任芳丽[1]2002年在《山羊乳腺上皮细胞的分离与体外培养》文中指出本试验研究了山羊乳腺组织细胞的分离及原代培养方法，建立了山羊乳腺上皮细胞系，对乳腺上皮细胞的一些生长特性作了总结；并探索了乳腺特异表达载体的构建，结果如下： 1．用组织块培养法可获得良好的山羊乳腺细胞原代培养物；培养的山羊乳腺成纤维细胞比上皮细胞对胰蛋白酶更敏感，据此可在传代过程中将二者分离纯化，获得纯细胞系；混合培养物先用0.25％胰蛋白酶在37℃消化5～7min所收集的细胞主要为成纤维细胞；再加0.15％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液在37℃继续消化5～6min所回收的细胞绝大多数为上皮细胞，经过2～3代，即可得到纯化的乳腺上皮细胞系。 2．用含10％(v／v)胎牛血清(FCS)的RPMI1640分别溶解150U／ml Ⅰ型胶原酶和100U／ml透明质酸酶，37℃消化组织块4h，可得到足够数量的分散单细胞用以接种，是获得山羊乳腺组织分离单细胞的适宜方法。 3．山羊乳腺组织在铺鼠尾胶原的培养皿中5～0天均长出了乳腺细胞原代培养物，而培养皿中直接培养的组织块在相应的时间内没有乳腺上皮细胞长出。对于传代的乳腺上皮细胞或酶消化的乳腺细胞，鼠尾胶原对其增殖生长没有影响。 4．以RPMI1640为基础培养液，山羊乳腺上皮细胞在含血清、双抗的同时，添加氢化考的松、Insulin、IGF-1、E_2、EGF及ITS的不同组合，以细胞生长群体倍增值为参考标准，评估不同组合的生物活性因子对山羊乳腺上皮细胞生长的影响。结果表明：培养液中添加氢化考的松、IGF-1、EGF及ITS对细胞生长有较明显的促进作用，其倍增时间是34h。 5．分别以RPMI1640、DMEM／F_(12)为基础培养液，添加最佳组合的一组生长因子，作两种培养液的生长曲线。从生长曲线可以看出，传代的乳腺上皮细胞接种后有2天的滞留期，之后进入对数生长期，持续3-4天，第7-8天进入平台期。山羊乳腺上皮细胞在添加氢化考的松、IGF-1、EOF及ITS的DMEM／F_(12)培养液中生长更好。 6．用添加血清和双抗的DMEM／F_(12)为基础培养液，分别添加15％甘油与10％DMSO冻存山羊乳腺上皮细胞，解冻后48h贴壁率分别为71.95％与82.21％，两种冻存液的效果无显着差异；以含10％DMSO的DMEM／F_(12)为基础培养液，分别添加10％、30％与50％胎牛血清的冻存液冻存山羊乳腺上皮细胞，解冻后48h贴壁率分别为72.53％、82.21％和90.37％。结果表明：用添加30％、50％胎牛血清的10％DMSO冻存液冻存效果没有显着差异，均可满足细胞长期保存的需要。 7．用DMEM／F_(12)体外培养山羊乳腺上皮细胞，传代至第7代时其生长在光镜下仍 山羊乳腺上皮细胞的分离与体外培养 正常，没有凋亡迹象。透射电镜观察发现，第6代和第7代细胞没有大的区别： 细胞核结构完整，呈圆形或椭圆形，有些细胞核表面有突起和凹陷，核仁较大， 染色质丰富；细胞质中有粗面内质网；线粒体数目较多，线粒体膜层次清晰。 胞质内有脂滴及高尔基小泡。细胞有较旺盛的分泌活动，胞内物质向外运转， 有大量的小泡向细胞表面移动，部分小泡与细胞膜接触、融合，小泡内物质向 胞外吐出。细胞超微结构表明：山羊乳腺上皮细胞在体外传代到第7代仍增殖 旺盛。8．以自制抗山羊酪蛋白血清为标准抗体，以山羊酪蛋白为标准抗原，用免疫琼脂 双扩散法检测细胞上清液、细胞裂解液中的酪蛋白。结果表明：细胞裂解液中 含有山羊酪蛋白，证明体外培养的山羊乳腺上皮细胞具有合成蛋白质的功能。9．将在乳腺细胞中特异分泌的信号肽序列连接到EZ基因，PCR得到了目的片段， 再将pGFP（ 载体上的Kana基因切下与在乳腺细胞中特异表达的P22载体连 接，使其带有筛选标记，然后将带有信号肽的EZ插入到P22中，试图构建山羊 乳腺上皮细胞的特异性表达载体。探索了构建的含目的基因的乳腺特异性表达 载体调控成分的有效性，为在体外培养的乳腺细胞中定位重组目的基因一体细 胞克隆～动物乳腺生物反应器工作的开展作准备工作。
王立中[2]2015年在《奶山羊Scd1基因克隆及其在乳腺上皮细胞中表达的研究》文中认为硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)是Δ-9去饱和酶,能够催化C14～C19饱和脂肪酸生成相应的单不饱和脂肪酸(MUFA),在调控脂肪酸合成过程中具有重要的作用。SCD1蛋白主要以硬脂酸(C18:0)和棕榈酸(C16:0)为底物,催化其生成油酸(C18:1 n-9)和棕榈油酸(C16:1 n-7);同时还能催化trans11-C18:1(t11-C18:1)生成cis9,trans11-共扼亚油酸(c9,t11-CLA)。MUFA和共扼亚油酸(CLA)具有调节血液中胆固醇含量,防止心血管疾病,提高免疫力等作用,因此,这类不饱和脂肪酸有益于人类的身体健康。SCD1是MUFA合成过程的关键酶,提高乳腺中SCD1蛋白的表达量或活性可以有效的提高乳中不饱和脂肪酸含量,同时降低饱和脂肪酸含量。目前,关于在奶山羊乳腺中特异性表达奶山羊硬脂酰辅酶A去饱和酶1基因(Scd1)的研究尚未见报道。鉴于此,本试验以奶山羊Scd1基因为研究对象,首先,分离、纯化奶山羊乳腺上皮细胞,建立检测乳腺上皮细胞分泌功能的绿色荧光蛋白报告系统;其次,克隆Scd1基因编码区序列并验证其表达产物的生物学活性;然后,探究Scd1基因对乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢相关基因表达的影响;最后,构建Scd1基因乳腺特异性表达载体,并在体外培养的乳腺上皮细胞中验证该载体的有效性。主要研究结果如下:1.奶山羊乳腺上皮细胞的分离培养及荧光报告系统的建立保留乳腺分泌特性的奶山羊乳腺上皮细胞是研究乳腺发育、分化、退化以及乳腺生物反应器的理想模型。本试验旨在分离培养奶山羊乳腺上皮细胞、优化细胞培养条件并建立一种更加简便、有效地检测乳腺上皮细胞分泌功能的荧光报告系统。首先,采用组织块培养法和胰酶消化法分离纯化了奶山羊乳腺上皮细胞,比较了血清、ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒复合物)和胰岛素对细胞生长曲线、细胞周期、细胞凋亡和转染效率的影响。其次,将EGFP基因编码区序列插入到含有山羊β-酪蛋白基因启动子的pBC1载体中,构建绿色荧光蛋白报告载体pBC1-EGFP,脂质体介导法转染奶山羊乳腺上皮细胞,采用RT-PCR法和荧光观察法分别在RNA水平和蛋白水平检测EGFP的表达。最后,为验证荧光报告系统的有效性,采用免疫荧光法和Western blot法分别检测乳腺上皮细胞的纯度和分泌特性。结果显示,分离纯化的乳腺上皮细胞生长状态良好,细胞形态呈鹅卵型;通过比较不同培养条件下,细胞的增殖、周期、凋亡和转染效率,选定10ITS组(10%FBS+1%ITS+5μg/mL氢化可的松+10 ng/mL EGF)作为后续试验中奶山羊乳腺上皮细胞的培养条件;EGFP基因能够在乳腺上皮细胞中诱导表达;在乳腺上皮细胞中,细胞角蛋白18强表达,波形蛋白有微弱表达;乳腺上皮细胞能够合成β-酪蛋白。以上结果表明:(1)分离、纯化的奶山羊乳腺上皮细胞具有分泌功能,可以作为后续试验的细胞模型;(2)β-酪蛋白启动子驱动的绿色荧光蛋白报告系统,可以有效地检测乳腺上皮细胞的分泌功能,为今后鉴定乳腺上皮细胞分泌特性提供了一种简便、有效的荧光报告系统。2.Scd1基因克隆及其表达产物的生物学活性研究为获得Scd1基因CDS区序列,并在细胞中验证其表达产物的生物学活性。本试验采用RT-PCR法从泌乳期萨能奶山羊乳腺组织中扩增得到Scd1基因编码区全序列,并克隆至pMD(?)19-T载体上,构建了pMD-SCD1载体,测序分析Scd1基因的序列。以pEGFP-N1为骨架载体,构建Scd1基因融合表达载体pN1-SCD1,转染乳腺上皮细胞,通过EGFP荧光表达情况,研究SCD1蛋白在细胞中的定位。同时,以pIRES2-EGFP载体为骨架,构建Scd1基因的真核表达载体pSCD1-EGFP,脂质体介导法转染奶山羊耳成纤维细胞,实时荧光定量PCR法检测Scd1基因在mRNA水平的表达,气相色谱法分析SCD1蛋白对细胞脂肪酸组成的影响。测序结果显示:所获得的Scd1基因CDS区序列与Gene Bank公布的序列同源性为100%;SCD1-EGFP融合蛋白荧光表达结果显示:SCD1蛋白定位在细胞质中;qRT-PCR结果显示:在转染pSCD1-EGFP载体的耳成纤维细胞中,Scd1基因mRNA的表达量是对照组的16.5倍;脂肪酸分析结果显示:过表达Scd1基因后,显着提高了细胞内棕榈油酸(16:1n-7,1.73±0.02%vs.2.54±0.02%,P<0.01)和油酸(18:1 n-9,27.25±0.13%vs.30.37±0.04%,P<0.01)的含量。本试验克隆得到了Scd1基因的CDS区序,并证实了该基因的表达产物具有生物学活性。为研究Scd1基因在脂肪酸代谢中的功能及Scd1乳腺特异性表达载体的构建奠定了基础。3.Scd1基因对脂肪酸代谢相关基因表达的影响乳腺中,与乳脂合成、分解和调控相关的基因众多,形成复杂的脂代谢基因调控网络。然而,关于Scd1基因对其它脂肪酸代谢相关基因表达影响的研究较少。本试验采用过表达和干扰Scd1基因法,在奶山羊乳腺上皮细胞中,研究了Scd1基因对脂肪酸代谢相关基因表达水平的影响。首先,以pCAGGS为骨架载体,构建了pCAG-SCD1过表达载体,通过PCR、酶切和测序,鉴定了载体构建的正确性。其次,设计、合成了3对Scd1 siRNA序列并筛选出高效的干扰序列,将Scd1基因过表达载体和干扰序列分别转染乳腺上皮细胞,采用qRT-PCR法检测脂肪酸代谢相关基因表达的变化。qRT-PCR结果显示,过表达Scd1基因后,甘油叁酯合成相关基因(Agpat6、Dgat1)和脂滴形成相关基因(Adrp、Tip47)的表达显着上升;干扰Scd1基因表达后,甘油叁酯合成相关基因(Gpam)和脂滴形成相关基因(Adrp、Tip47)的表达则显着下降。结果表明,Scd1基因可能参与调控了甘油叁酯和脂滴形成相关基因的表达,进而影响了甘油叁酯的合成和脂滴的形成。本试验为进一步研究Scd1基因在脂肪酸代谢中的重要功能奠定了基础。4.Scd1基因乳腺特异性表达载体构建及其在乳腺上皮细胞中表达研究若提高乳腺中Scd1基因的表达量或活性,可以有效地增加乳中不饱和脂肪酸的含量,并降低饱和脂肪酸的含量。本试验旨在构建Scd1基因乳腺特异性表达载体并在体外验证该载体的有效性,为转Scd1基因奶山羊的制备提供有效载体。首先,将已克隆的萨能奶山羊Scd1基因插入到含有山羊β-酪蛋白基因调控序列的pBC1载体中,获得重组载体pBC1-SCD1。同时,为了后期转基因供体细胞筛选的需要,将新霉素抗性基因(Neo)和绿色荧光蛋白(EGFP)基因插入到pBC1-SCD1载体中,并在标记基因两侧插入了用于标记基因删除的LoxP同向重复序列,获得载体pBC1-SCD1-LNIE。然后,将鉴定正确的pBC1-SCD1-LNIE载体,采用脂质体介导法转染奶山羊乳腺上皮细胞,经催乳素诱导培养,qRT-PCR和Western blot法检测Scd1基因的表达,验证载体的有效性。PCR、酶切和测序鉴定结果表明,成功构建了Scd1基因乳腺特异性表达载体pBC1-SCD1-LNIE;qRT-PCR结果显示,Scd1转染组中Scd1基因的mRNA表达量是对照组的14.1倍;Western blot结果显示,Scd1转染组中SCD1蛋白的表达量是对照组的7倍。本试验成功构建了Scd1基因乳腺特异性表达载体,并证实该载体能够在乳腺上皮细胞中诱导表达。为后续转Scd1基因克隆奶山羊供体细胞的制备及富含不饱和脂肪酸羊乳的生产奠定了基础。
代瑞[3]2014年在《奶山羊乳腺上皮细胞永生化细胞系的建立》文中认为乳腺上皮细胞是一种高度分化的体细胞，但其在体外培养条件下仍可保持合成和分泌乳汁的功能，因此可作为靶细胞被用于乳腺生物反应器的制作，产生具有很高药用价值和活性成分的外源蛋白质产物，这对于建立乳腺生物反应器、通过核移植获得转基因动物都具有重要的意义。因此建立一个有永生潜力乳腺上皮细胞系是非常重要的。相比于多种建立永生细胞系的方法，如过表达原癌基因、转染SV40大T抗原等，使用端粒酶逆转录酶基因可有效降低细胞在永生化过程中发生生物学特征改变甚至发生癌变等的风险。本实验使用奶山羊的乳腺组织进行乳腺上皮细胞分离纯化培养，向细胞内稳定转染含有hTERT基因的表达载体，并进行细胞筛选，以期获得永生化的山羊乳腺上皮细胞系，为后续的研究奠定基础。获得主要结果如下：1.使用组织块培养法，在5d后组织块迁出细胞，观察细胞为多角形，形态一致，为典型乳腺上皮细胞的铺路石状，细胞界限清楚，连接紧密，分布密集，增殖旺盛，免疫组织化学鉴定表明乳腺上皮细胞表达角蛋白；通过体外诱导，山羊乳腺上皮细胞可以分泌β-酪蛋白。2.使用脂质体转染法，将外源基因pCI-neo-hTERT转入第3代的奶山羊乳腺上皮细胞，经500μg/mL的G418筛选后，挑取阳性克隆扩大培养，传代中细胞状态良好，生长增殖旺盛，现已传至52代。将50代奶山羊乳腺上皮细胞和第3代未经转染乳腺上皮细胞分别进行hTERT的免疫荧光染色，证明经转染的50代乳腺上皮细胞呈hTERET阳性而第3代未转染的细胞未检测到hTERT的表达。使用RT-PCR对第50代hTERT-GMECs测定，也检测到hTERT的表达，说明外源基因已成功整合到转染乳腺上皮细胞的基因组中，并得到稳定的表达。3.对转染后第50代的奶山羊乳腺上皮细胞进行免疫组织化学鉴定表明hTERT-GMECs可表达角蛋白。在加入诱导培养液进行激素刺激后，通过RT-PCR检测β-酪蛋白的表达情况，结果表明转染后的奶山羊乳腺上皮细胞仍可以表达β-酪蛋白，说明细胞的分泌功能正常。综上所述，本实验使用原代分离纯化的奶山羊乳腺上皮细胞，将含有人端粒酶逆转录酶基因hTERT成功导入细胞基因组中，诱导细胞端粒酶的激活，阻滞端粒缩短，最终延长了细胞的寿命，为后续研究奠定了基础。
邵桃玉[4]2008年在《山羊乳腺上皮细胞系的建立与培养》文中进行了进一步梳理本实验采用组织块和酶消化法分离山羊乳腺上皮细胞,对纯化的细胞进行单细胞克隆并鉴定,采用二次回归正交旋转组合试验设计,MTT显色法定量探索山羊乳腺上皮细胞培养的最适条件,酶联免疫吸附实验与聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定乳腺上皮细胞是否具有正常的生理功能,最终成功建立了山羊乳腺上皮细胞系。试验一使用组织块和酶消化法分离山羊乳腺细胞,结果表明组织块培养可以分离纯化出增殖能力较强的上皮细胞,Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶联合使用可获得较纯的上皮细胞,贴壁后增殖能力较强,但多次传代后细胞增殖能力有所下降。刮除法、相差消化法以及相差贴壁法叁种方法联合使用,经过2-3次传代可以得到细胞形态均一的乳腺上皮细胞。试验二本实验进行乳腺上皮细胞单细胞克隆,发现口吸管法、克隆环法和细胞稀释法细胞克隆率分别为0、5.9%和3.5%,一共得到3株细胞克隆,形态学观察与细胞角蛋白18鉴定为乳腺腺泡上皮细胞。克隆环法细胞克隆率最高,但是操作很难熟练进行,易导致克隆细胞的不纯。细胞稀释法操作简单易行,对细胞伤害小,克隆率较高。试验叁采用五因素五水平的二次回归正交旋转组合试验设计,MTT显色法定量研究不同浓度的胎牛血清(FBS)、氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子(EGF)对山羊乳腺上皮细胞生长的影响,研究发现山羊乳腺上皮细胞培养的最适条件为12%胎牛血清、4μg/ml氢化可的松、10μg/ml胰岛素、8μg/ml转铁蛋白及6ng/ml表皮生长因子的DMEM/F12。试验四使用催乳素诱导种在铺有胶原的培养板中的山羊乳腺上皮细胞,采用ELISA法检测细胞上清液中β-酪蛋白的表达检测,培养48hβ-酪蛋白含量为0.5mg/ml,72h为0.75mg/ml。聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步证明β-酪蛋白的分泌。说明本实验所获得的山羊乳腺上皮细胞具有正常的生理功能。
佟慧丽[5]2007年在《奶山羊乳腺上皮细胞系的建立》文中研究指明应用动物乳腺生物反应器生产药用蛋白是生物高新技术研究领域的热点。乳腺生物反应器研究从模式动物——小鼠的转基因开始，逐步建立起了大动物乳腺生物反应器制备的技术平台。以牛羊等反刍动物制备乳腺生物反应器的前景十分诱人。奶牛产奶量高，一旦得到高表达的个体，其产量和效益十分可观。但奶牛作为单胎动物，生产周期长、成本高。目前利用转基因羊制备乳腺生物反应器有一些成功的例子。奶山羊泌乳期长，单何产奶量高，相对成本低，在乳腺生物反应器的制备方面极具应用价值，以此为基础将推动奶牛泌乳与乳腺生物反应器研究的不断深入。体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞在乳腺生长发育和泌乳机制的研究及乳腺生物反应器的应用等方面具有重要作用。目前建立的一些奶山羊乳腺上皮细胞系往往丧失了泌乳功能，不适合作为研究泌乳机制及检测乳腺表达载体的细胞模型。因此有必要对奶山羊乳腺上皮细胞的体外培养、激素与乳腺上皮细胞分泌功能的关系等方面进行深入研究，以探索建立奶山羊乳腺生物反应器细胞模型的有效方法。本研究选用泌乳性能好的关中奶山羊作为实验材料。利用酶消化法获得了奶山羊乳腺上皮细胞，对纯化的乳腺上皮细胞进行了鉴定。通过细胞培养体系的确立及生物学形状的检测建立并鉴定了奶山羊乳腺上皮细胞系。此外，SDS-PAGE、甘油叁酯生化测定及HPLC法对乳蛋白、乳脂和乳糖的测定反映了激素对乳腺上皮细胞泌乳功能的影响。从而为奶山羊乳腺生物反应器细胞模型的建立及奶山羊乳腺发育利泌乳机制的研究提供实验依据。实验结果表明，本研究获得了纯化的奶山羊乳腺上皮细胞，建立并鉴定了奶山羊乳腺上皮细胞系。通过细胞传代及反复冻存和复苏实现了细胞系的长期保存，获得了大量的乳腺上皮细胞。奶山羊乳腺上皮细胞在添加生长因子的培养液中生长增殖状态良好，细胞传至30代时仍保持旺盛的增殖活力。胰岛素对体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞的泌乳功能无显着影响，而催乳素对于体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞则具有诱导乳蛋白、乳糖分泌的作用。
高亚军[6]2005年在《山羊乳腺上皮细胞的体外培养》文中认为为研究山羊乳腺上皮细胞(GMEC)增殖和分化特性及为生产转基因动物创造条件,需要建立适合GMEC体外增殖的培养体系。用无菌手术法从健康的泌乳期西农萨能奶山羊取得乳腺组织进行体外条件下的培养。基础培养液为D-MEM/F-12, 含10%胎牛血清, 添加EGF (0.01mg/L )、氢化可的松(1mg/L )、孕酮(1 mg/L )、胰岛素-转铁蛋白-硒钠(5mg/L)、青霉素(0. 05g/L ) 及链霉素(0. 05 g/L)。从细胞形态、细胞群体倍增时间、细胞生长曲线等方面考察了不同生长因子对GMEC的促生长作用。通过有效的细胞培养方法获得山羊乳腺上皮细胞系,系统观察了乳腺上皮细胞的长出、贴壁、聚集、迁移、分裂、分化、调亡等一系列形态变化。其结果如下: 1. 用组织块培养法可获得良好的山羊乳腺细胞原代培养物;培养的山羊乳腺成纤维细胞比上皮细胞对胰蛋白酶更敏感,据此可在传代过程中将二者分离纯化,获得纯细胞系;混合培养物先用0.25%胰蛋白酶在37℃消化5~7min 所收集的细胞主要为成纤维细胞;再加0.15%胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化液在37℃继续消化5~6min 所回收的细胞绝大多数为上皮细胞,经过2~3 代,即可得到纯化的乳腺上皮细胞系。 2. 以RPMI1640 为基础培养液,山羊乳腺上皮细胞在含血清、双抗的同时,添加氢化考的松、Insulin、IGF-1、E2、EGF 及ITS 的不同组合,以细胞生长群体倍增值为参考标准,评估不同组合的生物活性因子对山羊乳腺上皮细胞生长的影响。结果表明:培养液中添加氢化考的松、IGF-1、EGF 及ITS 对细胞生长有较明显的促进作用,其倍增时间是34h。 3.细胞生长曲线表明,传代培养的乳腺上皮细胞在接种后有2d 的滞留期,之后为对数生长期,持续4d 左右,第7d 进入平台期。 4.GMEC 的适宜冻存液为DMEM/F_(12),添加30%FCS 和10%的二甲基亚砜(DMSO),适宜的冷冻降温方法是以-1℃/min 的速度从4℃降至-25℃,30min 后投入液氮进行低温保存。 5.GMEC和成纤维细胞混生时分区生长,界限明显。传代的乳腺上皮细胞呈岛屿状聚集生长。可以形成网状结构,圆顶形结构。细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2-4枚
杨振山[7]2018年在《雌激素/GPR30信号通路对山羊乳腺上皮细胞增殖与上皮间质转化的影响及其机制研究》文中研究说明乳腺是哺乳动物少数可以重复经历生长、功能分化和退化的器官之一,它是一种由皮肤汗腺衍生而来的外分泌腺,主要功能是泌乳。乳腺发育的情况决定着仔畜的生长发育状况及产奶量的高低。雌激素具有促进乳腺上皮细胞增殖、腺泡形成,乳腺导管延伸,泌乳发动与维持的作用,因此研究雌激素对山羊乳腺上皮细胞增殖及其表型维持的机制的具有重要意义。G蛋白偶联受体30(G-protein coupled receptor 30,GPR30)作为近年来新发现的雌激素膜受体,被激活后可介导快速非基因组效应来调控细胞的功能。实验室前期研究结果表明:雌激素在山羊乳腺上皮细胞增殖和上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)过程中发挥着重要的调控作用。而雌激素是否通过GPR30信号通路参与这些过程尚需进一步研究。因此本试验以关中奶山羊为试验材料,在山羊乳腺上皮细胞分离、纯化、鉴定的基础上,研究GPR30在山羊乳腺上皮细胞的表达与定位,并采用GPR30特异性激动剂G1及抑制剂G15研究雌激素/GPR30信号通路在山羊乳腺上皮细胞增殖及其上皮表型维持中的作用机制。研究内容和研究结果为:(1)采用无血清培养体系和组织块培养法,分离、纯化得到表达角蛋白18,不表达角蛋白14的上皮样细胞;进一步利用RT-PCR技术检测该细胞β-酪蛋白基因转录情况,结果表明在无血清培养体系中该细胞能够持续转录β-酪蛋白基因,进一步说明所分离得到的上皮样细胞为山羊乳腺上皮细胞。通过免疫荧光技术检测表明,在无血清培养体系中分离、纯化得到的山羊乳腺上皮细胞表达雌激素膜受体GPR30,且主要定位于细胞膜;进一步利用RT-PCR及蛋白质印迹技术检测GPR30 mRNA转录及蛋白表达情况,证明在无血清培养体系中山羊乳腺上皮细胞持续表达雌激素膜受体GPR30。(2)应用细胞计数,BrdU掺入等技术方法,研究雌激素/GPR30信号通路对山羊乳腺上皮细胞增殖能力的影响。结果表明,10-1000 nM的雌激素可以促进山羊乳腺上皮细胞的增殖,且呈剂量依赖效应;在含有雌激素或者雌激素膜受体GPR30激活剂G1的培养体系中,激活雌激素/GPR30信号通路,能够促进山羊乳腺上皮细胞的增殖,而无雌激素或者含有雌激素膜受体GPR30抑制剂G15的培养体系中,雌激素/GPR30信号通路未被激活,山羊乳腺上皮细胞增殖活动受明显抑制。说明,雌激素通过GPR30信号通路介导山羊乳腺上皮细胞的增殖。(3)采用免疫荧光、实时荧光定量PCR、蛋白印迹等技术,研究雌激素/GPR30信号通路对山羊乳腺上皮细胞EMT的影响。结果表明,在含有雌激素或雌激素膜受体GPR30激活剂G1的培养体系中,雌激素/GPR30信号通路被激活,能够维持山羊乳腺上皮细胞的上皮样形态特征,维持上皮细胞特异标记E-钙黏素(E-cadherin)mRNA与E-cadherin蛋白高表达,间质细胞特异标记N-钙黏素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)mRNA及蛋白低表达,EMT关键转录因子Snail2 mRNA低表达,说明雌激素或雌激素膜受体GPR30激活剂G1的添加抑制了山羊乳腺上皮细胞发生EMT。而在无雌激素或添加雌激素膜受体GPR30抑制剂G15的培养体系中,雌激素/GPR30信号通路被抑制,山羊乳腺上皮细胞失去上皮样细胞形态特征,表现出间质样细胞形态特征,其上皮细胞特异标记E-cadherin mRNA及其蛋白低表达,间质细胞特异标记N-cadherin和Vimentin mRNA及其蛋白高表达,与上皮间质转化相关的转录因子Snail2 mRNA高表达,说明无雌激素或添加雌激素膜受体GPR30抑制剂G15时,山羊乳腺上皮细胞会发生EMT。证明,雌激素/GPR30信号通路介导山羊乳腺上皮细胞上皮表型的维持,抑制EMT发生。(4)应用蛋白印迹技术检测雌激素/GPR30信号通路下游关键分子细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK 1/2)的表达情况。结果表明,雌激素可以快速激活ERK 1/2,其磷酸化水平在15 min内迅速升高,且持续至少4 h。雌激素可通过GPR30信号通路促进ERK 1/2快速磷酸化,ERK1/2参与了雌激素/GPR30信号通路对山羊乳腺上皮细胞增殖及上皮表型维持的过程。
张艳丽[8]2010年在《转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究》文中认为人溶酶体β-葡萄糖苷酶(human lysosomal acidβ-glucosidase, GlcCerase)是糖蛋白降解途径的主要外糖苷酶,参与糖蛋白的回收利用。该酶减少或缺失会导致葡萄糖脑苷脂不能有效降解,在各器官中大量沉积,从而使机体发生广泛的病理变化,临床上称为“戈谢病”,酶替代法是目前该病的主要疗法。人体来源的GlcCerase获得极为困难,应用哺乳动物细胞和转基因植物表达系统生产重组人GlcCerase虽然已经有一些成功的报道,但也面临许多难以克服的问题,如在CHO细胞表达重组人GlcCerase,生产成本过于昂贵；在转基因植物中表达,存在重组蛋白质中糖链结构的改变以及下游加工处理困难等限制。如果应用转基因动物乳腺生物反应器生产重组人GlcCerase,在得到天然活性较高产品的同时,将极大地降低生产成本,具有其它表达系统所不能代替的优势。然而,显微注射法的高成本、低效率长期以来制约着转基因动物研究的发展,体细胞转基因与核移植相结合制备动物乳腺生物反应器是当今转基因整合表达的一种有效途径。因此,本研究选取人溶酶体β-葡萄糖苷酶作为研究对象,首先克隆人GlcCerase cDNA序列并对其在COS7细胞中的表达进行初步研究,然后构建含有人GlcCerase cDNA的乳腺表达载体,经体外培养的乳腺上皮细胞验证载体的有效性后,进一步将该载体转染奶山羊胎儿成纤维细胞,筛选稳定转基因细胞克隆株,通过体细胞核移植法生产转基因奶山羊克隆胚胎,以期获得乳腺特异性表达GlcCerase的转基因奶山羊乳腺生物反应器。本研究共分为六个部分,第一、二部分进行了人GlcCerase基因的克隆、表达载体的构建及体外细胞表达研究；第叁、四部分主要是分离培养了奶山羊胎儿成纤维细胞,并优化了脂质体法转染该细胞的体系,获得了稳定整合人GlcCerase基因的供体细胞；第五部分利用转人GlcCerase基因的奶山羊胎儿成纤维细胞进行了核移植,研究转基因供体细胞对克隆胚胎体外发育的支持作用,并对克隆胚胎进行了胚胎移植；第六部分探讨了外源基因导入对奶山羊体细胞周期分布、细胞凋亡和基因表达水平的影响。主要的研究结果如下：第一部分人GlcCerase cDNA序列的克隆及真核细胞表达试验中,首先从人胎盘组织中分离提取得到总RNA,利用RT-PCR方法,直接获得人GlcCerase基因的编码序列,经测序分析,所得GlcCerase cDNA与GeneBank中同源性为99%,发现1个碱基差异,导致天冬氨酸到甘氨酸的改变。为了尽快检测所获得的目标基因是否能正常编码获得重组蛋白质,本试验以pEGFP-Cl为基础质粒,构建了含有人GlcCerase基因的真核表达载体pEGFP-GlcCerase。用脂质体介导法将该载体转染入COS7细胞中进行暂态表达研究,可见报告基因GFP顺利表达,经RT-PCR和荧光酶学法进行验证,在细胞中检测到了GlcCerase的mRNA表达,并在细胞裂解产物中检测到了GlcCerase的生物活性。这些结果表明所克隆的人GlcCerase cDNA能够正确编码蛋白,发挥生物学功能,可以用于下一步的乳腺表达载体构建。第二部分人GlcCerase基因乳腺特异性表达载体的构建及乳腺细胞表达试验中,将在体外经真核细胞表达验证正确的GlcCerase基因以及细胞筛选标记基因(Neor)插入含有山羊p-酪蛋白基因调控序列的pBC1载体中,经PCR和酶切鉴定,得到正确的重组质粒pBCl-GlcCerase-Neo。为了检测乳腺表达载体的有效性,将该载体转染入小鼠乳腺上皮细胞系——HC-11细胞中,经G418抗性筛选,获得阳性克隆细胞,将克隆细胞扩大培养后,经PCR检测结果表明,人GlcCerase基因己成功转入到HC-11细胞中。进一步用催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养转基因细胞,经RT-PCR和Western-blot检测表明,山羊p-酪蛋白基因启动子驱动的人GlcCerase基因能够在乳腺上皮细胞中转录翻译并分泌到胞外。这些结果表明,所构建的人GlcCerase基因乳腺表达载体具有生物学功能,为下一步利用该载体进行转基因供体细胞的建立奠定了基础。第叁部分奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究,采用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到奶山羊胎儿成纤维细胞,绘制了生长曲线,鉴定了胎儿细胞性别及核型特征,结果表明：该培养体系可以支持奶山羊胎儿成纤维细胞的体外生长,其细胞形态为梭形,高度汇合后呈火焰状,增殖特性以及核型特征均为正常,性别鉴定显示该奶山羊胎儿细胞为雌性,符合体细胞转基因克隆的基本要求。进一步利用脂质体法将pEGFP-Cl质粒转染入该细胞,研究了脂质体量、质粒量和转染时间对转染效率的影响,获得了脂质体转染该细胞的最佳条件：24孔细胞培养板中采用4.0μL脂质体转染试剂,1.2μg质粒DNA,细胞在复合物中孵育6 h。这为下一步目的基因转染奶山羊胎儿成纤维细胞的研究提供了参考依据。第四部分建立转人GlcCerase基因奶山羊胎儿成纤维细胞的试验,利用上述优化的转染体系,将线性化的乳腺特异性表达载体pBC 1-GlcCerase-Neo转染胎儿成纤维细胞,经G418筛选8-10天后,获得抗性细胞克隆,进一步通过96孔细胞培养板分离得到来源于单个转基因成纤维细胞的细胞克隆,经PCR扩增检测,得到稳定整人GlcCerase基因的转基因供体细胞8株,和对照组细胞比较,转基因过程中没有导致细胞的生长和核型异常。转基因细胞的核型(2n=58+XX)正常比例为66.8%,而第10-12代的非转染细胞核型正常率为70.9%,二者差异不显着(P>0.05)。这些结果表明可以利用这些阳性转基因细胞作供体细胞进行核移植研究。第五部分人GlcCerase转基因克隆胚胎的制备研究,采集屠宰山羊卵巢,获取卵母细胞并体外成熟培养,成熟率为63.3%。以100%汇合2天的转基因体细胞作核供体,以去核的MⅡ期卵母细胞作核受体进行核移植操作。完成核移植的卵母细胞采用122 kV/cm、20μs/次、间隔1s的直流电脉冲进行融合,融合率为83.3%,融合后的重构胚胎进一步用Ionomycin和6-DMAP进行激活处理,然后转移到SOFaa培养液中与单层卵丘细胞共培养,重构胚的卵裂率为89.1%,发育至桑葚胚/囊胚期的比例为36.4%。以正常体细胞来源的核移植胚胎作为对照,其融合率、卵裂率以及桑葚胚/囊胚率分别为77.8%、90.9%和38.9%,两种供体细胞来源的融合率和胚胎发育率差异不显着。手术法将发生卵裂且形态正常的转基因克隆胚(2-细胞期或以上)移植到同期发情的山羊输卵管中,16只受体山羊中有6只一直没有返情,在第40天经B超检测到2只妊娠的结果,但是最终妊娠没有发育到期,胎儿发生流产。第六部分探讨了外源基因转染对供体细胞生物学特性的影响。将构建的乳腺表达载体pBC1-GlcCerase-Neo分别转染体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞、胎儿成纤维细胞以及成年皮肤成纤维细胞,获得整合有外源基因GlcCerase的转基因体细胞。以非转染的正常细胞为对照,利用流式细胞仪分析了转基因奶山羊体细胞的细胞周期分布和细胞凋亡的情况,研究结果显示：叁种转基因细胞100%汇合2d后,G0/G1细胞的百分比都显着低于对照组细胞(P<0.05),其中转基因胎儿成纤维细胞的G0/G1期比例高于其它两种转基因细胞；转基因胎儿成纤维细胞凋亡率达22.56%,较对照组细胞有显着提高(P<0.05)；然后进一步利用荧光定量PCR法探讨了外源基因转染对胎儿成纤维细胞基因表达模式的影响,检测的基因分别为基因印记基因(IGF2, IGF2R)、凋亡相关基因(Bax)、应激相关基因(热休克蛋白,Hsp70.1)、细胞连接相关基因(Cx43)和DNA甲基化转移酶1基因(DNMT1)。其中IGF2, IGF2R和Cx43mRNA的转录水平显着高于对照组非转染的对照组细胞(P<0.05)。本研究首次从细胞周期分布、细胞凋亡以及基因表达变化模式等方面探讨外源基因转染对奶山羊体细胞的影响,探索转基因克隆效率低的内在机制,为更好地促进供体细胞的重编程,进一步提高转基因克隆的效率奠定了基础。
白英[9]2007年在《微量元素锌（Zn）对山羊β-酪蛋白合成及分泌影响的研究》文中提出本文采用细胞培养技术、分子生物学技术,全面系统地研究了微量矿物元素Zn对奶山羊乳腺上皮细胞的增殖、乳腺上皮细胞IGF-Ⅰ及其受体mRNA表达量、乳腺上皮细胞IGF-Ⅰ和β-酪蛋白分泌量的影响,对矿物营养元素Zn对山羊β-酪蛋白的合成以及分泌的调控机制进行初步探索。试验结果表明:(1)在一定范围内(20-40μmol/L),Zn对山羊β-酪蛋白的分泌量有显着的促进作用。并且,Zn对不同时期乳腺上皮细胞β-酪蛋白的分泌量影响不同,相同Zn浓度处理下泌乳期乳腺上皮细胞β-酪蛋白的分泌量都明显高于孕期乳腺上皮细胞。同时在20-40μmol/L范围内,随着Zn浓度的升高,乳腺上皮细胞数量逐渐增加,细胞数从1.2307×107增加到3.354×107。因此矿物营养元素Zn可以通过增加乳腺上皮细胞的数量来对乳蛋白合成及分泌的进行调控。(2)在一定范围内(10-40μmol/L ZnSO4) IGF-Ⅰ的分泌量随着ZnSO4浓度的升高而增加。这表明IGF-Ⅰ的合成与分泌受矿物营养元素的调控,营养状况可以直接影响IGF-Ⅰ的合成与分泌。(3)随着Zn浓度的升高,在使β-酪蛋白以及IGF-Ⅰ分泌量增加的同时,还可引起IGF-Ⅰ及其受体的mRNA表达量的增加,并且它们之间具有很强的相关性。从这一点可以说明Zn与IGF-Ⅰ对于β-酪蛋白分泌量的影响,是通过一定的方式共同作用的结果。(4)IGF-Ⅰ可以引起Stat5-DNA结合活性的增加。最后本研究得出如下结论:在一定浓度Zn的作用下,首先,促进乳腺上皮细胞的增殖以及IGF-ImRNA和IGF-IRmRNA表达量的增加;随着促进乳腺上皮细胞的增殖和IGF-ImRNA表达量的增加,促进了乳腺上皮细胞IGF-I的分泌量增加;IGF-Ⅰ不仅促进IGF-ⅠRmRNA表达量的增加,而且IGF-Ⅰ与IGF-ⅠR结合,增加了Stat5的活性,被激活的Stat5分子附着在带有编码β-酪蛋白基因的编码区,导致基因以mRNA的形式自我复制,mRNA作为模板用于合成β-酪蛋白,β-酪蛋白随着其它成分被分泌进入乳腺泡;随着乳腺上皮细胞数量的增加,β-酪蛋白的分泌量也增加,从而表现出Zn对β-酪蛋白合成及分泌的调控功能。
彭春燕[10]2011年在《苷类物质对山羊乳腺上皮细胞增殖及酪蛋白基因表达的影响》文中提出本试验以组织块法分离培养,采用刮除法和相差消化法纯化传代获取山羊乳腺上皮细胞,以2-3代的细胞为对象,研究大豆苷、染料木苷、淫羊藿苷和桔梗总皂苷对其增殖和αsl和p两种酪蛋白基因表达的影响。1山羊乳腺上皮细胞的培养及鉴定运用组织块法分离培养山羊乳腺上皮细胞,经形态学和免疫组化鉴定为上皮细胞,采用刮除法和相差消化法纯化细胞,并用0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA进行传代,传代初始细胞活力保持良好,形态均一。传至20代,细胞活力下降。至25代,细胞开始凋亡。传至30代细胞发生完全凋亡。本章试验结果为山羊乳腺上皮细胞系的建立奠定了基础。2苷类物质对山羊乳腺上皮细胞增殖的影响采用MTT法研究了不同浓度的大豆苷、染料木苷、淫羊藿苷和桔梗总皂苷对山羊乳腺上皮细胞增殖的影响。结果表明：苷类纳克级别浓度组较微克级别浓度组对细胞增殖的影响更明显；处理细胞48h较24h和72h对细胞增殖的影响更明显；10ng/mL大豆苷显着促进山羊乳腺上皮细胞增殖；10ng/mL和100ng/mL染料木苷显着促进山羊乳腺上皮细胞增殖；山羊MEC增殖与淫羊藿苷纳克级别浓度有一定的剂量依赖性关系,而且所有浓度处理组(1、5、10、100和1000ng/mL)都能显着促进细胞增殖；说明这叁种苷能促进细胞增殖。低浓度(1和5ng/mL)桔梗总皂苷能抑制细胞的增殖。3苷类物质对山羊乳腺上皮细胞酪蛋白基因表达的影响应用Real Time PCR测定不同浓度的四种苷处理细胞48h后对αsl和β两种酪蛋白基因相对表达量的影响。结果表明：低浓度(1ng/mL、10ng/mL)的大豆苷有所提高αsl-酪蛋白基因的表达,10ng/mL的大豆苷有所提高β-酪蛋白基因的表达；10ng/mL和100ng/mL的染料木苷显着提高αsl-酪蛋白基因的表达,1和10ng/mL的染料木苷能显着提高p-酪蛋白基因的表达量,10ng/mL染料木苷是提高酪蛋白基因表达的最优浓度;1ng/mL、10ng/mL和100ng/mL叁种浓度的淫羊藿苷都能提高αsl酪蛋白和β-酪蛋白基因的表达,随着浓度的提高,促进作用更明显,即有剂量依赖性;1和100ng/mL桔梗总皂苷提高细胞αsl-酪蛋白基因的表达,1和10ng/ml桔梗总皂苷提高p-酪蛋白基因的表达量,100ng/mL为提高αsl-酪蛋白基因表达的最佳浓度,10ng/mL为促进β-酪蛋白基因表达的最佳浓度。
参考文献：
[1]. 山羊乳腺上皮细胞的分离与体外培养[D]. 任芳丽. 西北农林科技大学. 2002
[2]. 奶山羊Scd1基因克隆及其在乳腺上皮细胞中表达的研究[D]. 王立中. 南京农业大学. 2015
[3]. 奶山羊乳腺上皮细胞永生化细胞系的建立[D]. 代瑞. 西北农林科技大学. 2014
[4]. 山羊乳腺上皮细胞系的建立与培养[D]. 邵桃玉. 扬州大学. 2008
[5]. 奶山羊乳腺上皮细胞系的建立[D]. 佟慧丽. 东北农业大学. 2007
[6]. 山羊乳腺上皮细胞的体外培养[D]. 高亚军. 西北农林科技大学. 2005
[7]. 雌激素/GPR30信号通路对山羊乳腺上皮细胞增殖与上皮间质转化的影响及其机制研究[D]. 杨振山. 西北农林科技大学. 2018
[8]. 转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究[D]. 张艳丽. 南京农业大学. 2010
[9]. 微量元素锌（Zn）对山羊β-酪蛋白合成及分泌影响的研究[D]. 白英. 内蒙古农业大学. 2007
[10]. 苷类物质对山羊乳腺上皮细胞增殖及酪蛋白基因表达的影响[D]. 彭春燕. 扬州大学. 2011
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