(广西锦莹药业有限公司 广西南宁 530219)
【摘要】目的:探讨对通脉颗粒微生物限度检查法验证。方法:建立通脉颗粒的微生物限度检验方法。采用常规法对样品进行方法验证。结果:五种规定试验菌的回收率均不低于70%,可用于通脉颗粒的微生物限度检验。结论:确定采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌检查。
【关键词】通脉颗粒;微生物限度检查;方法验证。
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231(2016)07-0229-02
通脉颗粒具有活血通脉。用于缺血性心脑血管疾病,动脉硬化,脑血栓,脑缺血,冠心病,心绞痛。含有丹参、川芎、葛根等中药成分。根据其制剂用药途径和制法,细菌数、霉菌和酵母菌数的测定、及控制菌——大肠埃希菌检查。经实验研究,确定采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌检查。经对所确定的方法进行验证,符合《中国药典》2010年版《中国药典》一部附录ⅧC有关微生物限度检查法有关规定,方法可行。
1.实验仪器、试药
1.1 实验菌种
枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、大肠埃希菌CMCC(B)44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003。由中国医学微生物菌种保藏管理中心提供。
1.2 样品
通脉颗粒(批号:130101、130501、130601)生产厂家:广西锦莹药业有限公司
1.3 培养基及稀释剂
营养琼脂培养基,玫瑰红钠琼脂培养基,营养肉汤培养基,胆盐乳糖培养基(BL),改良马丁培养基,MUG培养基,曙红亚甲蓝琼脂培养基,pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液,0.9%无菌氯化钠溶液等。
1.4 仪器
培养箱、冰箱、微波炉、生物安全柜、高压蒸汽灭菌器等。
2.细菌数、霉菌和酵母菌数测定方法的建立及验证
2.1 菌液制备
取经35℃培养18~24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液,备用;取经25℃培养24~48h的白色念珠菌液体培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液,备用;取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物,加10ml 0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子,吸取菌液用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液,备用。
2.2 供试液的制备方法
常规法:取样品10g,用pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液制成1∶10的供试液;取1∶10的供试液1ml注皿。
2.3 回收率试验
试验组:同2.2,另分别取各试验菌50~100CFU,分别注入同一平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度,细菌培养24~48h,白色念珠菌和黑曲霉培养48~72h。
菌液组:取试验菌50~100CFU注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度,细菌培养24~48h,白色念珠菌和黑曲霉培养48~72h,测定所加入的试验菌数,平行制备2个平皿。
供试品对照组:同2.2,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度,细菌培养24~48h,霉菌和酵母菌培养48~72h,测定供试品本底菌数。
2.4 方法的确定
选用金黄色葡萄球菌、白色念珠菌作为敏感菌株进行预试验,结果:金黄色葡萄球菌回收率为93%,白色念珠菌回收率为86%,表明通脉颗粒对细菌、真菌没有抑制作用,采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数测定可行。pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液作为稀释剂无抑菌作用,对实验无干扰。
2.5 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证
取3个批号通脉颗粒样品,细菌数、霉菌及酵母菌数按常规法进行加菌回收率试验,结果见表1。
三个批号样品的验证试验结果表明,以常规法进行通脉颗粒细菌数、霉菌及酵母菌数测定,五种规定试验菌的回收率均大于70%,符合《中国药典》的规定,方法可行。确定通脉颗粒细菌数、霉菌及酵母菌数计数方法为常规法。
3.控制菌检验方法的建立及验证
菌液制备同2.1。
3.1 大肠埃希菌检查方法
常规法:取1:10供试液10ml接种至100ml胆盐乳糖培养基,同时加入大肠埃希菌10~100CFU,35℃培养24~48h。取培养物0.2ml接种至含5ml MUG培养基的试管中,35℃培养24h左右,366nm紫外灯下观察荧光,然后进行靛基质试验,观察结果;另取培养物划线接种于曙红亚甲蓝(EMB)平板,35℃培养18~24h,观察其菌落形态。
3.2 大肠埃希菌试验结果
经胆盐乳糖(BL)培养基培养后,试验组与阴性对照组相比较有明显的变化,试验组有明显产酸产气现象,结果如表2。
4.结语
根据上述实验结果,拟定通脉颗粒微生物限度检查法标准正文如下:
微生物限度 照微生物限度检查法(《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ)。
取本品10g,用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1∶10的供试液。
细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌 取1∶10的供试液,采用常规法,依法检查,应符合规定。
细菌数每1g不得过1000cfu,霉菌和酵母菌数每1g不得过100cfu,大肠埃希菌每1g不得检出。
5.三批通脉颗粒的微生物限度检查
按上述所建立的通脉颗粒微生物限度检查法,对三批样品进行检验,结果见表3。
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论文作者:钟小斌
论文发表刊物:《心理医生》2016年7期
论文发表时间:2016/8/10
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