《水稻类病斑基因SPL30的功能研究及温敏型黄绿叶突变体ygl的鉴定》文中研究指明水稻类病斑突变体是指水稻在没有受到生物或者非生物胁迫的情况下自发形成的类似感病坏死病斑的一类突变体。大部分类病斑突变体的抗病性都有所增强,因此该类突变体是研究植物防卫应激反应机制的好材料。本研究通过EMS诱变粳稻品种日本晴获得一个类病斑突变体spl30,经表型分析、基因定位与克隆、抗性鉴定和功能分析等相关工作,主要研究成果如下:1.在大田条件下,类病斑突变体spl130在苗期开始出现小的红褐色坏死斑表型,随着时间的推移,坏死斑的数量越来越多直至布满整个叶片。2.遗传分析表明spl30受一对隐性核基因控制。用图位克隆的方法将SPL30定位于分子标记R8和R9之间的18.9 kb范围内;该区间内具有2个开放阅读框(ORF),然后对这2个ORF进行基因组测序及比对,发现ORF2的第9个外显子发生了 A-T单碱基替换,导致蛋白序列的第343位天冬酰胺转变为络氨酸,来自日本晴的ORF2基因组片段可以恢复突变体的表型;该基因编码一个柠檬酸裂解酶,酶活测定显示,突变体中柠檬酸裂解酶活性显着下降。3.SPL30在水稻的各个组织中均有表达,其中在叶片中表达最高,根部表达最低。4.将pGFP::SPL30载体质粒导入水稻原生质体中,通过共聚焦显微镜观察,发现SPL30蛋白定位于细胞核和细胞质。5.DAB染色实验表明,spl30突变体的病斑叶片中H202大量积累;qRT-PCR表明衰老标记基因SGR、WRKY23、Osh36和Osl57在突变体中表达显着上升;TUNEL实验证明,spl30的叶肉细胞中呈现DNA片段化;以上结果充分说明SPL30的突变能够导致细胞死亡。6.白叶枯抗性鉴定实验表明,spl30突变体对白叶枯病抗性显着增强,防卫相关基因PR1a、POX22.3、PR1b和PBZ1的转录水平显着提升。叶绿素作为植物进行光合作用的主要色素,是评估叶片光合作用能力和光合作用效率的主要指标之一。本研究利用EMS诱变粳稻品种中花11获得了温敏型黄绿叶突变体ygl,经表型分析、基因定位与克隆和功能分析等相关工作,主要研究成果如下:1.ygl突变体在低温条件下表现出黄绿叶,而高温时,黄绿叶表型消失。2.图位克隆和CRISPR/Cas9实验证实了 YGL编码一个镁离子鳌合酶D亚基,是Chl1/YGL7的等位基因。3.qRT-PCR和GUS染色实验表明YGL在水稻的各个组织中均有表达,其中在叶片中表达最高,根部表达最低。4.亚细胞定位发现YGL蛋白位于叶绿体中。5.YGL的突变影响了叶绿素合成和叶绿体发育相关基因的表达。
郝欣[5]2016年在《转hpa1_(Xoo)-N21基因烟草叁种抗病信号通路相关基因研究》文中认为水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo) hpa1Xoo基因编码的Hpa1Xoo蛋白具有其它harpin蛋白所共有的生物活性,能诱导非寄主烟草产生过敏性坏死反应(hypersensitive response, HR),诱导植物抗病、抗虫,促进植物生长。Hpa1Xoo蛋白N-端的卷曲螺旋(coiled-coil, CC)结构域多肽片段N21能激发烟草产生HR,其在烟草体内表达也能赋予烟草的抗病特性。为进一步明确其功能机制,本文通过基因芯片技术测定了转N21基因烟草及其相关基因(hpa1Xoo、AB)烟草的转录组谱,分析了水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)3种抗病信号通路及防卫相关基因表达情况,进而了解N21的抗病作用及其机理。本研究利用烟草基因芯片技术检测转hpa1Xoo、AB、N21基因烟草及其出发亲本烟草(CK)的基因表达谱,研究3种抗病信号通路和防卫相关基因表达情况。以2倍表达差异为标准(ratio大于2或小于0.5),转hpa1Xoo基因烟草和CK相比,共有4528个差异表达基因,其中上调表达的有2237个,下调的有2291个基因；转AB基因烟草和CK比较,上调表达基因1261个,下调有999个基因；转N21基因烟草和CK比较,上调表达基因有1204个,下调的有1462个；转hpa1Xoo和N21烟草相比,共有4273个差异表达基因,其中2330个上调表达,1943个下调表达；转AB和N21烟草相比,共有3280个差异表达基因,其中上调表达基因1442个,下调1838个；转hpa1Xoo和AB烟草相比,共有1822个差异表达基因,其中上调1017个,下调805个。这些差异表达基因主要涉及植物应激反应、生长发育、脂类代谢、光合系统以及水杨酸、茉莉酸和乙烯3种抗病信号通路和防卫反应。进一步分析发现(1)转N21烟草JA信号通路相关的差异表达基因有7个,分别是AT3G28910、AT2G46370、AT3G09600、AT4G35770、AT4G09460、AT2G40000和 AT5G44030,均为下调表达。其中AT4G35770即SEN1,与衰老、茉莉酸和伤口反应相关,同时也参与氧化应激反应。(2)SA信号通路的差异表达基因有AT1G28380、AT4G09460、 AT2G40000、AT5G42950、AT4G05320、ATIG13740、AT1G64160、AT5G48930和AT4G27430。除AT5G48930和AT4G27430上调表达外,其余均为下调表达。ATlG28380是编码坏死斑病变蛋白基因NSL1,与负调控水杨酸相关防卫反应和细胞死亡程序相关；AT4G05320是UBQ1O(聚泛素10)基因,编码高度保守的含76个氨基酸的泛素蛋白。SA能够诱导UBQ10的表达,但不依赖于SA诱导的NPR1。(3) AT2G46370、AT3G28910、 AT3G09600、AT5G25190、AT2G40000和AT5G44030均与ET信号通路相关,且均为下调表达。如AT5G25190是一种乙烯应答转录因子ERF003,编码ERF/AP2转录因子家族ERF(乙烯应答因子)亚族B-6中的一员。(4)还有部分防卫反应基因,如AT1G58848、AT5G48930和AT1G72870分别与细胞凋亡和PCD以及木质素合成相关,AT1G58848为上调表达,编码一种抗病蛋白RDL6/RF9。AT5G48930上调表达,不仅参与黄酮类生物合成,还与木质素生物合成相关,与奎尼酸羟化肉桂酰基转移酶(HCT)几乎完全相同。HCT受多种非生物胁迫因子处理高度诱导表达,包括机械伤害、H2O2、冷胁迫、ABA、SA和干旱。AT1G72870编码TIR-NBS类抗病蛋白。许多差异表达基因参与2种以上的信号通路。AT2G46370与AT4G09460与JA信号通路相关,AT2G46370还参与ET信号通路,AT4G09460也参与了SA信号通路。另外,AT3G28910、AT3G09600、AT2G40000和AT5G44030与3种信号通路均相关。AT2G46370编码一种茉莉酸氨基合酶JAR1,能够催化活性茉莉酸-异亮氨酸(JA-Ile)缀合物的形成,JA-Ile能促进茉莉酸信号途径中JAZ1和COI1的互作,COI1可以与Cullin、Skp结合而形成一个E3泛素链接酶,从而介导JA信号的传递。JAR1同样也在ET信号途径中起重要作用。AT4G09460是转录抑制子MYB6,作用于细胞核,能够对JA和SA作出反应。AT3G28910是一种myb域蛋白myb30,与植物过敏性和植物对SA、JA和ET的反应相关。AT3G09600具有序列特异性DNA绑定转录因子活性,不仅与3种信号通路相关,同时还与植物对脱落酸、赤霉素和生长素的反应相关。AT2G40000编码类线虫抗性蛋白HSPR02,其正调控基础防卫反应,作用于SA下游,并且能够通过JA和ET信号对其进行负调控。AT5G44030编码与次生细胞壁生物合成相关的纤维素合酶CESA4,参与植物对真菌和细菌的抗性,与JA、SA和ET信号通路均相关。以在真核生物中高度保守并且组成型表达的EF-1α基因为内参,qRT-PCR验证了转入的hpa1Xoo-N21基因在转录水平上启动的3种抗病信号通路和抗病防卫反应相关基因的表达情况。结果表明,在转基因烟草植株中可检测到SA, JA和ET 3种抗病信号通路相关基因如AT2G46370、AT3G09600和AT5G25190等的表达,同时也能检测到其它重要的防卫反应相关基因AT1G58848、AT5G48930和AT1G72870的表达,与基因芯片分析结果基本一致。
缪卫国[6]2009年在《转hpa1_（Xoo）基因棉花抗病虫防卫反应与全基因组转录谱分析及棉花角斑病菌hpa_（Xm）基因的功能》文中研究说明棉花是世界上重要的纤维作物,也是重要的油料来源。在许多植棉国家,棉花黄萎病、枯萎病是危害棉花的两大病害。从1993年以来,黄萎病在我国严重发生,发病面积占全国植棉面积的50%左右,每年损失皮棉约10万吨。目前尚无有效的方法控制该类病害的危害。通过植物基因工程,可以把优良抗性基因转移到植物体内,对植物进行定向改造,从而培育新的优良抗病品种,为棉花黄、枯萎病的有效防治开辟了新的防治途径。已经证明harpin是一类蛋白激发子,具有无毒、无公害和对环境友好等优点。先前研究表明喷施harpin能增强植物抗病、抗虫性,而内源表达harpin显示转基因植物(水稻、烟草、梨等)能抗多种病害。由此,通过基因工程方法将harpin编码基因hrp导入重要的经济作物棉花中,是否会使棉花获得各种抗性及其它有益表型呢?此外,harpin在分子水平上的作用机理和作用位点还不是很清楚,尤其在无胁迫下内源表达的harpin对植物的防卫、生长发育会产生怎样的影响?本研究将来自水稻白叶枯病菌的hpa1xoo基因转入棉花,使harpin的多种功能在棉花中得以表达,获得抗棉花黄、枯萎病等多种有益表型的转基因棉花株系,并力图解析harpin对植物的作用机理；与此同时,我们还从棉花角斑病菌(X. citri subsp. malvacearum)基因组中克隆了编码harpin的hpaXm基因。现将结果分述如下：利用含有农杆菌T-DNA区的重组质粒,结合花粉管通道技术,将hpa1xoo基因分别转化陆地棉品种中棉35(Z35)、海岛棉品种新海21等棉花品种,通过苗期的卡那霉素或除草剂筛选并结合室内和病圃枯萎病和黄萎病抗性单株筛选,获得了30份转基因材料。在卡那抗性植株筛选基础上,大部分转基因植株符合孟德尔遗传规律,即后代存在3：1或者1：3的分离。部分转基因株系到T6代就具有100%的纯合株系(如T-34部分单株株系后代)。同时采用农杆菌茎尖介导法,也获得携带有hpa1xoo基因的转基因植株。选择部分转基因植株进行加代选育,在棉花黄、枯萎病病圃进行了抗病性、农艺性状评价,以及采用生测法评价转基因植株的抗虫性。供试转基因材料中,针对棉花黄萎病,获得了抗病材料(系)8个,耐病材料(系)8个,病指范围在13.75%-38.49%,转基因材料病指均低于出发品种(Z35),Z35病指为45.34%。与Z35相比,转基因棉黄萎病平均发病率减少42.9%,病指减少7.35%-26.22%；枯萎病病指减少52.46%-59.02%；立枯病病指减少58.70%-59.24%。在抗虫性调查的初步结果中,部分转基因材料(如T-3、T-34)对棉铃虫表现出较好的抗性。饲喂T-34棉叶的棉铃虫发育明显迟缓,直至死亡,5天后棉铃虫死亡率为90.95%,而饲喂Z35棉叶的棉铃虫死亡率为12.20%。这些结果表明harpinxoo的表达赋予转hpa1xoo基因棉花抗病虫性。转基因抗病材料的棉铃有大、有小。生长前期,转基因植株的株高一般低于出发品种,但开花以后至成熟,转基因材料的生长逐渐与出发品种接近,与出发品种无显着性差异。转基因棉花生育期为120-121天,长于Z35(116天)。部分转基因材料在农艺性状方面优于Z35,如转基因株系T-33,在棉花吐絮期(2007),与Z35相比,无效枝数低了0.12个,有效桃数多了0.1个；转基因株系T-34果枝数比对照Z35多了0.1个。部分转基因材料田间吐絮较畅,纤维品质有所改善。2006年通过农业部棉花纤维检测中心检测,转基因材料T-33的纤维上半部平均长度为29.0mm,对照Z35的纤维长度为28.8mm；纤维整齐度方面,所有转基因材料(85%)都高于出发品种(83%)；马克隆值方面,所有的转基因材料为B级,对照Z35为C级。转基因株系T-34纤维伸长率为5.8%,而对照(Z35)的纤维伸长率为5.5%。因此,综合诸多性状,我们选择转基因植株T-34(或T-33)作为本研究的主要对象。从PCR扩增到目的基因(hpalxoo)的阳性植株中选择了T-34和T-33,作进一步的分子鉴定。PCR Southern blot和基因组Southern blot确定了hpalxoo已经整合到棉花基因组中,且具有至少3个拷贝,提取PCR检测均为阳性的植株的可溶性蛋白,进行了Western blot分析,在PCR阳性植株中可检测到harpinxoo蛋白的表达。RT-PCR结果同样证实了hpa1xoo在转录水平的表达。采用免疫胶体金定位技术,观察到harpinxoo免疫金颗粒主要分布在植物的细胞壁上,胶体金颗粒在转基因植物细胞壁上呈10-20粒簇状特异性分布,在叶绿体或线粒体上则未见到特异性吸附,这个结果说明harpinxoo在转基因棉花中作用位点是细胞壁。同时,采用PCR和Bt蛋白检测试纸条方法检测转基因材料中是否含有Bt基因及其编码蛋白,结果表明供检测的转hpa1xoo基因棉花对棉铃虫的抗性是由于取食表达harpinxoo 6勺植株引起的,而与Bt基因无关。表达harpinxoo转基因棉花材料T-34在田间和室内均对棉花黄萎病表现出较好的抗性,因此,我们进一步从细胞和分子水平上验证T-34对棉花黄萎病菌的抗性机理。通过T-34悬浮细胞与棉花黄萎病菌分生孢子共培养,转基因棉花T-34的悬浮细胞的生存能力显着高于其出发品种Z35。在无病原菌侵染时,T-34叶片的H202积累高于Z35,但未观察到肉眼可见的氧爆发(reactive oxygen intermediates, ROI)现象,说明T-34较Z35更易处于一种引发状态(Priming state),一旦遭到病原菌侵染,T-34叶片中的过氧化氢酶受到抑制,在T-34叶组织中可以观察到明显的氧爆发和微过敏(Micro HR)现象,H202含量也有较高的积累,并呈现病原菌与植物非亲和互作的双峰典型特征,而在Z35叶组织中没有观察到氧爆发和微过敏。与这种现象一致,通过Real Time-PCR检测,氧爆发和微过敏的标志基因ghAOXl、hsr203J及hinl等基因的相对表达量也显着高于出发品种。这些结果证明了,由于harpinxoo在转基因植物体中的表达,激活了植株对病原菌攻击的防卫反应,harpinxoo是植物与病原菌非亲合互作中必要的激发子。Harpin赋予转基因棉花多种抗性和多个有益的农艺性状表型,但是在无胁迫下harpin影响植株的分子模式还不清楚。为此我们使用棉花12K cDNA芯片,采用生物芯片技术,分析了harpinxoo转基因棉花(T-34)与其出发品种(Z35)的全基因组转录谱,从而使我们能够广泛理解harpinxoo是如何在转基因棉花中调控基因表达的。结果显示,与Z35相比,在T-34叶片中存在530个差异表达基因。这些差异表达基因中很多基因涉及过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death, HCD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)、水杨酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、生长素(auxin)、脱落酸(abscisic acid)和乙烯(ethylene, ET)等基本防卫反应途径。在转基因棉花中,Harpinxoo作为内源激发子,与受体作用或者直接作用于一些蛋白激酶,造成编码NADPH氧化酶、NAD泛素氧化还原酶、离子通道蛋白(如CLC-C)钙结合蛋白、苯丙氨酸裂解酶(PAL2)、植保素合成酶(如CHS)、MAPK激酶等蛋白酶的基因上调表达,并通过乙烯或生长素转录因子(如ERF、ARF)等进一步激活下游防卫和生长发育有关的反应。Harpinxoo在转基因棉花中调控生长素相关基因的表达符合生长素信号途径；同时,在LRR-PRKs途径中多个激酶编码基因的表达,表明LRR-PRKs在harpinxoo诱导的信号传导中也担任重要角色。通过对芯片上9个防卫相关基因采用定量或半定量PCR验证,显示芯片数据具有88.98%的可信度。经Realtime PCR检测,病原菌侵染后,6个防卫相关基因在转基因植株中超表达。这个结果进一步说明在无胁迫下harpinxoo的表达赋予转基因棉防卫水平高于其受体,并保持着基本的防卫水平,但在遭受病原菌胁迫下,harpinxoo的表达具有增强转hpalxoo基因棉防卫水平的能力。同时,差异表达基因中的共性上调和下调表达以及涉及能量产生和消耗途径的基因表达水平的提高,这些结果意味着在无胁迫下转基因植物体中维持着一种能量平衡,仅仅当病原菌侵染时才在植物体中产生高能量的需求。用转hpa1xoo基因棉花新鲜叶片饲喂棉铃虫,造成棉铃虫发育明显迟缓。为了更好地解析这一现象,将转基因棉花T-34和出发品种Z35叶片分别饲喂棉铃虫,提取棉铃虫幼虫RNA,利用和棉铃虫同属鳞翅目的家蚕的23K寡核苷酸(Oligo)探针,通过生物芯片技术,制作了其Oligo表达谱芯片。芯片结果显示检测到了2927个基因,T-34对Z35在转录水平上存在有872个差异表达基因,其中Ratio值大于2.0的上调表达基因有328个,Ratio值小于0.5的下调表达基因有544个。872个差异表达基因主要涉及13种生物功能,96个通路(pathway)。棉铃虫取食表达Harpinxoo的棉花叶片后,激发棉铃虫体内编码蛋白水解酶、细胞色素P450等的基因超表达,打破了离子调节体系和渗透压平衡体系,消耗棉铃虫的大量ATP,从而影响棉铃虫蛋白酶分解和合成、ATP合成等多个生物途径的正常代谢,造成棉铃虫不能很好取食。因此,采用芯片技术,通过异源家蚕oligo芯片信息的比对,初步解析了转hpalxoo棉花对棉铃虫的抗性机理,可能与棉铃虫取食后正常代谢受到干扰,影响发育有关。本研究结果为hpa1xoo,作为新的基因资源用于抗棉铃虫育种提供了初步证据,并为抗棉铃虫机理研究展示了新的途径。Xanthomonas campestris pv. malvacearum (E.F. Smith) Dye (Xcm)是引起棉花角斑病的病原。2006年该病菌学名更名为X. citri subsp. malvacearum nov. comb. nov. nom. nov. (Xcm)。在Xanthomonas中一些编码harpin的基因已经被克隆,但在Xcm中尚未有该基因克隆的报道。本研究首次报道了编码harpin like protein的hpaXm基因。用PCR技术从Xcm基因组中扩增了hpaXm基因。该基因具有402bp,其编码的蛋白为HpaXm,含有133个氨基酸,大小为13.3kD,GC含量为60.70%,富含甘氨酸,含量为21.80%,缺乏半胱氨酸。HpaXm的GST融合蛋白表达的最佳条件是IPTG0.05mM、37℃3h。纯化的HpaXm具有热稳定性,煮沸或未煮沸处理的HpaXm都能在烟草上激发HR.HpaXm能够增强烟草对TMV的抗病性,也能激发nprl、hsr203Jpr-la、pr-1b等防卫基因的表达。在Xcm基因组中,采用TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR)方法,在hpaXm左翼扩增到了与X. oryzae pv. oryzae中hrcC基因具有93%同源性的1826bp序列,命名为hrcCXm,但在hrcCXm与hpaXm之间有704bp的间隔序列；在hpaXm右翼,扩增得到了与X. oryzae pv. oryzae中hpa2基因具有89%同源性的630bp序列,命名为助a2Xm。在HpaXm蛋白序列中存在有两个Alpha helix区域。HpaXm可能拥有Coiled coil区域及亮氨酸拉链。通过完整地氨基酸序列及N端a-helix中13个保守的残基(H2N-SEKQLDQLLTQLI-COOH)进化树分析,HpaXm与HpaGXac、HpaXac进化关系要比与Hpa1Xoo和Hpa1Xoc更近。我们对HpaXm N端α-helix区域中含有两个heptad的多肽(39-LDQLLTQ-LIMALLQ-52)进行合成,生物活性测定表明其能在烟草上诱导HR；改变相应残基的该多肽衍生物HpaXmAT44C和HpaXmAM48Q,显示出HR活性减弱的表型。通过信号肽软件预测和GST检测实验,在HpaXm的N端可能具有潜在的信号肽,可能以sec-dependent pathway必出胞外。
王冰林[7]2005年在《马铃薯晚疫病水平抗性相关基因诱导表达谱及水平抗性机制初探》文中研究说明马铃薯(Solanum tuberosum L.)是国际上第四大粮食作物。由致病疫霉菌(Phytophthora infestans)引起的晚疫病是世界农业生产中最具破坏性的植物病害之一，在世界各地广为流行，晚疫病防治一直为国际社会所关注。由于水平抗性是由微效多基因控制的非小种专化抗性，抗性较为持久、稳定，所以选育广谱、持久的水平抗性品种已成为马铃薯晚疫病抗性育种的必然趋势。目前，研究人员已开展了水平抗性相关的数量性状位点(QTL)的定位以及差异表达基因分离、鉴定等工作，但这些基因在晚疫病菌侵染期间的动力学表达模式、参与的防卫代谢途径和调控机制以及水平抗性信号传导网络尚不清楚。为此，本研究应用cDNA微阵列技术，综合分析了1009条马铃薯晚疫病水平抗性相关的表达序列标签(ESTs)在晚疫病菌和不同非生物因子处理下的动态表达模式，并比较了这些ESTs在不同抗性马铃薯品种(系)中的表达差异，旨在揭示晚疫病水平抗性的分子基础，为有效利用水平抗性提供理论依据与技术策略。主要研究结果如下： (1) 以水平抗性马铃薯品系(QR；CIP Code：386209.10)叶片为材料，全面分析了1009条ESTs在晚疫病菌侵染过程中的动态表达模式。以每个样点在接种与对照样品中的杂交信号比值>2.2为标准，筛选出669个显着差异表达ESTs，经测序、比对、合并重复类型后，共得到348个代表不同基因的非重复序列片段(Singleton EST)，其中234个与已知功能基因(或ESTs)具有显着序列相似性，而其它114个则被暂定为未知功能ESTs(约占32.8％)。234个已知功能ESTs分属于13个功能类别，即细胞防御、初级代谢、次级代谢、能量代谢、信号传导、转录调控、蛋白质合成、蛋白质降解、细胞运输、细胞结构、结合功能蛋白、系统性反应和发育。根据鉴定基因的病原诱导表达模式，可将马铃薯对晚疫病菌的防卫过程大致区分为叁个明显时期，从而在分子水平上初步揭示了晚疫病菌侵染马铃薯叶片的自然过程，并预测了这些事件发生的时间顺序以及参与每个阶段的基因。这些基因的病原诱导表达谱可作为马铃薯防御机制深入研究的重要平台，并可为确定晚疫病水平抗性候选基因及其参与的防御路径、调控机制等研究提供线索。 (2) 在上述348个晚疫病抗性相关基因中，包括98个代谢相关基因。根据这些基因在晚疫病菌侵染后的动态表达模式，初步推断，共有11条代谢途径可被晚疫病菌诱导激活，即莽草酸途径、苯丙烷类途径、氧合脂类途径、多胺合成与降解途径、生物碱合成途径、乙烯(ET)合成途径、糖酵解途径、类异戊二烯途径、磷酸戊糖途径、叁羧酸循环和乙醛酸循环途径。这些代谢相关基因各自具有的特异性诱导表达模式暗示了上述途径可能在相互联系、彼此协调的代谢网络中发挥作用，从而共同参与了马铃薯抵御晚疫病菌侵染过程。位于上游的糖酵解和莽草酸途径对于满足下游的叁羧酸循环、类异戊二烯、生物碱合成和苯丙烷类等代谢途径所需的底
韩庆典[8]2008年在《水稻细菌性条斑病抗性QTL qBlsr5a的精细定位及候选基因的表达分析》文中研究说明水稻细菌性条斑病(Xanthomonas campestris pv.Oryzicola),简称水稻细条病,是水稻上一种重要的检疫性细菌病害。该病主要危害水稻叶片,水稻受侵染后,叶片变黄甚至枯死,空秕粒增多,千粒重降低,一般可减产10%～20%,严重时达40%。目前,细条病已成为南方稻区的主要病害,成为影响水稻产量及品质的重要限制因子。相对于水稻另两大病害(白叶枯病和稻瘟病),水稻对细条病的抗性属于典型的数量性状,不存在主基因抗性,现有种质资源中也未发现对该病表现免疫的品种。因此,深入挖掘现有资源中的数量抗性基因座(Quantitative resistance locus,QRL),不仅具有重要的实践应用价值,而且可以对数量抗病性的机制研究提供帮助。目前,在水稻中已报道13个细条病抗性QTL,其中Tang等以高抗细条病品种Acc8558和高感细条病品种H359为亲本构建的重组自交系群体,定位了11个细条病抗性QTL,其中位于5号染色体短臂上的QTL qBlsr5a(其抗病等位基因来自抗病亲本Acc8558)对表型变异贡献率最大,并在后续研究中得到了证实。这说明qBlsr5a在水稻细条病抗性的遗传改良上具有较大的应用前景。本研究在前人工作的基础上,对qBlsr5a进行更深入的研究。分别以Acc8558和H359为供体亲本和受体亲本,通过回交和分子标记辅助选择,育成了只渗入供体5号染色体短臂含抗性QTL qBlsr5a的区段的近等基因系H359-BLSR5a。进一步将该近等基因系与H359杂交,建立了一个大的F2群体(2,265单株)。采用选择极端表型个体并验证其后代(F_(2:3))株系的方法,在F_2群体中鉴定出目标QTL为抗病纯合基因型的个体。通过对这些个体进行分子标记基因型检测和连锁分析,将qBlsr5a定位在SSR标记RMl53和RM159之间,大约2.4 cM或290 kb的范围内。利用Affymetrix的基因芯片对抗病品种Acc8558和感病品种H359中受细条病菌侵染调控的基因进行高通量的检测。在两品种中共检测到956个差异表达基因,其中12个基因在两品种中一致上调,54个基因在两品种中一致下调,20个基因在两品种中表达变化方向相反。对差异表达基因的基因本性(GO)、代谢路径和启动子进行了分析。比较所有差异基因与已报道的13个抗性QTL的位置关系,发现有30个差异表达基因的位置与这些抗性QTL吻合,但在qBlsr5a的定位区间(290 kb)内只检测到一个差异表达基因(LOC Os05g01330),且功能未知。在水稻Gramene(http://www.gramene.org/Oryza_sativa_japonica/contigview)及TIGR(http://www.tigr.org/tdb/e2kl/osal/GO.retrieval.shtml)数据库中查询,发现qBlsr5a的精细定位区间(290 kb)内共有51个预测基因,其中33个(64.7%)有功能注释。根据这些功能注释,我们选择了19个预测基因(包括那个基因芯片检测到的差异表达基因)进行表达分析,其中3个预测编码多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白前体(PGIP);1个编码锚蛋白1(ankyrin-1);1个编码转录因子ⅡAγ基(TFⅡAγ);1个编码与K蛋白1互作的锌指蛋白(ZIK1);还有2个含锌指结构。以H359和H359-BLSR5a为材料,在病原菌接种后的不同时期对这19个基因进行半定量RT-PCR分析。结果表明,有4个预测基因在两品系中都没有表达,7个预测基因在两品系中在病菌侵染前后表达都没有变化,其余8个预测基因对病原菌侵染有反应。其中6个基因的表达趋势在两品种中基本一致(5个表达上调,1个表达下调)。1个基因(LOC_Os05g01380)在H359中接种前后没有变化,但在近等基因系H359-BLSR5a中接种6h时表达量开始增强,到24h时表达量达最到高。最令人感兴趣的是预测基因LOC_Os05g01444,它在H359中没有表达,而在H359-BLSR5a中被诱导表达,且在接种6h时表达量达到最高。该基因编码区长度为1,206 bp,无内含子,预测编码多聚半乳糖醛酸酶抑制前体蛋白(PGIP),已知PGIP参与植物的多种抗病反应。因此看来,该基因是qBlsr5a的一个重要的候选基因。
张磊[9]2011年在《转hrfl基因水稻耐旱性及其转录谱分析》文中提出干旱是粮食生产和粮食安全面临的最严重的影响因素,在缺乏农业用水的地区尤其如此。据估计,中国每年由于干旱造成的国民经济损失高达250亿美元。全球变暖和干旱发生频率的增加,使形势更加严峻。从1981年到2002年,小麦、玉米和大麦这叁种作物每年由于干旱造成的产量损失达四千万吨,价值50亿美元。水稻是世界上最重要的粮食作物,很多人以大米为生,大米是他们的直接能量来源。据估计,水稻生产耗费了中国总用水量的大约一半。然而,干旱胁迫仍然是水稻生长最严重的制约因素,最主要是由于降水模式的年际变化和水稻生长季节降水量分布不均造成的。总之,面临全球的水资源短缺,除了改善灌溉措施外,提高作物耐旱性在提高作物产量上也具有巨大的潜力。植物病原革兰氏阴性细菌叁型泌出通道(Type III protein secretion system, TTSS)分泌的Harpin能普遍地激发病原菌在寄主植物上的毒性,诱导在非寄主植物上的过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death, HCD),并激发多种植物反应。外源喷施Harpin能够激发SA,诱导植物SAR,也能激发JA、ET介导的防卫反应通路。Harpin编码基因的超表达增强了烟草、水稻、油菜和棉花等作物的抗病性。Erwinia amylovora分泌的Harpin蛋白HrpNEa激活ABI2依赖的ABA信号通路,诱导拟南芥的耐旱性。然而,至今仍不知道内源表达Harpin编码基因是否也能增强植物耐旱性。邵等(2008)曾报道,超表达Harpin编码基因hrf1增强了水稻对稻瘟病的非小种特异性抗性。本研究证实,异源表达Harpin编码基因hrf1能激发水稻ABA信号通路,增强水稻植物耐旱性。内源表达hrf1诱导水稻植株ABA浓度的升高,促进气孔关闭。转基因系的保水能力显着增强,脯氨酸和可溶性糖水平显着升高,抗氧化胁迫和清除活性氧的能力显着增强,OsLEA3-1、OsP5CS、Mn-SOD和NM_001074345等四个干旱相关基因在干旱条件下的表达水平比对照明显上升。这些结果证明,hrf1基因赋予了转基因系对干旱的抗性,表明Harpin蛋白为农作物耐旱性改良提供了新的契机。本研究采用57k水稻cDNA芯片分析了超表达hrf1基因水稻植株NJH12的表达谱,共找到了225个差异表达基因,其中包括多个与抗病性和耐旱性相关的基因,如防卫反应相关基因、抗逆信号传导相关基因、细胞程序性死亡相关基因等。另外,在NJH12的表达谱中,还有一些富含亮氨酸的蛋白激酶和MAPK等受体蛋白激酶编码基因和能量代谢相关基因的表达量也出现了上调。通过对这些差异表达基因的分析发现,异源表达hrf1基因在水稻中调控的耐旱性通路和抗病性通路可能存在交叉调控。
徐秋芳[10]2009年在《番茄Cf-4和Cf-9基因介导的过敏性反应调控基因的筛选和鉴定》文中指出番茄(Solanum lycopersicum)与叶霉病菌(Cladosporium fulvum)互作符合基因对基因假说，是研究植物与病原互作的模式系统。番茄抗C．fulvum基因(Cf)和叶霉菌的无毒基因(Avr)产物识别后激活下游抗病信号传导，活化各类防卫反应基因的表达，最终表现抗病性。目前对Cf下游信号传导途径的了解还很肤浅。本研究联合采用蛋白质组学分析技术和快速反向遗传学基因功能分析技术——病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)，筛选和鉴定番茄Cf-4和Cf-9介导的过敏性反应调控基因，获得了以下主要研究结果：(1)建立了一套适于番茄子叶总蛋白分离的双向电泳分析技术体系。通过对双向电泳中几个重要因素，包括上样量、IPG胶条选择、上样方式、聚焦条件等的优化，总结出可以获得高分辨率、高重复性结果的双向电泳操作体系：使用TCA／丙酮沉淀方法提取番茄子叶总蛋白，采用24cm pH3-7NL的IPG胶条，水化上样，300μg的上样量，低电压除盐后8000v 56000～68000vhs进行等电聚焦。(2)开展了番茄抗叶霉病蛋白质组学分析。通过双向电泳分析，分别获取了Cf-4(HR~-)、Avr4／Cf-4(HR~+)、Cf-9(HR~-)及Avr9／Cf-9(HR~+)基因型番茄苗的蛋白质组图谱。对四种基因型番茄的蛋白质组图谱的比较分析结果表明，66个蛋白在Cf-4(HR~-)与Avr4／Cf-4(HR~+)基因型番茄苗中差异表达，其中59个蛋白在Avr4／Cf-4基因型番茄苗(HR~+)中表达量上调，7个下调；71个蛋白在Cf-9(HR~-)与Avr9／Cf-9(HR~+)基因型番茄苗中差异表达，其中59个蛋白在Avr9／Cf-9基因型番茄苗(HR~+)中表达量上调，12个下调。Avr9／Cf-9和Avr4／Cf-4这两个互作中均差异表达的蛋白有43个，其中39个在Avr9／Cf-9(HR+)和Avr4／Cf-4(HR~+)基因型番茄苗中表达上调，4个表达下调。同时分离得到仅在Avr9／Cf-9(HR~+)和仅在Avr4／Cf-4(HR~+)基因型番茄苗中差异表达蛋白，分别为23个和28个。差异表达蛋白点切取后进行MALDI-TOF-MS和MALDI-TOF／TOF-MS质谱分析和数据库检索分析，65个蛋白得到成功鉴定。这些差异表达蛋白功能主要涉及防卫反应、信号传导、代谢、蛋白合成、转录调控和光合作用等方面。(3)采用VIGS技术分析了19个差异表达蛋白对应基因的抗病功能。对差异表达蛋白的序列进行了分析，65个蛋白编码基因中的19个可以在本氏烟或烟草序列数据库中搜索到氨基酸序列一致率68％以上或编码的核酸序列一致率80％以上的同源基因。选取这19个本氏烟或烟草同源基因作为沉默的靶标基因，对其在抗病性中的作用进行了检测分析。采用RT-PCR扩增克隆目的基因片段，并亚克隆至烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)基因沉默载体，在本氏烟上进行TRV诱导的VIGS分析，检测沉默植株的抗病性表现。发现蛋白酶体20Sβ亚基、内质网网眼结合蛋白(Luminal-binding protein 5，BiP5)、细胞分化蛋白酶ftsH同源物(Cell divisionprotease ftsH homolog)、促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase1，MAPK1)、天冬酰胺合成酶(Asparagine synthetase，AS)、ASR4(Abscissic acid，Stress，Ripening)、叶绿体噻唑生物合成蛋白(Chloroplast thiazole biosynthetic protein)等7个基因沉默后植株表现出坏死、矮化、叶片和花器发育畸形等症状。AS、Pip1(phytophthora-inhibited protease 1)、MAPK1、Lemir((?)Lycopersicum (?)sculentum(?)aculin)等4个基因的沉默显着减弱了Cf-4／Avr4和Cf-9／Avr9介导的HR，表明这4个基因对Cf介导的HR起重要调控作用。(4)采用VIGS技术分析了56个ACE(Avr／Cf elicited)基因的抗病功能。对56个ACE基因在本氏烟上进行TRV介导的VIGS分析，其中编码脂转运蛋白、病程相关蛋白、细胞色素P450 76A2、细胞色素P450 72A1、60S核糖体蛋白L10、bZIP转录调控因子BZI-2、激酶互作蛋白及一个未知功能蛋白的8个ACE基因沉默显着减轻了Cf-4／Avr4和Cf-9／Avr9介导的HR，表明这些基因可能在Cf-4和Cf-9介导的HR中起重要调控作用。(5)采用VIGS技术分析了8个泛素介导的蛋白降解途径基因及2个钙离子信号途径基因对Cf介导HR的调控作用。结果表明1个泛素融合降解蛋白(Ubiquitinfusion degradation protein)和2个钙离子结合蛋白(Calcium-binding protein)在Cf-4和Cf-9介导的HR中起作用。综上所述，本研究采用蛋白质组学方法鉴定获取了Cf-4和Cf-9介导HR产生与否差异表达蛋白，并通过VIGS方法分析了蛋白质组水平和转录组水平的差异表达基因在Cf-4／Avr4和Cf-9／Avr9介导的HR中的作用，获取了一批番茄叶霉病菌抗性调控基因。同时，这些研究结果表明结合蛋白质组学分析和VIGS技术分析的体系是筛选和鉴定植物抗病调控基因的有效技术体系，为其它功能基因的筛选和鉴定提供了借鉴。此外，研究结果增进了对番茄叶霉病抗性分子机理的理解，并为番茄叶霉病抗性品种的分子培育提供有利基因资源。
参考文献：
[1]. 水稻防卫反应基因P450 CYP72A基因簇和调控因子SGT1的研究[D]. 王亚玲. 东北农业大学. 2003
[2]. 转hrf1基因水稻抗白叶枯病机理研究及水稻抗病相关基因Oscyp71Z2的功能分析[D]. 李文奇. 南京农业大学. 2012
[3]. 水稻苗/穗瘟防卫反应相关基因的分离与鉴定[D]. 胡海燕. 中国农业科学院. 2006
[4]. 水稻类病斑基因SPL30的功能研究及温敏型黄绿叶突变体ygl的鉴定[D]. 阮班普. 沈阳农业大学. 2017
[5]. 转hpa1_(Xoo)-N21基因烟草叁种抗病信号通路相关基因研究[D]. 郝欣. 扬州大学. 2016
[6]. 转hpa1_（Xoo）基因棉花抗病虫防卫反应与全基因组转录谱分析及棉花角斑病菌hpa_（Xm）基因的功能[D]. 缪卫国. 南京农业大学. 2009
[7]. 马铃薯晚疫病水平抗性相关基因诱导表达谱及水平抗性机制初探[D]. 王冰林. 华中农业大学. 2005
[8]. 水稻细菌性条斑病抗性QTL qBlsr5a的精细定位及候选基因的表达分析[D]. 韩庆典. 福建农林大学. 2008
[9]. 转hrfl基因水稻耐旱性及其转录谱分析[D]. 张磊. 南京农业大学. 2011
[10]. 番茄Cf-4和Cf-9基因介导的过敏性反应调控基因的筛选和鉴定[D]. 徐秋芳. 浙江大学. 2009
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