于文娟[1]2007年在《应用非小细胞肺癌组织芯片检测P-gp、LRP、MRP和GST-π的表达及其临床意义》文中指出目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中P-糖蛋白(P-gp)、肺耐药相关蛋白(LRP)、多药耐药相关蛋白(MRP)和谷胱甘肽转移酶S(GST-π)的表达及新辅助化疗对其表达的影响和临床意义。方法应用组织芯片及图像定量分析技术，对92例NSCLC标本(其中52例未经化疗的直接手术标本，20例同时具备化疗前活检标本和化疗后手术标本)中P-gp、LRP、MRP和GST-π的表达进行检测。结果未经化疗NSCLC标本P-gp、LRP、MRP、GST-π表达的阳性率分别为65.22％、76.09％、81.52％、84.78％。未经化疗标本，P-gp、LRP和GST-π在腺癌中的表达水平均高于鳞癌(P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001)，在低分化癌中表达水平低于高分化癌，且随分化程度的降低表达水平降低(均为P＜0.05)；MRP表达与组织学类型及分化程度无关(P＞0.05)；P-gp、LRP、MRP和GST-π表达水平均与患者年龄、肿瘤大小、临床分期及有无淋巴结转移无关(P＞0.05)。新辅助化疗后，P-gp、GST-π平均光密度与积分光密度在不同临床分期、组织学类型、分化程度、肿瘤大小、年龄以及淋巴结有无转移组中，均高于化疗前(P＜0.05或P＜0.001)；而上述各组中LRP、MRP平均光密度与积分光密度在新辅助化疗前、后均无显着性差异(P＞0.05)。结论(1)化疗前P-gp、LRP和GST-π在NSCLC的表达水平与组织学类型及分化程度有关；(2)同体新辅助化疗后NSCLC组织中P-gp、GST-π表达较化疗前明显增加，新辅助化疗可能通过诱导耐药蛋白的表达增加肺癌组织的获得性耐药性；(3)新辅助化疗的采用与否应视不同病人的具体情况而定，Ⅰ-Ⅱ期NSCLC采用新辅助化疗应慎重，以免影响术后化疗效果；(4)检测NSCLC新辅助化疗前、后耐药蛋白的定量表达，对术前及术后个性化化疗方案的选择和实施具有重要的指导意义。
赵明静, 马列, 王群, 韩冰, 王笑歌[2]2012年在《耐顺铂相关基因MDR1、MRP、LRP及GST-π在非小细胞肺癌中的表达及与生存相关的Meta分析》文中进行了进一步梳理目的:采用循证医学系统分析方法了解肿瘤耐顺铂相关基因与非小细胞肺癌的相关性,为科学制定化疗方案提供理论依据。方法:检索中国学术期刊网(CNKI)全文数据库、维普科技期刊、美国国立图书馆PUBMED;检索时间段为1979-2011年;获得符合纳入标准的关于非小细胞肺癌耐药相关基因MDR1、MRP、LRP及GST-π的文献研究27篇;采用Stata11.0进行统计分析。结果:非小细胞肺癌组织与正常肺组织耐药基因表达合并效应显示,非小细胞肺癌组织耐顺铂相关基因表达水平明显高于正常肺组织。4种基因合并OR值并计算95%可信区间,各基因表达结果按照OR值大小顺序,OR值及95%可信区间依次为GST-π30.86(16.03,59.40)、LRP 13.96(9.27,21.01)、MRP 12.69(8.36,19.26)、MDR1 8.03(4.45,14.48),其中LRP及MRP基因3年死亡人数明显高于3年生存人数,OR值及9 5%可信区间分别为LRP 4.75(2.11,10.67)、MRP 4.61(2.28,9.32)。结论:耐顺铂相关基因MRP、LRP、GST-π及MDR1在非小细胞肺癌组织中呈高表达,尤以GST-π基因为著,其余依次是LRP、MRP、MDR1基因。各基因在非小细胞肺癌组织中表达的高低直接影响化疗效果和预后,是非小细胞肺癌化疗耐药中的重要基因。
郝军, 王妍, 李庆昌, 王恩华, 邱雪杉[3]2005年在《MRP在非小细胞肺癌和正常肺组织中表达及其预后意义的研究》文中研究指明背景与目的 肿瘤多药耐药是导致肿瘤化疗失败的主要原因。多药耐药相关蛋白(MRP)在非 小细胞肺癌中的表达意义和导致耐药的机制倍受关注,其研究结果对逆转多药耐药、提高化疗疗效意义重大。 本研究旨在探讨正常肺组织和非小细胞肺癌中MRP的表达及其与患者临床病理特征和预后的关系。方法 采用SP免疫组织化学法检测62例具有完整随访资料的非小细胞肺癌组织标本中MRP的表达,并联合应 用Westernblot对30例新鲜非小细胞肺癌和相应正常肺组织中MRP的表达进行了研究。结果 正常肺组 织MRP表达水平明显低于肺癌组织(P<0.05)。MRP表达与患者性别、组织分型、细胞分化程度、淋巴结转 移均无明显关系(P>0.05)。MRP阴性表达的非小细胞肺癌患者术后生存期为69.81月±17.41月,阳性者 为25.38月±4.46月(P=0.0156)。MRP阴性的鳞癌患者术后生存期为79.86月±20.35月,阳性者为 23.41月±4.48月(P=0.015);腺癌中MRP表达与生存期无相关性。COX模型分析表明,术后生存期与淋 巴结转移(P=0.038)、MRP表达(P=0.035)呈显着负相关。结论 非小细胞肺癌的MRP表达明显高于正 常肺组织,MRP阴性的患者术后生存期明显长于阳性者,MRP表达可能是影响非小细胞肺癌预后的独立因 素。
郝军[4]2002年在《MRP在非小细胞肺癌中表达和预后的研究》文中提出前言 肺癌是一种严重危害人类健康的疾病，其发病率和死亡率居高不下且呈逐年升高趋势。与其它实体恶性肿瘤一样，化疗仍是控制肺癌术后复发、转移的主要手段。近年来实体肿瘤药物治疗效果多不理想，主要是由于肿瘤细胞接触了一种化疗药物后产生耐药性，同时对其它多种结构和作用机制不同的化疗药物亦产生耐药性，即多药耐药。多药耐药表型可分为两种：一种是先天性耐药，指肿瘤细胞固有的对化疗不敏感；另一种是获得性耐药，指肿瘤细胞初始对化疗药物敏感，但经过几个疗程化疗后逐渐出现耐药。目前已知的相关耐药机制包括MDR1基因编码的P糖蛋白、多药耐药相关蛋白MRP、肺相关蛋白LRP的增多；拓扑异构酶Ⅱ(Topo-Ⅱ)活力降低；谷胱甘肽-S-转移酶以及还原型谷胱甘肽GSH升高；肿瘤某些生化特征的改变：膜离子通道、蛋白激酶PKC；其中自1992年Cole等人发现MRP后，与其相关的问题引起了人们的注意。 近年来国内对MRP在肾癌和血液疾病中的异常表达均有大量研究，但在肺癌中的研究刚刚起步且结果差异也很大。本实验采用免疫组织化学的方法检测非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)中MRP的表达情况，旨在探讨其与非小细胞肺癌组织学分型、淋巴结转移和预后的关系。同时采用Western Blot并结合免疫组织化学探讨MRP在正常肺组织和非小细胞肺癌中表达的差异性。为临床肺癌的治疗提供理论基础，使治疗更具针对性。 材料和方法 1．材料 62例非小细胞肺癌组织蜡块来自中国医科大学附属第一临床医院1989－1992年外科手术切除并有随访资料的标本，标本经10％中性福尔马林固定、石蜡包埋。随访日期以患者手术日期起计算，终止日期为患者死亡日期。另外30例新鲜非小细胞肺癌和相应的正常肺组织标本由辽宁省肿瘤医院和中国医科大学附属第一临床医院提供。 2．主要试剂和来源 小鼠抗人单克隆抗体MRPm6由荷兰阿姆斯特丹Free大学医学院病理科R．J．SchePer教授惠赠，S－P超敏免疫组织化学试剂盒（KIT－97 10）和DAB酶底物显色试剂盒（DAB－0031）均购自福州迈新生物技术公司。碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗和显色试剂盒购自华美公司。 3．方法 3．IWestern Blot检测 MRP在正常肺组织中和非小细胞肺癌中的表达。取新鲜样品门－2克功5倍湿重的裂解缓冲液，剪碎、匀浆超声处理，高速低温离心提取上清蛋白，电泳、转印，经封闭后加相应的一抗、二抗及显色试剂检测。图像扫描人计算机，进行灰度值的测定。 3．二 免疫组织化学检测MRP蛋白表达采用链菌素抗生物素蛋白－过氧化物酶免疫组化法门ps－P法八结果判定：每张切片随机选取10个高倍视野，每个视野计数100个瘤细胞，计数阳性细胞百分比。0分：＜10％；I分：）10％－＜40啪；2分：＞40％－＜刀％；3分：主川阮。按着色强度计分，0分为无着色；1分为淡黄色；2分为棕黄色。将着色细胞百分数计分与着色强度计分 ·2·相乘，总计分 0分为阴性（刁；二－3分为弱阳性（＋入4分以上为强阳性（－）。 4．统计学分析 采用SPSS for Windows 10．0统计分析软件，对生存数据采用Kaplan－Meter分析并绘制生存曲线，用Log－rank检验差异性；用COX模型进行多因素分析；对MRP表达与临床病理特征的关系采用卡方检验和确切概率法。Western Blot图像扫描后进行灰度值测定，采用配对 t检验统计分析。P＜0．05为有统计学意义。 实验结果 1．免疫组织化学结果 1．1 正常肺组织和非小细胞肺癌中MRP表达 MRP在非小细胞肺癌及正常肺组织中均定位于细胞膜或细胞浆，细胞核无着色，呈浅黄色或棕黄色。 卡方分析30例肺癌患者的材料发现正常肺组织和非小细胞肺癌中MRP的表达存在显着性差异。 1．2 MRP蛋白在非小细胞肺癌中的表达与生存期的关系 62例非小细胞肺癌中MRP表达阴性者的术后平均生存期为69．81。17．41月，5年生存率为 50％；而 MRP表达阳性者的术后平均生存期为 25．38。4．46月，5年生存率为 9．62％，二者经＊叶ank检验差异具有显着性汀＝0．0156八按组织学类型分析：发现鳞癌中MRP表达与生存期存在同样相关性，而腺癌无关。 1．3 多因素分析影响生存期的指标 C似多因素分析表明：术后生存期与淋巴结转移的有无（P＝0．038厂MRP的表达汀＝0．035）显着相关。 1．4 非小细胞肺癌组织中MRP的表达与临床病理特征的关系 ·3· 非小细胞肺癌中MRP表达与患者性别、组织分型、组织分化程度、淋巴结转移均无统计学意义瞩＞0．05人 2·Western Blot的结果 正常肺组织中大部分未见特异性条带的出现，而在非小细胞肺癌中可见到特异性染色带门90kD八对染色条带灰度值分析发现正常肺组织和非小细胞肺癌中Mny含量存在显着性差异。 讨 论 1．MRP在亚
刘明[5]2007年在《MRP1、K-ras的表达与非小细胞肺癌辅助化疗预后的关系》文中研究指明第一部分MRP1、k-ras在非小细胞肺癌中的表达及其意义目的我们选取了与化疗耐药性密切相关的MRP1，与肺癌侵袭密切相关的k-ras，检测两者在非小细胞肺癌中的表达，研究它们的表达情况与非小细胞肺癌临床病理学特征的关系。方法应用免疫组织化学方法检测139例非小细胞肺癌中MRP1、k-ras的表达，将表达结果与非小细胞肺癌临床病理学特征及预后进行统计学分析。结果MRP1和k-ras在非小细胞肺癌中的阳性表达率分别为26.6％和66.9％。MRP1的表达在组织学类型(p=0.023)、分化程度(p=0.013)及淋巴结转移情况(p=0.027)间有显着差异性。k-ras的表达只在淋巴结转移情况间存在显着差异性(p=0.015)。多因素分析中组织类型、分化程度、淋巴结转移、MRP1表达、k-ras表达，是否化疗、p-TNM分期均为非小细胞肺癌的独立预后因素，相对危险比分别为1.021，3.315，2.809，2.256，1.995、2.916和3.011。结论MRP1的表达与组织类型、分化程度和淋巴结转移密切相关，k-ras的表达与淋巴结转移相关，MRP1和k-ras与非小细胞肺癌的预后关系密切，是非小细胞肺癌的独立预后因素。第二部分MRP1、K-ras的表达与非小细胞肺癌辅助化疗预后的关系目的含铂类的两药化疗方案能够改善非小细胞肺癌患者根治性切除术后的生存情况，但是目前还无有效的分子生物学指标能预测从辅助化疗中受益的非小细胞肺癌患者。我们研究非小细胞肺癌中MRP1、k-ras的表达，探讨其与辅助化疗(含铂类的两药方案)预后的关系。方法139例完全切除的非小细胞肺癌患者分为辅助化疗组(化疗方案为含铂的两药方案)和对照组(单纯手术组)。应用免疫组织化学方法检测非小细胞肺癌中MRP1、k-ras的表达，分析其与辅助化疗预后的关系。结果k-ras阳性表达的患者，辅助化疗组生存率好于对照组(5年生存率分别为40.5％和28.6％，x~3=4.146，P=0.042)；MRP1和k-ras均阳性表达的患者，辅助化疗组生存率好于对照组(5年生存率分别为35.5％和25.6％，x~2=4.932，P=0.039)。MRP1阳／阴性表达、k-ras阴性表达、MRP1和k-ras均阴性表达患者，辅助化疗组与对照组的生存率差异没有统计学意义。结论检测MRP1和k-ras的表达可能对于筛选从含铂类的两药化疗方案中受益的特定肺癌人群提供重要信息，进而进行针对性化疗。
郝军, 王妍, 王恩华[6]2002年在《多药耐药相关蛋白在非小细胞肺癌中的表达和预后》文中指出目的 :研究非小细胞肺癌中多药耐药相关蛋白 (MRP)的表达同临床病理特征和病人预后生存期的关系。方法 :采用免疫组织化学S P法检测 6 2例非小细胞肺癌中MRP的表达。结果 :6 2例非小细胞肺癌中MRP总阳性率为 83.88% (5 2 / 6 2 ) ,强阳性率为 4 6 .77% (2 9/ 6 2 ) ,其中鳞癌的阳性率为 87.5 0 % (35 / 4 0 ) ,腺癌为 77.2 7%(17/ 2 2 )。MRP表达与患者性别、组织分化程度、淋巴结转移均无关。MRP表达阴性者术后平均生存期为 (6 9.81± 17.4 1)月 ,表达阳性者为 (2 5 .38± 4 .4 6 )月 ,二者差异具有显着性 (P =0 .0 15 6 )。鳞癌中MRP阴性和阳性者术后生存期存在显着差异 (P =0 .0 15 3)。结论 :非小细胞肺癌中 ,尤其是鳞状细胞癌MRP的表达与术后生存期呈负相关 ,是影响病人预后的因素。MRP阴性表达者术后生存期相对较长。
郁俊[7]2014年在《非小细胞肺癌组织C-erbB2、P53、MRP蛋白表达及其意义》文中认为目的探讨C-erbB2、P53和MRP在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）发生、发展中的作用，并为NSCLC的临床治疗及预后评估提供客观依据。方法用免疫组织化学法检测50例NSCLC患者癌组织和正常组织中C-erbB2、P53和MRP蛋白的原位表达情况，分析它们与NSCLC临床病理因素的关系。结果（1）50例NSCLC癌组织中，共有23例C-erbB2表达阳性（46.0%）；38例P53表达阳性（76.0%）；26例MRP表达阳性（52.0%）。而正常组织则分别有0例、3例和2例阳性。癌组织与正常组织两两比较，差异均非常显着。（2）C-erbB2表达与NSCLC患者组织学类型、细胞分化程度等有显着关系。C-erbB2在鳞癌中的阳性表达率为39.4%，而在腺癌中的阳性表达率为58.8%；在鳞癌中的阳性表达显着低于腺癌；低分化型非小细胞肺癌中C-erbB2阳性表达为34.8%，而在高中分化型非小细胞肺癌中阳性表达为55.6%；临床分期为I-II期的C-erbB2阳性表达为36.7%，而在III期的阳性表达为60.0%。（3）P53与NSCLC患者临床分期、组织学类型、细胞分化程度、淋巴结转移等有显着关系。P53在鳞癌中的阳性表达率为78.8%，而在腺癌中的阳性表达率为70.6%；低分化型非小细胞肺癌中P53阳性表达为91.3%，而在高中分化型非小细胞肺癌中阳性表达为63.0%；临床分期为I-II期的P53阳性表达为70.0%，而在III期的阳性表达为85%；有淋巴结转移的NSCLC癌组织P53阳性表达为81.6%，而无淋巴结转移的为58.3%。（4）MRP在鳞癌中的阳性表达率为51.5%，远远高于腺癌中的35.3%。而MRP表达与其它临床病理因素无明显相关性。（5）P53与癌组织内C-erbB2和MRP表达均为正相关性。结论C-erbB2、P53和MRP在NSCLC的发生、发展中可能起着重要的作用，叁者联合检测，有助于对疾病类型的判断，对评估疾病的临床分期及治疗效果也具有参考价值。
曾宁[8]2008年在《LRP和ERCC-1在非小细胞肺癌中的表达及其与预后关系的研究》文中进行了进一步梳理目的:应用免疫组织化学方法,对LRP(lung resistance protein gene,LRP)和ERCC-1(excision repair cross-completion 1,ERCC-1)在非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)组织中的表达情况进行检测,分析其与临床病理因素和患者术后生存时间的关系,为肺癌的临床治疗及预后判断提供新的理论基础。方法:应用Supervision~(TM)二步法检测46例NSCLC组织和16例正常肺组织中LRP和ERCC-1表达情况。SPSS13.0统计软件进行数据分析,以P＜0.05为显着性水准。用X~2检验分析LRP和ERCC-1表达与NSCLC各临床病理特征之间的关系;Kaplan-Meier法进行单因素生存分析,生存曲线比较用Log-rank检验;Cox比例风险回归模型对LRP和ERCC-1表达及其它可能影响NSCLC患者预后的因素进行分析。结果:1.ERCC-1和LRP表达阳性率在NSCLC组织中分别为54.3%和82.6%,正常肺组织中分别为6.25%和6.25%,ERCC-1和LRP在NSCLC和正常肺组织中阳性率的差异有统计学意义(均P＜0.05)。2.LRP和ERCC1表达与TNM分期、性别、肿瘤大小等因素无关(均P＞0.05)。3.ERCC-1表达在肺腺癌表达率为64.2%,鳞腺混合癌为55.6%,显着高于肺鳞癌的47.8%;≤60岁患者表达率为63.6%,显着高于＞60岁患者的45.8%(均P＞0.05)。4.LRP表达与组织学分级有关高分化(G1)患者LRP表达阳性率63.1%、中分化(G2)表达阳性率为92.3%,低分化(G3)表达阳性100%,差异有统计学意义(P＜0.05)5.结合患者术后随访资料单因素生存分析提示,组织学分级、淋巴结转移、TNM分期、LRP表达与患者的预后存在相关性,分化程度低、有淋巴结转移、较晚的TNM分期、LRP的表达等因素均提示预后不良。6.COX模型多因素生存分析显示:淋巴结转移、TNM分期、LRP表达是影响NSCLC患者预后的独立危险因素。结论:1.LRP和ERCC-1在NSCLC组织中的表达率明显高于正常肺组织(P＜0.05)。2.ERCC-1和LRP基因表达与患者的肿瘤大小、TNM分期、淋巴结是否有转移无相关性;但LRP表达与患者的组织学分级有关(P＜0.05)。3.LRP表达阳性患者术后中位生存时间短于阴性患者,提示LRP表达阳性的NSCLC患者生存期短,预后差(P＜0.05);而ERCC1表达阳性患者术后中位生存时间长于阴性患者,但无统计学意义(P＞0.05)。4.LRP和ERCC1二者联合表达有降低NSCLC患者生存时间的危险。5.淋巴结是否有转移、TNM分期、LRP表达与患者的预后存在相关性,是影响预后的独立危险因子。
胡文霞[9]2017年在《骨膜蛋白在非小细胞肺癌中的作用及相关机制的研究》文中指出背景:骨膜蛋白(periostin,POSTN)也被称为成骨细胞特异性因子-2(osteoblast-specific factor 2,OSF-2),是由成骨细胞分泌的一种多功能胞外基质蛋白。据文献报道其在胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌等多种不同类型的肿瘤中高表达,并由此成为恶性肿瘤转移的候选基因之一。研究显示骨膜蛋白的高表达与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer NSCLC)的不良预后密切相关。此外骨膜蛋白还可影响肿瘤细胞对化疗的敏感性,卵巢癌及直肠癌基础研究中表明骨膜蛋白可激活某些信号通路而导致化疗耐药。而骨膜蛋白与非小细胞肺癌顺铂(Cisplatin,CDDP)耐药之间的关系及其可能的机制,至今尚未有学者探讨和研究。基于此,本课题系统探讨了骨膜蛋白在非小细胞肺癌顺铂耐药中的作用及其相关的作用机制。第一部分,我们通过梯度增加顺铂给药剂量,构建了人非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/CDDP;并分析耐药细胞株A549/CDDP与亲本细胞株A549中骨膜蛋白的表达情况。初步探讨了骨膜蛋白的表达与人非小细胞肺癌顺铂耐药之间的相关性。第二部分,通过构建骨膜蛋白过表达载体,在体外研究了过表达骨膜蛋白对顺铂诱导的A549细胞部分生物学行为,如细胞的增殖及细胞周期、细胞凋亡等的影响;同时研究了抑制凋亡的重要信号通路Stat3/survivin在其中发挥的作用,进一步探讨其可能涉及的作用机制。第叁部分,首先在耐药细胞株A549/CDDP上,通过沉默骨膜蛋白的表达观察细胞相关生物学行为的改变,探讨沉默骨膜蛋白是否可以在体外逆转非小细胞肺癌顺铂耐药的发生及相关作用机制;然后通过建立裸鼠非小细胞肺癌异体移植瘤模型,在体内进一步探讨沉默骨膜蛋白的表达对非小细胞肺癌顺铂耐药的影响。第一部分骨膜蛋白与非小细胞肺癌顺铂耐药的相关性分析目的:本研究的目的是通过梯度增加顺铂给药剂量,构建人非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/CDDP;并分析耐药细胞株A549/CDDP与亲本细胞株A549中骨膜蛋白的表达情况。初步探讨骨膜蛋白的表达与人非小细胞肺癌顺铂耐药之间的相关性。方法:对体外培养的A549细胞给予不同浓度的顺铂刺激,并通过MTT法计算其半数抑制率(IC50),然后采用梯度增加顺铂剂量的方法构建A549的顺铂耐药细胞株A549/CDDP。检测不同浓度顺铂作用下A549细胞中骨膜蛋白的m RNA及蛋白表达情况;并比较两株细胞中骨膜蛋白的m RNA及蛋白表达情况,研究骨膜蛋白与非小细胞肺癌顺铂耐药的相关性。统计方法采用单因素方差分析检验。结果:1采用梯度增加顺铂剂量的方法,最终获得在20μM的含顺铂培养基中稳定增长并持续增殖的细胞株,即为顺铂耐药细胞株A549/CDDP。A549/CDDP及A549的半数抑制浓度(IC50)分别为25μM和10μM,A549/CDDP对顺铂的耐药性明显增加。2采用0~30μmol·L-1CDDP处理细胞48h后,检测骨膜蛋白的表达水平。结果显示,随着CDDP浓度的增加,骨膜蛋白的m RNA和蛋白表达水平均呈现增多的趋势。骨膜蛋白的表达水平与CDDP的浓度呈正相关,差异有统计学意义,P?0.01。3耐药细胞株A549/CDDP中骨膜蛋白的m RNA表达水平是亲本细胞株A549的6倍(P?0.05);且A549/CDDP中骨膜蛋白的蛋白表达水平是A549的5.1倍(P?0.05),差异均具有统计学意义。结论:1针对人非小细胞肺癌细胞株A549,通过梯度增加顺铂给药剂量,成功构建了顺铂耐药细胞株A549/CDDP。2通过对A549和A549/CDDP两株细胞耐药性和骨膜蛋白表达的分析,发现骨膜蛋白的表达与非小细胞肺癌顺铂耐药之间呈正相关。第二部分骨膜蛋白对A549细胞部分生物学行为的影响及相关机制目的:分析骨膜蛋白对人非小细胞肺癌细胞株A549的增殖、细胞周期、细胞凋亡等一系列生物学行为的影响;并研究抑制凋亡的重要信号通路Stat3/survivin在其中发挥的作用,进一步探讨其可能涉及的作用机制。方法:1构建骨膜蛋白过表达质粒载体,将过表达载体通过瞬时转染的方式转入A549细胞中,检测其转染效率。2采用MTT、流式细胞术、Western blot方法检测骨膜蛋白过表达对顺铂诱导的A549细胞生存率、细胞周期、细胞凋亡的影响,检测Stat3/survivin信号通路的活性。3采用质粒共转染的方法同时在A549细胞中过表达骨膜蛋白和沉默survivin,研究骨膜蛋白调控顺铂耐药的可能作用机制。结果:1将构建的骨膜蛋白质粒转入A549细胞之后,可显着提高骨膜蛋白的表达。2 MTT结果提示,同对照组相比,10~30μM CDDP刺激下骨膜蛋白过表达组细胞活力分别增加1.56±0.37、1.62±0.17、3.43±1.82倍(P<0.05);说明外源性过表达骨膜蛋白可显着增加A549细胞对顺铂的抵抗力。3流式细胞术DNA含量检测细胞的周期分布。结果显示:对照组、10μMCDDP处理组、CDDP+pc DNA3.1(+)vector处理组G0/G1期细胞数所占百分比分别为:50.04±3.27%,90.30±4.25%,88.2±3.78%,S期细胞所占百分比分别为:46.44±2.31%,8.69±2.79%,8.92±2.81%,转染pc DNA3.1(+)vector对CDDP抑制的周期转换未见明显影响(P>0.05);相对于CDDP处理组,CDDP+POSTN过表达组G0/G1期细胞所占百分比由90.3±4.25%降低到67.49±5.3%,与之对应的S期细胞比例则由8.69±2.79%增加到28.84±2.11%(P<0.05 vs CDDP)。4流式细胞仪Annexin V/PI双染法定量分析A549细胞凋亡情况。结果发现:对照组、10μM CDDP处理组、CDDP+pc DNA3.1(+)vector处理组细胞早期凋亡率分别为:2.45±0.56%,26.32±2.21%,27.93±3.71%,细胞中晚期凋亡/坏死率分别为:2.57±0.46%,13.02±2.01%,12.33±2.35%;相对于CDDP处理组,CDDP+POSTN过表达组细胞早期凋亡率由26.32±2.21%降低到11.91±2.74%,细胞中晚期凋亡/坏死率则由13.02±2.01%降低到7.03±2.05%(P<0.05vs CDDP),外源性过表达骨膜蛋白可显着抑制CDDP诱导的A549细胞凋亡。5 Western Blot检测A549细胞Caspase-3的活化情况,结果显示,10μM CDDP刺激细胞后,A549细胞激活型Caspase-3的表达量明显增加,但是过表达POSTN转染组则可明显逆转CDDP对Caspase-3的活化。6 A549细胞株过表达骨膜蛋白后,检测Stat3/survivin信号通路活性的变化,结果显示:同对照组相比,10μMCDDP处理48h可使A549细胞中Stat3的磷酸化水平降低到0.43±0.05倍,过表达骨膜蛋白之后,CDDP诱导的Stat3的磷酸化水平从0.43±0.05增加到0.87±0.09(P<0.05vs.CDDP);10μM CDDP处理48h后,细胞中survivin的表达减少到0.38±0.03倍,过表达骨膜蛋白后,CDDP诱导的survivin的表达水平从0.38±0.03增加到0.79±0.06(P<0.05vs CDDP)。7在过表达骨膜蛋白的A549细胞中沉默survivin之后,流式细胞术分析结果显示:10μMCDDP处理组,骨膜蛋白过表达组细胞早期凋亡率分别为:26.89±2.24%,13.13±1.54%,细胞中晚期凋亡/坏死率分别为:13.24±2.63%,8.42±2.57%;相对于POSTN过表达组,POSTN+S-sh RNA组细胞早期凋亡率由13.13±1.54%增加到19.97±2.14%(P<0.05 vs POSTN)。除此之外,过表达POSTN可明显抑制A549细胞上CDDP诱导的Caspase-3的活化,但干扰survivin的表达之后,这一抑制作用被逆转(P<0.05 vs CDDP)。结论:成功构建了骨膜蛋白过表达载体,研究表明在A549细胞中外源性过表达骨膜蛋白可通过促进细胞周期转换,促进细胞增殖,同时抑制细胞凋亡,逆转顺铂的促凋亡作用。其作用机制可能是骨膜蛋白激活Stat3/survivin信号通路,进而导致肿瘤细胞产生凋亡抵抗。第叁部分沉默骨膜蛋白逆转非小细胞肺癌顺铂耐药的体内外研究目的:利用骨膜蛋白干扰sh RNA构建骨膜蛋白低表达的耐药细胞A549/CDDP,探讨沉默骨膜蛋白是否可以在体外逆转非小细胞肺癌耐药的发生及相关作用机制;通过建立裸鼠非小细胞肺癌异体移植瘤模型,在体内进一步探讨沉默骨膜蛋白的表达对非小细胞肺癌顺铂耐药的影响。方法:1利用骨膜蛋白干扰sh RNA沉默耐药细胞A549/CDDP中骨膜蛋白的表达,通过MTT、流式细胞术、western blot检测技术观察细胞生存率及细胞凋亡等相关生物学行为的改变。2建立裸鼠非小细胞肺癌异体移植瘤模型,观察沉默骨膜蛋白的表达对顺铂抑瘤效率的影响,比较分析肿瘤组织中Stat3/survivin信号通路活性的变化。结果:1采用western blot的方法检测经G418筛选后稳定转染P-sh RNA的A549/CDDP中骨膜蛋白的干扰效率。结果显示:P-sh RNA组骨膜蛋白的表达是对照组的0.42±0.09倍,且位置正确。说明转染P-sh RNA可显着降低内源性骨膜蛋白的表达。2 MTT结果显示:同对照组相比,0~30μMCDDP刺激下P-sh RNA组细胞活力分别为1.0±0.05、0.7±0.04、0.64±0.09倍(P<0.05),说明外源性沉默骨膜蛋白可提高耐药细胞株A549/CDDP对顺铂的敏感性。3流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果发现:对照组(A549/CDDP),30μM CDDP处理组,CDDP+C-sh RNA处理组细胞早期凋亡率分别为:2.15±0.41%,13.41±2.43%,15.14±2.54%,细胞中晚期凋亡/坏死率分别为:1.92±0.32%,8.83±2.01%,10.01±2.37%;相对于CDDP处理组,CDDP+P-sh RNA组细胞早期凋亡率由13.41±2.43%增加到29.87±3.21%,细胞中晚期凋亡/坏死率则由8.83±2.01%增加到20.13±3.14%(P<0.05 vs CDDP)。4通过对移植瘤体积的测量发现,用药前各组裸鼠移植瘤平均体积未见统计学差异(P>0.05);给予PBS或CDDP干预20天后,C-sh RNA+PBS组、P-sh RNA+PBS组、C-sh RNA+CDDP组、P-sh RNA+CDDP组移植瘤体积分别为(2900±150.28)、(2100±135.16)、(1630.75±109.60)、(445±41.04)mm3,均大于各组给药前体积(P<0.01),P-sh RNA+CDDP组移植瘤体积最小。5对移植瘤组织中Stat3/survivin信号通路活性的检测发现:同C-sh RNA+PBS组相比,C-sh RNA+CDDP治疗组移植瘤组织中Stat3的磷酸化水平降低到0.63±0.06倍,沉默骨膜蛋白后,P-sh RNA+CDDP治疗组移植瘤组织中Stat3的磷酸化水平则进一步降低至0.32±0.03(P<0.05vs C-sh RNA);同C-sh RNA+PBS组相比,C-sh RNA+CDDP治疗组移植瘤组织中survivin的表达水平降低到0.58±0.07倍,沉默骨膜蛋白后,P-sh RNA+CDDP治疗组移植瘤组织中survivin的表达水平则进一步降低至0.21±0.02(P<0.05vs C-sh RNA)。结论:1沉默骨膜蛋白可显着增加人非小细胞肺癌顺铂耐药细胞A549/CDDP对顺铂的敏感性,促进细胞凋亡。2体内研究同样显示沉默骨膜蛋白可提高顺铂的抑瘤效率,并抑制Stat3的磷酸化及其下游靶基因Survivin蛋白的表达。
潘泓[10]2007年在《非小细胞肺癌术后化疗相关基因的临床与基础研究》文中认为研究背景恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重疾病之一。近二十年全国性死亡原因调查显示,死亡率上升幅度最大的是肺癌。目前肺癌的治疗一般采用手术、化疗、放疗、免疫治疗等综合措施,其中化疗作为全身性治疗手段,在恶性肿瘤的治疗中具有手术和放疗不能替代的地位。经过长期的临床经验总结和一些大规模临床随机对照研究,已经达成共识,对完全性切除术后的晚期非小细胞肺癌给予以铂为主的术后辅助化疗能够提高患者的生存率,但对于早期的非小细胞肺癌是否给予术后辅助化疗尚存在争议。一些研究认为对于早期的非小细胞肺癌给予术后辅助化疗可以使3年生存率提高3%,使5年生存率提高5%,建议对完全性切除术后的早期非小细胞肺癌给予以铂为主的术后辅助化疗。而另外一些研究发现对完全性切除术后的早期非小细胞肺癌给予术后辅助化疗,不能提高患者的生存率,反而增加了毒性反应和经济负担。我们认为影响非小细胞肺癌术后辅助化疗效果的原因是患者本身的分子机制不同所致。本研究重心是寻找影响非小细胞肺癌术后辅助化疗效果的分子标志物,建立一个判断非小细胞肺癌术后辅助化疗效果的分子模型以指导早期非小细胞肺癌的术后治疗。并且针对一个有意义的分子指标进行深入研究,探索其作为非小细胞肺癌靶向治疗的潜能。本研究许多内容在国内尚未有相关报道,为探索性实验,本研究主要由5部分组成。研究内容第一部分非小细胞肺癌术后辅助化疗的疗效观察目的:通过本院近10年的临床资料,分析术后辅助化疗在完全性切除术后的非小细胞肺癌中的意义,并用循证医学方法了解术后辅助化疗在完全性切除术后的早期非小细胞肺癌中的意义。方法:回顾性分析近10年在本院行根治性切除的542例非小细胞肺癌的临床资料,其中268例是Ⅲ期NSCLC,274例是Ⅰ、Ⅱ期NSCLC。通过Medline、CNKI、VIP数据库查找关于早期NSCLC行术后辅助化疗临床随机对照研究,用Review Manager4.2软件进行统计学分析。结果:从本院资料分析显示:对切除术后Ⅲ期NSCLC患者进行3～4周期,以顺铂为基础的化疗方案的辅助化疗,可以提高长期生存率;对根治切除术后Ⅰ、Ⅱ期NSCLC患者不需常规进行辅助化疗。Meta分析显示:共16项研究纳入分析,早期NSCLC完全切除术后加用含铂的辅助化疗方案,不能显着提高患者的生存率。结论:寻找分子标志物以指导早期非小细胞肺癌的术后治疗是一个有意义且亟待解决的研究课题。第二部分多基因蛋白表达判断早期非小细胞肺癌术后化疗疗效的探讨目的:目前研究认为与癌症化疗相关的基因有以下六类:(1)药物动力学相关基因;(2)各种生物酶相关基因;(3)DNA损伤与修复相关基因;(4)凋亡相关基因;(5)致癌、抑癌基因;(6)细胞增殖、转移相关基因等,本部分是分析其中的30个基因在早期NSCLC中表达情况,寻找与早期NSCLC术后化疗效果密切相关的基因,通过Logistic回归分析获得一组分子指标以指导早期非小细胞肺癌的术后治疗。方法:利用组织芯片(tissue microarray,TMA)技术和免疫组织化学二步法,对86例行术后辅助化疗的早期非小细胞肺癌标本进行Caspase-3、Fas、Bax、Bcl-2、Survivin、PCNA、Ki67、MGMT、P53、P63、P73、P16、P27、VEGF、nm23、P-gp、MRP、LRP、GST-π、TopoⅡ、C-myc、Cyclin-D1、Her-2、Cox-2、Ku70、Ku80、DNA-PKcs、ERCC1、MSH2、BCRP30种化疗相关蛋白检测。结果:30种化疗相关蛋白在肺癌组织中表达的阳性率为27.9%至91.9%不等。经过单因素分析,与早期NSCLC术后化疗效果密切相关的基因有8个,Survivin、P-gp、LRP、Ki67、P53、ERCC1高表达,NSCLC术后化疗效果差;Bax、VEGF低表达,NSCLC术后化疗效果差。通过Logistic回归分析ERCC1、Survivin、Bax、VEGF4个因子进入方程,方程分类能力达69.8%;方程有效性经卡方检验X~2=29.15,P=0.000。结论:在单因素分析中ERCC1是判断非小细胞肺癌术后辅助化疗效果最敏感的指标,可以进一步深入研究。通过多因素分析ERCC1、Survivin、Bax and VEGF是一组判断非小细胞肺癌术后辅助化疗效果,指导早期非小细胞肺癌的术后治疗的分子指标。对于其可靠性有待于扩大病例进一步研究。第叁部分ERCC1基因在肺癌组织及肺癌细胞系中表达分析目的:ERCC1是判断非小细胞肺癌术后辅助化疗效果最敏感的指标,本部分首先观察ERCC1基因在肺癌细胞系、肺癌组织与癌旁正常肺组织中表达情况,对ERCC1基因的表达特性有一定了解。然后通过耐药细胞系与亲本细胞系中ERCC1mRNA差别及分析单独行化疗的肺癌中ERCC1基因表达情况,进一步证实ERCC1基因表达与肺癌化疗的关系。方法:首先应用半定量RT-PCR方法检测6株肺癌细胞及30例肺癌组织与癌旁正常肺组织中表达情况。第二使用高浓度反复间歇诱导法建立了对多种化疗药物耐药的细胞系A549/DDP,并用RT-PCR方法检测耐药的细胞系和亲本细胞系中ERCC1表达差别。最后利用免疫组织化学法检测65例单独行化疗的NSCLC中ERCC1表达。结果:与癌旁正常肺组织相比ERCC1在肺癌组织表达明显降低。成功建立了肺癌耐药的细胞系A549/DDP,与亲本细胞A549相比其对常规化疗药物的耐药指数增加了4-5倍,ERCC1在A549/DDP表达明显高于A549细胞。在单独行化疗的NSCLC中,ERCC1表达阳性患者的化疗效果明显差于ERCC1表达阴性患者。结论:ERCC1表达降低可能与肺癌的发生有一定联系,体外细胞实验和体内临床病理分析证实ERCC1基因表达与肺癌化疗密切相关,ERCC1基因表达增高,化疗效果不佳。第四部分ERCC1基因的初步功能分析目的:ERCC1是与肺癌化疗密切相关的基因,本部分主要通过基因克隆,细胞转染的技术进一步了解ERCC1基因的生物学功能并初步探讨其引起癌细胞化疗耐受的机制。方法:首先采用基因克隆的方法构建ERCC1基因真核表达载体,用脂质体将载体转染致肺癌细胞H1299中,用G418筛选稳定转染细胞克隆,采用RT-PCR和Western-Blot技术证实ERCC1基因转染成功。第二采用细胞生长曲线,克隆形成实验,细胞侵袭实验,流式细胞仪分析细胞生长周期等方法了解ERCC1基因转染对以上细胞生物学行为的影响。第叁采用MTT法检测ERCC1基因转染对各种化疗药物毒性反应的影响。最后利用流式细胞术检测细胞膜蛋白P-gp、MRP的表达,利用高效液相色谱仪检测细胞内药物浓度,探讨ERCC1基因转染引起癌细胞化疗耐受的机制。结果:成功构建ERCC1基因真核表达载体PCDNA3.1/ERCC1,通过筛选建立了稳定转染细胞系H1299/ERCC1和H1299/Vecter。生长曲线、克隆形成实验、细胞侵袭实验、流式细胞仪分析细胞生长周期等实验显示:H1299/ERCC1和H1299/Vecter在以上实验中无差别。化疗药物毒性反应实验显示H1299/ERCC1较H1299/Vecter对顺铂的耐药指数增加4.23倍。流式细胞术检测细胞膜蛋白P-gp、MRP的表达及高效液相色谱仪检测细胞内药物浓度结果显示H1299/ERCC1和H1299/Vecter无明显差异。结论:ERCC1表达与细胞增殖、细胞侵袭、细胞周期失调等特性关系不大。ERCC1基因表达增高,细胞可以出现化疗耐药,初步研究显示ERCC1基因导致的化疗耐药并非传统的耐药机制(如膜转运蛋白表达差异)使药物摄入减少及外排增加引起,可能与DNA损伤与修复机制改变有关。第五部分RNA干扰抑制肺癌细胞ERCC1基因表达的初步功能分析目的:ERCC1基因在肺癌细胞的各种生物学行为中并不扮演重要角色,其改变主要是引起细胞对化疗药物的敏感性改变,是功能比较单一的基因,可能是提高非小细胞肺癌化疗疗效的一个有潜质的新靶点。本部分主要通过RNA干扰技术抑制肺癌细胞ERCC1基因表达,进行初步功能实验。方法:首先通过构建ERCC1基因及β-actin基因的克隆载体作为标准品,建立ERCC1基因荧光实时定量PCR检测平台。第二构建针对ERCC1基因的SiRNA真核表达载体,瞬时转染肺癌细胞A549,采用RT-PCR和Western-Blot技术证实转染细胞中ERCC1基因沉默效果良好。最后采用MTT法检测构建真核表达载体转染细胞对顺铂药物毒性反应的影响。结果:荧光实时定量PCR能够准确检测样本中ERCC1基因的mRNA表达水平。成功构建针对ERCC1基因的SiRNA真核表达载体,将其转染肺癌细胞A549,可以抑制细胞中ERCC1基因表达。RNA干扰的A549细胞较亲本细胞对顺铂的耐药指数降低了2.93倍。结论:RNA干扰是一种沉默ERCC1表达的理想方法。沉默ERCC1表达可以提高肺癌细胞的化疗敏感性,它可能是一种有潜质的肺癌辅助治疗新方法。
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