于敏莉[1]2012年在《维甲酸对鸡胚生殖细胞增殖和减数分裂调控的研究》文中研究表明家禽的胚胎发育有独特的规律,通过对家禽原始生殖细胞(primordial germ cell, PGC)的体外研究,可以更深入地了解其胚胎发育过程及影响因素,并可对其基因进行遗传操作,制作各种研究模型,从而为生殖生物学和发育生物学等研究提供了一个优良的动物模型。为了更深层次揭示禽类生殖细胞增殖和分化的细胞内部和外源性调控机理、性腺发育和配子形成的分子机理,本实验以海兰鸡鸡胚为材料,分离了不同时期的PGC,进行体外培养并优化培养模型,研究了维甲酸(RA)对PGC粘附和增殖的作用及其胞内信号传导机制,同时还研究了RA对胚胎期卵巢生殖细胞减数分裂启动过程中的调控作用,探索基于LV-siRNA的慢病毒载体法生产转基因家禽的可行性,建立Raldh2基因敲除的转基因鸡模型,为进一步研究胚胎早期发育的机理、转基因家禽的制备奠定了基础。1.鸡胚PGC的分离、培养及鉴定在体视显微镜下用玻璃针分离19期3.5d鸡胚生殖嵴部位或28期5.5d鸡胚性腺,胰蛋白酶+EDTA消化分散组织,用KO-DMEM添加7.5%胎牛血清和10ng/ml白血病抑制因子(LIF)、10ng/ml碱性成纤维生长因子(bFGF)、10ng/ml干细胞生长因子(SCF)、0.1mMMEM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺(Glu)、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养液,通过PGC和体细胞体外共培养的方式建立原代培养模型。然后传代于鸡胚成纤维细胞饲养层上进行继代培养。同时我们从13-15期鸡胚血液中分离提取PGC,在饲养层上进行原代和传代培养。传至3-5代后,用碱性磷酸酶(AKP)、过碘酸雪夫氏(PAS)化学反应及c-kit、SSEA-1,3,4、EMA-1等免疫细胞化学鉴定PGC,用PCNA和BrdU掺入法检测细胞的增殖活性。并收集PGC集落,采用RT-PCR方法检测干细胞多能性相关基因(Pou5fl,Sox2和Nanog)的表达。上述结果表明我们建立的PGC-体细胞共培养模型较好的维持了PGC的生物特性及未分化状态,且具有较强的增殖活性。因此,该模型是可用于PGC体外增殖和分化调控的研究。2.RA对鸡胚PGC粘附和增殖的影响及其机理的研究本实验研究了RA对鸡胚PGC粘附和增殖的影响及其相关的信号传导途径。结果表明：经过RA(0.1-10μM)处理后,PGC的集落数目和面积呈时间和剂量依赖性增加。同时RA能够促进细胞间的粘附,提高粘附蛋白E-钙粘蛋白、α-连锁蛋白和β-连锁蛋白的mRNA水平,增强PGC的粘附性,并存在一定的剂量效应关系。流式分析结果显示,PGC经过RA处理4天后,S/G2期(4N)的PGC数量显着增加,说明此部分细胞已经进入有丝分裂期。此外,RA能激活PGC中PKC和Akt活性,促进NF-κB的核转移,提高钙粘蛋白和β-catenin的磷酸化水平,然而这些刺激作用分别被LY294002(P13K抑制剂),KP372-1(Akt抑制剂),SN50(NF-κB抑制剂)和H7(PKC抑制剂)所阻断。RA显着上调PGC中细胞周期蛋白cyclin D1/E, CDK2/6和原癌基因c-fos, c-myc(?)勺表达,但是这种上调作用被H7、LY294002、KP372-1和SN50所抑制：综上所述,在体外培养条件下,RA通过PI3K/Akt/NF-κB信号级联反应及与PKC/β-catenin之间的交联反应促进鸡胚PGC的增殖,揭示RA在调控鸡胚胎生殖细胞发育中起着重要的作用。3.RA对鸡胚生殖细胞减数分裂的调控机理的研究在本实验中,我们结合胚胎期卵巢的体外培养和RNA干扰等手段,探索RA对鸡胚胎期生殖细胞减数分裂的调控及作用机制。SCP3和γH2AX免疫荧光染色结果表明,鸡胚卵巢生殖细胞在15.5天进入减数分裂,比例逐渐增加,到18.5天,进入减数分裂的细胞几乎遍布整个卵巢。减数分裂早期标志基因Strs8mRNA的表达在12.5天开始显着上调,早于减数分裂启动的时间：而减数分裂标志基因Scp3和Dmcl mRNA(?)内表达则在15.5天显着上调,再次验证鸡胚卵巢生殖细胞在15.5天进入减数分裂；RA合成酶基因Raldh2在15.5天显着上调而降解酶Cyp26bl却逐渐下降,表明Raldh2在RA聚集并维持减数分裂中的重要作用；RA受体RARβ则略微升高,表明其在RA启动减数分裂中的介导作用。而在雄性睾丸中,这些基因的表达变化很小,一直保持较低水平。10.5天和12.5天鸡胚卵巢在无血清的体外培养体系中分别培养5天和3天,生殖细胞能白发启动减数分裂：在培养体系中添加RA能明显增加进入减数分裂的细胞比例,显着上调了减数分裂相关基因Stra8,Scp3和Dmcl(?)的mRNA表达水平。Raldh2shRNA干扰后显着抑制了RA诱导减数分裂启动的作用。综上所述,我们的研究表明,RA及其信号通路对减数分裂启动中的重要调控作用,并首次报道了Raldh2基因敲减能够显着抑制生殖细胞进入减数分裂。4.利用shRNA慢病毒载体制备转基因鸡模型研究生殖细胞的发育本实验采用RNA干涉(RNAi)的方法,成功设计了叁对针对Raldh2基因序列的保守区域的shRNA (short hairpin)分子,并构建质粒干涉载体。转染鸡胚15.5天卵巢生殖细胞后,转染效率达到80%-90%。通过qRT-PCR及SCP3免疫荧光染色检测,结果表明Raldh2-gallus-1224很好的抑制了Raldh2的表达,成功筛选出能高效抑制Raldh2复制的靶位点。针对有效位点构建了携带有能高效抑制Raldh2的shRNA慢病毒载体,将包装后的病毒注射到X期鸡胚胚盘内进行转基因操作,建立Raldh2基因敲减的转基因鸡模型。结果发现Raldh2基因敲减的转基因鸡胚外观与对照组的鸡胚相比无明显差异,卵巢形态大致正常,应用PCR检测GFP在胚体内的表达,进一步证实我们成功制备了转基因鸡模型,且qRT-PCR检测到Raldh2的表达显着下降。本实验为探索基于LV-siRNA慢病毒载体法生产转基因家禽的可行性,建立基因敲减的转基因鸡模型,为研究卵泡发育的分子机制奠定基础。以上实验结果表明：鸡胚PGC的体外共培养模型可用于PGC增殖和分化调控的研究,经AKP、PAS及c-kit、SSEA-1、3、4和EMA-1免疫细胞化学染色和干细胞多能性相关基因(Pou5fl,Sox2和Nanog)表达的RT-PCR检测等多种方法证实了PGC的原始性。利用此模型我们研究了维甲酸在PGC体外培养中的促增殖和粘附作用及其分子机理：我们还描述了鸡胚卵巢生殖细胞体内减数分裂启动中的形态学和分子变化,通过组织培养和RNA干扰等手段研究了RA对减数分裂启动的调控作用。这些发现将为禽类干细胞系的建立和转基因模型的制备奠定基础,同时也为进一步研究生殖细胞的发育提供理论指导和实验平台。
郝小静[2]2003年在《鸡胚原始生殖细胞的分离与培养》文中研究表明近年来，作为精子和卵子的祖细胞的原始生殖细胞(PGCs)已成为另一种可选择的多能性干细胞。来源于PGCs的干细胞称胚胎生殖细胞。迄今为止仅在小鼠上获得PGCs来源的真正意义上的胚胎干细胞(ES cells)，即具有参与生殖系传递能力的ES细胞。 取孵化5.5～6.5天含PGCs的鸡胚生殖腺及其周围组织，经0.25％胰酶+0.02％EDTA消化后，接种于24孔培养板内。加入新鲜的EG细胞培养液(含DMEM、胎牛血清、鸡血清、β-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、HEPES、鸡胚浸出液以及细胞因子等成分)培养24小时以后，PGCs开始部分贴附于共培养的生殖原基细胞上。培养3～4天的PGCs大多已转变为由2～20细胞构成的集落，其中包括从PGCs群集或细胞本身增殖所形成的两种集落类型。培养至5～7天，类EG克隆数目明显增加。类EG细胞克隆呈规则的集落状生长，多层分布，且有明显的花纹。克隆内的细胞间并不紧密排列，因此不难看出克隆内的单个细胞。这与经典的小鼠胚胎生殖细胞的形态有所不同。 原代培养时，我们采用PGCs与相同来源的生殖原基细胞共培养的方式，效果良好。继代培养时，经过反复实验比较鸡胚原代成纤维细胞饲养层(PCEF)、小鼠原代成纤维细胞饲养层(PMEF)、SNL细胞饲养层等叁种不同饲养层的作用效果，最终发现以鸡胚原代成纤维细胞制作饲养层同时添加各种生长因子最适合鸡类EG细胞的生长，但PCEF与PMEF之间的差异不显着。本研究中，通过分组添加不同生长因子，结果发现，培养初期不同的分组在培养过程中出现的类EG集落数相差不明显。而随着培养时间的延长，添加LIF、bFGF、SCF、及IGF-1组表现的优势越来越明显，对促进类EG集落的持续增多效果最佳。四种生长因子的添加量分别为：100IU／ml，10ng／m1，10ng／ml，10ng／ml。 在鸡类EG细胞的传代过程中，采用0.25％胰酶与0.02％EDTA的联合作用将集落离散收到了很好的效果。胰酶和EDTA的协同作用，缩短了消化时间，同时降低了消化液对细胞的损伤作用。除酶的作用以外，外源性物质的添加、血清的更换、温度和PH值的改变等因素对鸡类EG细胞的分离培养均有重要的影响。 研究中分离得到的鸡类EG细胞经PAS染色后呈深紫红色，而鸡胚成纤维细胞并不着色。将消化分散的类EG细胞在无分化抑制因子的类EG培养基中重悬培养，3～4天后，可见部分细胞团形成简单的胚体。在饲养层上生长的类EG细胞集落，在去除抑制分化因子的条件下培养，长时间不传代，可见细胞生长缓慢，自发分 山东农业大学硕士研究生论文（2003）化，首先表现为失去原有的形态，进而与周围细胞界限不清，集落外围的细胞与饲养层连成一片。最后将传至3代、4代的类EG细胞集落离散后制作嵌合体，得到了一只毛色嵌合体鸡。 本研究分离得到的类EG细胞经形态学鉴定、PAS染色、体外分化实验和嵌合体鸡的制作等实验证明其具有胚胎干细胞的诸多类似特性。类EG细胞所具有的多能性、定向整合及较高的嵌合能力，对高效培育鸡的新品种有重大的意义。
丁红梅[3]2007年在《慢病毒转染鸡胚原始生殖细胞及性腺嵌合体鸡的制备》文中研究指明原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)是精子或卵子的祖先细胞，是一种多能干细胞。由于原始生殖细胞可以直接将外源基因传给后代，故以其作为转基因载体生产转基因鸡具有广阔的前景。体外分离培养PGCs，并对其进行遗传操作，再将整合有外源基因的PGCs重新注入鸡胚血管中，就可获得性腺嵌合体，生产出稳定遗传的转基因后代。本实验从孵化5.5d的伊萨鸡胚生殖嵴中分离原始生殖细胞，经Ficoll密度梯度离心纯化PGCs细胞，通过PAS(过碘酸希夫试剂)和AKP(碱性磷酸酶)染色鉴定，其纯度可达70％。同时分离孵化5.5d的鸡胚性腺基质细胞作为饲养层，在添加多种生长因子(白血病抑制因子mLIF、成纤维细胞生长因子bFGF、白介素-11 IL-11、胰岛素样生长因子hIGF-Ⅰ、干细胞生长因子hSCF)的条件下培养PGCs细胞，探索其体外培养的最佳条件。本实验构建了pLenti6-eGFP慢病毒表达载体，与辅助质粒共转染293FT细胞生产病毒颗粒。将慢病毒浓缩后转染鸡胚PGCs，转染率高达24.19％。通过显微注射的方法，将转染外源基因的PGCs供体细胞，浓缩后注入孵化2.5d的受体鸡胚血液中，接受了供体PGCs细胞的受体鸡胚继续孵化至第8d。之后提取受体鸡胚基因组DNA进行PCR检测，结果显示：在检测的42只受体鸡胚中，有2只发生性腺嵌合，嵌合率为4.8％。本研究建立了分离PGCs、体外培养PGCs、制备嵌合体的方法，不仅可以提供丰富的供体细胞来源，还为转基因鸡的成功制备创造条件。
秦洁[4]2006年在《鸡胚胎原始生殖细胞建系能力的研究》文中进行了进一步梳理胚胎原始生殖细胞(Embryonic Primordial Germ Cells,EPGCs)是生殖母细胞的前体细胞,是精子或卵子的祖先细胞,在多能干细胞研究领域中已成为一个新的干细胞资源,亦是近年来干细胞研究的又一个热点。基于目前国内外对鸡胚胎原始生殖细胞(EPGCs)正处于起步的研究现状,本研究对这一胚胎生殖系干细胞进行了系统的探索性研究。在鸡胚发育的第14期血液中、第19期和第28期的生殖腺中采用不同的分离提取方法分别获取EPGCs,并进行体外培养,以探讨分离培养EPGCs的适宜时期和方法;系统地探索了EPGCs的体外培养体系、传代方法和条件、不同冷冻体系对鸡EPGCs冷冻保存的效果以及外源性细胞因子mLIF、hSCF、bFGF和hIL-11对体外培养的鸡EPGCs增殖和分化的影响,以期筛选出鸡EPGCs合适的体外培养体系和冷冻保存条件;同时利用不同特异性化学物质定向诱导EPGCs向脂肪细胞、神经元样细胞分化,以及尝试对EPGCs单细胞进行体外培养克隆传代、检测其形态特征、表面标记及体外分化等特征特性,为建立EPGCs干细胞系以及体外研究胚胎发育、基因组学研究、药物筛选等提供有价值的参考依据。研究结果主要归纳为以下几个方面:1.采用Ficoll密度梯度离心法+酶解法、单独EDTA-酶解法两种方法,分别提取第14期血液(孵化53小时)、第19期(孵化72小时)和第28期(孵化132小时)生殖腺中的鸡EPGCs,比较在相同的体外培养条件下两种分离方法获取叁个发育时期的鸡EPGCs数量、存活率和存活时间的差异。结果表明:单独EDTA-酶解法
唐新燕[5]2006年在《鸡胚原始生殖细胞增殖调控机制的研究》文中指出家禽常被用作发育生物学研究的动物模型，很多研究致力在更深层次揭示家禽发育的机理，尤其是生殖系统的发育，在内源性调节的基础上力图通过外源性调控，以提高家禽的繁殖性能。本实验以艾维因鸡胚为材料，分离了胚胎期原始生殖细胞(PGC)，并进行了原代和传代培养及其分化潜能的检测，探讨了多种体细胞对PGC体外增殖的影响，研究了植物性生物活性物质大豆黄酮(DAI)和槲皮素(QUE)对PGC增殖的作用及其胞内信号传导机制。1．鸡胚原始生殖细胞原代和传代培养模型的建立在体视显微镜下用玻璃针分离3.5～4d鸡胚生殖嵴，用胰蛋白酶+EDTA消化分散组织，以含5％胎牛血清(FCS)的M199培养液进行PGC和体细胞的共培养，从而建立其原代培养模型，然后将PGC传代到饲养层上进行传代培养。结果表明5％FCS在PGC与体细胞原代培养中有较好的促增殖作用，而在传代培养时，添加了5％FCS的培养液和无血清ITS培养液(10μg/ml胰岛素、5μg／ml转铁蛋白和3×10~(-8)mol／L亚硒酸钠的培养液)能较好地维持并促进PGC的存活和细胞集落数的增加(P＜0.05)；碱性磷酸酶(AKP)和过碘酸雪夫氏反应(PAS)及c-kit和SSEA-1免疫细胞化学染色均证实所分离的细胞为PGC；传代的PGC在饲养层上培养60h后增殖细胞核抗原(PCNA)染色呈强阳性，提示培养的PGC具有较强的增殖活性。体外分化实验表明PGC在去除饲养层和生长因子的情况下能分化成多种细胞，根据其形态可分为神经样细胞、上皮样细胞和骨骼肌样细胞。经神经元特异性烯醇化酶(NSE)和角蛋白免疫细胞化学鉴定，证实了神经元样和上皮样细胞的免疫学特征，表明培养的PGC具有分化的多能性。上述结果表明经PGC-体细胞原代共培养后再传代于饲养层上进行传代培养的模型可以用作PGC增殖活性和分化潜能的研究。2．体细胞对鸡胚原始生殖细胞增殖的调控作用为了探讨鸡胚PGC生长的理想支持体系，实验采用叁种来源于鸡不同的体细胞(成纤维细胞、骨骼肌细胞和鸡小黄卵泡颗粒细胞)制备饲养层，比较叁种体细胞对PGC生长和增殖的影响。同时在叁种体细胞饲养层上添加FCS、生长因子及白血病抑制因子(LIF)，比较不同生长因子或细胞因子对PGC生长和增殖的影响。另外，用溴脱氧尿苷(BrdU)掺入显示细胞的增殖活性。部分PGC作传代培养，并添加FCS、LIF和人参皂甙(GS)以研究其对PGC传代增殖的影响。结果表明成纤维细胞饲养层和卵泡颗粒细胞饲养层对鸡胚PGC的存活和增殖效果较骨骼肌饲养层好，PGC数目明显多于后者(P＜0.05)，且BrdU标记染色表明成纤维细胞要优于颗粒细胞；生长因子和细胞因子的比较发现，在叁种饲养层上，0.5％FCS+LIF(10ng／ml)组效果最好，其次是ITS组和FCS组。而单独添加LIF组的效果较差，尤其在颗粒细胞上表现更明显(P＜0.05)。传代培养发现，5～6d后PGC大量增殖，特别是添加了GS(10μg/ml)后形成更大的细胞团，效果更为明显。结果提示：鸡胚PGC在鸡胚成纤维饲养层上培养效果较好，是鸡胚PGC较理想的支持体系；且添加低浓度血清和LIF及抗氧化性营养素GS对PGC的增殖有明显的促进作用。3．蛋白激酶A和C系统对鸡胚PGC增殖的调控机制利用PGC培养模型探讨了蛋白激酶A(PKA)和C(PKC)信号系统在PGC增殖中的作用。传代培养时，培养液中分别添加腺苷酸环化酶激活剂福司克林(FRSK)和佛波酯(PMA)以分别活化PKA和PKC，并与相应的抑制剂H_(89)和H_7联合处理PGC；用BrdU标记细胞的增殖情况。实验结果表明FRSK(10~(-7)～10~(-5)M)刺激鸡胚PGC的增殖(P＜0.05)，这种效应可被H_(89)(10~(-5)M)所抑制(P＜0.05)；PMA(10~(-8)M)也能显着促进PGC的增殖，其促增殖作用可被H_7(10~(-7)～10~(-5)M)所抑制(P＜0.05)。BrdU免疫细胞化学法检测表明FRSK及PMA处理后细胞BrdU标记指数明显增高，说明PGC具有较强的增殖活性，从而证明了PKA和PKC信号通路在鸡胚PGC的增殖过程中起着重要的调控作用。4．类黄酮对鸡胚PGC增殖的调控及其机制的研究利用PGC传代培养模型研究两种类黄酮DAI和QUE对鸡胚PGC增殖的影响，并探讨了其作用机制。结果表明，DAI(1μg／ml)和QUE(0.01～1μg／ml)显着促进PGC的增殖(P＜0.05)；到10μg／ml时二者对细胞发生毒性作用。利用次黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶(HX／XO)系统产生自由基，发现HX／XO系统对PGC造成严重的氧化损伤作用，PGC数目明显减少(P＜0.05)。DAI或QUE能抑制HX／XO的氧化损伤作用，且两种氧化指标SOD或GSH水平的检测也表明DAI和QUE能显着减缓由HX／XO系统造成的氧化破坏作用。实验还表明DAI和QUE可通过PKA信号转导途径影响PGC增殖。DAI和QUE(1μg／ml)分别与10~(-5)M的H_(89)联合作用后，H_(89)可显着抑制PGC的增殖(P＜0.05)。BrdU标记指数也证实了DAI和QUE的作用。另外，实验还证实DAI和QUE并非通过雌激素样效应作用于PGC。结果提示DAI和QUE通过抗氧化和PKA信号转导两种方式促进PGC的增殖。以上实验结果表明：从鸡胚生殖嵴分离的PGC与体细胞原代共培养，再传代于鸡胚成纤维细胞饲养层上所建立的传代PGC培养模型可用于PGC增殖和分化调控的研究，经AKP、PAS及c-kit和SSEA-1免疫细胞化学染色等多种方法证实了PGC的原始性和体外分化的多能性。在此模型上发现PKA和PKC信号通路介导了PGC的增殖作用，植物性抗氧化剂DAI利QUE可通过抗氧化途径和PKA信号转导途径促进PGC的增殖。在PGC培养模型基础上探索更多外源性物质包括各种营养素对PGC增殖和分化的作用及其机理，同时可利用一些植物活性物质去改变胞内信号通路而促进PGC的体外增殖，将为提高家禽繁殖性能的营养调控、制备嵌合体和转基因家禽提供理论指导和实验平台。
王娟[6]2004年在《从原始生殖细胞中分离克隆鸡胚胎生殖细胞》文中进行了进一步梳理原代培养时采取与同源生殖腺基质细胞共同培养的方式,继代培养时采用原代鼠胚成纤维细胞(primary mice embryonic fibroblast,PMEF)、原代鸡胚成纤维细胞(primary chicken embryonic fibroblast,PCEF)、STO细胞及SNL细胞为饲养层,以高糖DMEM添加2%鸡血清,0.1mMβ-巯基乙醇,2mML-谷氨酰胺,10mMHEPES(PH7.6),100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素,10ng/mL庆大霉素,20ng/mL伴白蛋白,胎牛血清及细胞因子为培养基,以孵化4.5～7.5日龄(37.8℃、RH60%、600翻蛋角,每小时翻蛋1次)的鸡胚生殖腺为实验材料,探讨影响鸡原始生殖细胞(Primordial GermCells,PGCs)分离克隆胚胎生殖细胞(Embryonic Germ Cells,EG)的相关因素。实验结果如下: 1.根据Hamburger和Hamilton(1951)划分鸡胚发育阶段的标准,从孵化4.5～7.5日龄的鸡胚生殖腺中分离获取生殖腺PGCs,生殖腺组织用消化液(0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA)消化。用含10%FBS的DMEM中和消化液后,离心收集生殖腺细胞。用鸡胚胎生殖细胞(Chicken Embryonic GermCells,CEG)培养液稀释生殖腺细胞后,接种于24孔板中(细胞密度:4枚生殖腺/孔),于CO2培养箱中培养(37℃,5%CO2,饱和湿度),直至PGCs原代集落出现(大约2～3天)。培养至5～6天,集落边缘出现分化迹象,即应传代。用吸管轻轻将CEG细胞克隆吸出,消化液处理后, 200g离心5min,用CEG细胞培养液重悬细胞沉淀后,铺于PMEF饲养层上。平均5-6天对CEG细胞进行一次传代。 CEG细胞克隆的形态与小鼠的稍微不同;克隆内的细胞并不紧密堆积,高倍镜下观察能分辨出单个细胞。CEG细胞克隆并不紧密贴于饲养层细胞上,所以能够很容易地与饲养层细胞分离。CEG细胞类似于猪的ES或EG细胞,呈多层分布,克隆边界清晰。CEG细胞含有较大的核,较少的胞浆,核仁不明显。 2.CEG细胞分离与克隆时期的生长状况。CEG细胞培养12h时,就会出现10-15个PGCs组成的小集落,24h后集落较明显。培养至2-3天,出现鸟巢状的CEG细胞集落。可能由于含有相对多的杂细胞(如血细胞)的缘故,有些原代CEG细胞克隆呈红棕色。随着传代次数的增多,杂细胞的 1<WP=8>王娟:从原始生殖细胞中分离克隆鸡胚胎生殖细胞数量明显减少,集落内的细胞逐渐纯化,成为单一的CEG细胞。 3.胎牛血清对CEG细胞增殖能力的影响。把CEG细胞培养液中胎牛血清的浓度分别设为:0%、5%、10%、15%。结果发现:当胎牛血清为10%时CEG细胞的分离克隆效果最好。 4.细胞因子对CEG细胞分离克隆的影响。细胞因子添加与否对CEG细胞的分离及培养影响显着(p<0.05)。其中同时添加mLIF、bFGF、hSCF、IGF-1及h-IL-11时CEG的分离传代效果最好,五种因子的添加量分别为:1000IU/mL、10ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、0.04ng/mL。在实验中,添加复合因子时CEG细胞传代次数平均可达7.0,未添加任何细胞因子时仅为2.0。 5.不同饲养层细胞对CEG细胞分离增殖的影响。CEG细胞与生殖腺基质细胞共培养以及分别以经过丝裂霉素-C灭活过的PMEF、PCEF、STO及SNL细胞为饲养层共培养,比较发现:CEG细胞原代培养时采取与生殖腺基质细胞共培养的方式,生长效果最好;继代培养时以PMEF细胞为饲养层增殖能力最强。 6.鸡胚日龄对CEG细胞分离克隆的影响。分别从孵化4.5、5.5、6.5、7.5日龄的鸡胚生殖腺中分离培养PGCs,实验表明,鸡胚日龄对CEG细胞分离克隆的效果影响显着(p<0.05);鸡胚日龄为5.5d时CEG细胞的克隆形成率和稳定传代率明显高于其它叁种。 7.消化时间对CEG细胞生长行为的影响。CEG细胞继代培养时,采取4种方式进行传代操作,一组不用消化液,直接机械吹打;另外叁组使用消化液,消化时间分别设为20s、40s、60s。比较发现,消化液添加与否以及消化时间的长短对CEG细胞的传代效果影响显着;传代时用消化液将CEG细胞克隆离散成小团块,CEG细胞的增殖速度最快;消化时间为40s时既能将CEG细胞之间的粘连打破,又不至于对细胞造成过度损伤。 8.分离得到的CEG细胞经AKP染色后呈蓝紫色,PAS染色后呈紫红色,而饲养层细胞不着色。在体外分化实验中,CEG细胞在无饲养层无分化抑制因子mLIF和h-IL-11时可以分化成几种细胞类型,包括成纤维细胞、神经细胞、自律细胞等。CEG细胞在悬浮培养时可以形成类胚体。本研究中得到了一只畸胎瘤鸡和一只嵌合体鸡。上述结果表明,本实验所获得的细 2<WP=9>山东农业大学硕士研究生论文(2004)胞具有EG细胞的诸多特性,为类EG细胞。
徐璐[7]2017年在《鸡精子发生过程中关键piRNAs及Piwill基因功能初步研究》文中研究指明生殖系细胞担负着遗传信息的世代传递,其基因组特性、表达与调控模式对个体及物种维持都至关重要。作为一半的遗传信息载体的精子在家禽中一直未受到足够关注。但是近年来,鸡繁殖力持续下降的问题始终困扰着产业的发展。地方鸡种中每年有5～12%的公鸡因精子发生障碍症而遭淘汰。在现代商业品种中,种公鸡的精子质量导致出苗率逐年下降。另外,由精子介导的细菌微生物(白痢沙门氏菌、空肠弯曲杆菌等)与病毒性疾病(禽白血病、EDS-76等)逐年上升,其中,困扰产业多年的“两白”(白痢与白血病)至今尚未解决。因此,研究鸡精子发生及其影响机制成为当下迫切解决的问题之一。piRNA(Piwi-interacting RNA)是一类长度约为30 nt左右的小RNA,与PIWI蛋白家族成员结合发挥调节作用。在小鼠、果蝇、斑马鱼等模式动物中,PIWI/piRNAs复合物引起的基因沉默能调控生殖干细胞增殖、分化以及精子发生;但在家禽中,PIWIpiRNAs的研究报道甚少,其具体作用与功能尚未阐明。鉴于此,本研究以中国地方鸡种——狼山鸡为对象,分别从精子发生的不同阶段生殖系细胞small RNAs表达谱、与鸡PIWI蛋白特异结合的piRNAs表达与分析、piRNAs与靶基因的作用关系、减数分裂中Piwi基因作用及敲除Piwi基因后个体精子发生变化等方面来揭示家禽精子发生过程中Piwi基因与piRNAs的可能作用与具体功能,从而为探明Piwi基因及piRNAs在禽类中的生物学功能与改善家禽繁殖力提供理论依据,也为丰富生殖细胞和精子发生的表观遗传调控机制研究增添新的资料。为探究参与鸡精子发生及生殖干细胞增殖相关的piRNAs,本研究利用深度测序技术获得不同生殖干细胞(PGCs、SSCs)与生精细胞(Sa、Sperm)的small RNAs表达谱。结果发现,鸡piRNAs主要集中在31～33nt之间,比小鼠中的piRNAs略长,主要定位于编码基因序列及转座子区域;碱基偏好性分析表明鸡piRNAs均表现出首碱基为U,第10位为A(1U-10A)的特征,并且Sa细胞与Sperm中piRNAs的碱基偏好性更为明显。另外,在Sa细胞及Sperm中预测到大量piRNAs簇,分别定位于不同染色体中。由此推测鸡的piRNAs与小鼠piRNAs类似,对于精子发生有重要调控作用。通过不同生殖系细胞的单独比较以及组间比较(PGCs vs.SSCs;Sa.vs.Sperm)富集到一批与鸡精子发生及生殖干细胞增殖相关的piRNAs及其靶基因。对靶基因进行GO富集后得到5个候选靶基因:尤IT,SMAD6,SCX,PGR和 GGNBP2。与这些靶基因对应的 piRRNAs 有:piR-gga-19128(KIT),piR-gga-403821(SMAD6,SCX),piR-gga-123686(PGR),piRNA-396(GGNBP2)。同时,通过KEGG富集到的信号通路有:Melanogenesis,Notch signaling pathway,Steroid hormone biosynthesis,Cytokine-cytokine receptor interaction,Wnt signaling pathway 与 TGF-beta signaling pathway。为验证禽类piRNAs与PIWI蛋白结合状况以及共同参与鸡精子发生及生殖干细胞增殖、分化的可能作用,本研究利用免疫沉淀技术结合深度测序技术获得PGCs、SSCs与Sperm的small RNAs表达谱。长度分析表明,与PIWIL1蛋白结合的piRNAs主要集中于31～33nt;碱基偏好性同样表现为“1U-10A”特征,并且Sperm中的碱基偏好性比PGCs、SSCs明显,上述分析结果均与前期研究结果一致,由此表明,鸡piRNAs确实与PIWI蛋白相互结合并共同参与调控鸡精子发生与生殖干细胞增殖与分化。通过叁种细胞的venn分析筛选出一批与PIWI蛋白结合且参与精子发生及生殖干细胞增殖的piRNAs:piRNA-19128、piRNA-70672,piRNA-64217,piRNA-139648。通过靶基因注释及GO富集分析获得候选靶基因有:KIT、SRC、WNT4、HMGB2。KEGG富集分析获得以下信号通路:Steroid hormone biosynthesis,Notch signaling pathway,Melanogenesis.综合以上两部分piRNAs的分析结果,通过Venn分析进一步发现piRNA-19128为二者交集,因此选取piRNA-19128为鸡关键piRNAs进行功能验证。研究表明KIT基因参与精子发生过程,并且对减数分裂发挥重要调控作用。因此,选取piRNA-19128对应的靶基因KIT作为候选功能验证对象。为进一步验证piRNAs与KIT基因的靶向调控关系,首先利用RT-qPCR技术检测了 PGCs、SSCs、Sa及Sperm中KIT与piRNA-19128的表达量,结果表明,在SSCs与Sperm中,KIT基因表达量相对较高,但piRNA-19128表达量相对较低;l在PGCs及Sa中piRNA-19128表达量相对较高,但KIT基因表达量相对较低,且均达到显着差异水平(P<0.01)。由此推测,piRNA-19128与KIT基因可能存在靶向抑制关系。其次,利用piRNAs-19128模拟物与抑制物结合RT-qPCR技术检测piRNA-19128的表达量。结果发现,转染piRNA-19128 mimics与inhibitor至DF-1细胞后,随mimics的转染浓度增加,piRNA-19128的表达量随之增加,KIT基因表达量随之降低;随inhibitor的转染浓度增加,piRNA-19128的表达量随之降低,KIT基因表达量随之增加。双荧光素酶荧光活性检测进一步发现,突变型KIT基因荧光活性与野生型荧光活性相比,突变型显着高于野生型(P<0.01)。综上表明,piRNA-19128与KIT基因确实存在靶向调控关系,并且piRNA-19128抑制KIT基因的转录,从而参与精子发生过程中的减数分裂。为探明PIWI蛋白与piRNAs如何调控鸡精子发生,我们选择精子发生过程中关键事件—减数分裂作为功能研究平台,探讨编码鸡PIWI蛋白的Piwill(Piwi like-1)基因、KIT基因与piRNA-19128在减数分裂中的作用。本研究利用维甲酸诱导PGCs细胞,通过RT-qPCR、Western Blot及流式细胞分析技术检测诱导过程中PiwillmRNA及蛋白水平的变化。有研究表明,Piwil1基因在圆形精细胞中表达量最高,精原细胞次之,推测Piwil1基因参与减数分裂,并发挥重要调控作用。分别收集诱导48h、96h、144h的样品,通过检测减数分裂标志基因Stra8的表达,结果发现,随诱导时间的增加,Stra8基因的表达量显着增加;流式分析诱导144h的细胞,表明44.9%的细胞形态发生变化,由二倍体变为单倍体,由此推断细胞进入减数分裂状态。通过检测不同时间点Piwill基因、KiT基因与piRNA-19128的表达量,表明随诱导时间的增加,Piwil1、KIT、piRNA-19128的表达量增加;PIWIL1蛋白水平检测表明,随诱导时间的增加,PIWIL1蛋白表达增加。由此推断,在禽类中,Piwil1基因、KIT基因与piRNA-19128参与鸡精子发生过程并调控减数分裂。为阐明PIWI/piRNAs复合物在家禽(鸡)精子发生的具体功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术在体内、体外水平分别对Piwil1基因进行敲除。首先针对Piwil1基因第八外显子分别构建3条敲除载体,通过转染DF-1细胞后使用T7E1酶切及PCR扩增、测序表明2号位点可发挥敲除活性。利用有活性载体转染DF-1细胞,结合有限稀释法得到58株单克隆细胞,PCR扩增靶位点测序表明2株细胞为阳性细胞,一株共缺失23 bp,另一株共缺失8 bp。由此表明,利用该技术成功构建Piwil1敲除细胞株,敲除效率为3.44%,略低于大鼠的敲除效率。在体内水平,利用胚下腔注射法将敲除载体导入孵化2.5日龄的鸡胚个体,分别检测5日龄(心脏、生殖嵴)及18日龄(心脏、睾丸)不同组织中Piwil1基因DNA及RNA水平的突变情况。结果发现,在5日龄及18日龄的各个组织中,敲除位点附近均出现不同程度的突变。RT-qPCR结果显示,实验组中Piwil1基因及SOX2基因表达水平显着低于对照组(P<0.01),表明敲除载体成功导入鸡胚个体发挥敲除作用。对敲除后F0代雏鸡进行饲养并检测其体重及精子活力,结果显示敲除组群体体重与对照组无差异(P>0.05),表明敲除Piwil1基因对个体体重无影响。精液品质检测表明敲除Piwil1基因后,鸡精子活力、活率下降,云雾状不明显,精液量显着减少。对F0代实验鸡群进行本交得到F1代,PCR扩增靶位点并测序表明,10只个体发生Piwil1基因突变。综上表明,在家禽中Piwil1基因参与精子发生,并在其中发挥重要的功能;CRISPR/Cas9技术适用于家禽基因组修饰,并且其修饰效果可遗传。
李明[8]2008年在《鹌鹑原始生殖细胞系的建立及鉴定》文中研究说明原始生殖细胞(Primordial germ cells,简称PGCs)是精子或卵子的前体细胞,PGCs细胞具有发育的全能性,任何一个细胞都具有发育成一个完整个体的潜能,在体外PGCs可诱导分化出包括叁个胚层在内的所有分化细胞,PGCs也具有种系传递功能,能与另一个正常胚胎嵌合,获得包括生殖系在内的动物个体。本研究采用鹌鹑为研究对象,以鸡成纤维细胞饲养层及各种生长因子为基础,对5.5天鹌鹑胚胎PGCs的分离、纯化、培养进行了研究,并对鹌鹑的PGCs的冷冻保存效果进行了探讨。1.鸡成纤维细胞饲养层的制作:采用孵化6天的海兰白种鸡蛋为实验材料,经培养传至2-3代后,以丝裂霉素-C处理后所得到的细胞单层作为饲养层。2.PGCs的分离及鉴定:本实验采用孵化5.5天的鹌鹑胚胎,以酶解法消化获得细胞。对其消化时间做了探讨,发现消化15分钟所获得的细胞数最多。每枚性腺获得的细胞平均为226个左右,并分别用形态学和碱性磷酸酶(AKP)对PGCs做了鉴定。3.PGCs的传代及培养:分别在无饲养层,无生长因子的培养液中、鸡成纤维饲养层及添加LIF＼SCF＼bFGF的鸡成纤维饲养层上对PGCs进行培养。在不含饲养层和生长因子的饲养层中培养原始生殖细胞,基质细胞成纤维状贴壁生长,培养的时间很短,不超过5-6天。原始生殖细胞置放在鸡胚成纤维细胞饲养成上时,细胞的分化得到了有效的抑制,前2天原始生殖细胞仍保持单个的未分化状态。在培养3天后分化的程度比之无饲养层的PGCs情况好,PGCs存活50%左右。在添加生长因子的成纤维细胞饲养层中培养,前3天左右细胞基本不出现分化,保持单个的未分化状态,在4-5天后细胞开始出现分化,PGCs存活76%左右,培养至第6-7天后,细胞出现7-8个细胞的细胞克隆;培养至第10天时,细胞团细胞达到13-15个左右,此时细胞形态不明显,细胞间的结合不紧密,成纤维细胞大量死亡。本实验尝试在第7天进行鹌鹑原始生殖细胞的传代,对于鹌鹑PGCs的传至第5代,细胞仍具有原始生殖细胞的形态,部分细胞保持分裂增殖能力。4.PGCs的冷冻与解冻:解冻保存了2个月的原始生殖细胞。方法1(DMSO作为冷冻液)解冻后细胞存活率为61.4%,方法2(EG+PVP作为冷冻液)解冻后细胞存活率为54.2%(P＞0.05)。以上结果表明:以酶解法在5.5天鹌鹑性腺中分离到PGCs,将PGCs在添加生长因子的鸡成纤维细胞上培养,在第7天对鹌鹑PGCs进行传代,传至5代仍有部分细胞存活并具有分裂增殖的潜能。解冻保存2个月的鹌鹑PGCs,获得了较高的成活率,并具有PGCs的形态。PGCs系的建立可为研究生殖细胞的发育机制和生殖系瘤化提供丰富的实验材料,PGCs也是将目的基因直接传给后代的理想载体,作为载体转基因有着诱人的前景。
李林凤, 白秀娟, 张艳艳, 关伟军[9]2007年在《鸡胚原始生殖细胞的建系方法及其影响因素》文中研究表明学术背景:胚胎原始生殖细胞经体外抑制分化培养可得到胚胎生殖细胞,是胚胎干细胞的又一来源。以其作为外源基因的载体用于制作嵌合体、基因敲除等具有很高的实用价值。目的:概括性论述鸡胚胎原始生殖细胞建系方法、影响因素及应用前景等问题。检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1990-01/2006-04的相关文献,检索词"embryos,primordialgermcells,embryonicstemcells,embryonicgermcells,genitalridge,Invitroculture",并限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库2000-04/2007-04的相关文献,检索词"胚胎,原始生殖细胞,胚胎干细胞,胚胎生殖细胞,生殖嵴,体外培养",并限定文章语言种类为中文。共检索到60篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①与鸡胚胎原始生殖细胞的建系、影响因素及应用密切相关。②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章。排除标准:重复性研究。文献评价:文献的来源主要是通过对鸡胚胎原始生殖细胞建系方法、影响因素及应用前景方面内容进行汇总分析。所选用的30篇文献中,7篇为综述,其余均为临床或基础研究。资料综合:①原始生殖细胞离体培养的关键是保证细胞具备无限增殖能力的同时维持其未分化状态。目前主要通过选择鸡胚原始生殖细胞的适宜分离时期和方法、合理设计培养基、采用饲养层细胞培养以及添加抑制分化的细胞因子等方法来解决。②鸡胚原始生殖细胞的生物学检测主要包括形态学鉴定、碱性磷酸酶活性检测、PAS染色检测、阶段特异性胚胎表面抗原1检测、核型分析、分化试验以及嵌合体试验等方法。③鸡胚原始生殖细胞的应用研究广泛,相比较桑椹胚和囊胚体外培养获取干细胞优势明显;为基础研究提供了最原始的发育生物学模型;生产克隆动物,降低禽类的保种成本;生产药物蛋白,是生产治疗用重组蛋白极为理想的来源。结论:尽管目前有关鸡原始生殖细胞的培养与应用已取得一定进展,但在生产实践上如何设计出更适合于鸡原始生殖细胞生长的离体培养体系、如何更高效方便地获得鸡原始生殖细胞、如何提高利用原始生殖细胞制作嵌合体的成功率等问题还有待进一步深入研究。
林金杏[10]2011年在《局部性促生长因子对鸡卵泡发育的调控及其机理的研究》文中认为目前,人们的消费和市场走向迫使家禽业在蛋禽育种时,选留具有高繁殖性能的个体,而母禽的繁殖性能特别是产蛋率的高低主要取决于卵泡的发育状况。因此,家禽卵泡发育的研究成为了解禽类繁殖机能调控和提高家禽产蛋性能的理论基础。此外,家禽卵泡以其独特的特征优势成为研究卵巢和卵泡发育理想的生物学模型。大量的研究表明,家禽卵泡的生长发育和成熟是在一系列激素和生长因子的精确调控下进行。本实验以鸡为研究对象,一方面研究了鸡卵巢发育过程中一系列形态变化,另一方面研究了表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、干细胞因子(stem cell factor, SCF)及Ghrelin对产蛋鸡小黄卵泡颗粒细胞和膜细胞及18日胚龄鸡胚卵巢生殖细胞生长发育的调控及其机制,为提高家禽繁殖性能提供理论依据。1.产蛋鸡卵泡发育的组织学研究家禽卵泡发育是一个复杂的生理过程,伴随着形态结构的变化。组织结构决定其生理功能,因此,卵泡发育形态结构的研究有助于家禽卵泡发育调控机理的研究。本实验通过组织学方法研究鸡卵泡发生发育过程中的形态学变化。结果表明：孵化至第6天,原始生殖细胞已经迁移到生殖嵴,并与生殖嵴共同形成未分化的性腺；孵化至第9天,性腺已经分化,卵巢特征性结构开始出现,胚胎后期卵巢皮质内卵母细胞聚集成簇。原始卵泡的发育在出生以后开始启动,性成熟母鸡的卵泡呈等级发育,颗粒细胞和膜细胞在形态和增殖特性上具有等级阶段特异性。以上结果表明,家禽卵泡发育是一个以形态变化为特征的生长过程,由卵母细胞的成熟和卵泡细胞的生长发育两部分构成。2.表皮生长因子对鸡等级前卵泡发育的影响家禽卵巢卵泡的选择受内/自/旁分泌因子的影响,由复杂的循环激素和局部因子综合调控。促卵泡素(FSH)和EGF在家禽卵泡发育过程中起决定性作用,具有代表性意义,两者作用的机制及其互作方式值得深入研究。本实验旨在研究EGF对产蛋鸡等级前卵泡发育的调节作用。EGF及其受体(EGFR)mRNA在鸡等级前卵泡高度表达,包括大白卵泡(LWF)和小黄卵泡(SYF),然后随着卵泡的发育逐渐降低。体外悬浮培养的全卵泡经EGF及FSH单独或联合处理24 h后,LWF和SYF的颗粒层和膜层厚度及颗粒细胞密度均显着增加(P<0.05),且以EGF与FSH联合处理组最为显着。EGF和FSH的处理可以提高卵泡中颗粒细胞的有丝分裂率。体外培养的颗粒细胞经0.1～100 ng/ml的EGF或FSH单独处理24 h后出现增殖现象,且增殖强度与剂量正相关。EGF或FSH可以显着增加颗粒细胞核增殖抗原(PCNA)表达和抑制细胞凋亡(P<0.05)。EGF可以显着增加EGFR、FSH受体(FSHR)和细胞周期调控蛋白(CCND1/CDK6和CCNE1/CDK2) mRNA的表达(P<0.05),却明显下调促黄体激素受体(LHR) mRNA的表达(P<0.05)。EGF或FSH引起的颗粒细胞数目和PCNA-LI升高及凋亡发生率降低等效应均被EGFR抑制剂AG1478所拮抗。以上研究结果表明,EGFIEGFR在鸡卵泡发育过程中表达具有阶段特异性；EGF通过促进细胞有丝分裂、抑制细胞凋亡、调控细胞周期及协同FSH而促进鸡等级前卵泡颗粒细胞的增殖,从而调节等级前卵泡的发育。3.碱性成纤维细胞生长因子对鸡胚卵巢和等级前卵泡发育的影响bFGF是一种局部自分泌或旁分泌的有丝裂原,参与调节组织发育和细胞功能的不同过程。本实验首先观察bFGF的受体(FGFR1)在鸡胚卵巢和成年产蛋鸡等级前小黄卵泡中的表达情况,然后观察bFGF对鸡胚卵巢生殖细胞和等级前卵泡颗粒细胞发育的影响。结果表明,FGFR1在]8日胚龄鸡卵巢的皮质和髓质的细胞中广泛表达,在鸡小黄卵泡的颗粒层中强表达。在体外,bFGF(0.1-100ng/ml)对鸡胚卵巢生殖细胞和小黄卵泡颗粒细胞呈剂量依赖方式增殖,但这种增殖作用被FGFR1抑制剂(SU5402)显着阻断；蛋白激酶C(PKC)激活剂佛波酯(PMA)能显着增强bFGF (10 ng/ml)的促上述细胞增殖作用(P<0.05),PKC抑制剂H7却可以显着抑制此作用(P<0.05)；而蛋白激酶A (PKA)激活剂佛司可林(FRSK)和PKA抑制剂H89对此作用没有显着影响。此外,向鸡胚内注射bFGF后对细胞计数的结果进一步证实了bFGF可以促进鸡胚卵巢生殖细胞的增殖。经bFGF (10 ng/ml)处理后,鸡等级前小黄卵泡颗粒细胞细胞周期调控基因CCND1ICDK6和CCNE1ICDK2 mRNA丰度显着升高,而H7可显着抑制bFGF上调以上四种基因表达的作用。bFGF通过与细胞膜表面受体FGFR1结合,启动PKC信号转导途径,调控细胞周期,发挥促细胞增殖作用,从而调节鸡胚卵巢生殖细胞和等级前卵泡的发育。4.干细胞因子对鸡等级前卵泡膜细胞增殖的影响SCF是最早发现的促进卵泡募集的旁分泌因子,在卵巢中,主要由颗粒细胞表达,被誉为“膜细胞的组织者”,参与膜细胞的募集和分化。本文通过体外细胞培养和免疫组化方法探讨SCF对鸡等级前卵泡膜细胞增殖作用及参与的信号转导途径。鸡小黄卵泡膜细胞在体外预培养16h后,经SCF(0.1～100ng/ml)处理24 h后膜细胞显着增殖(P<0.05),其凋亡发生率亦被显着抑制,上述效应呈现出一定的剂量依赖性。SCF处理可以增加膜细胞c-Kit的表达,同时SCF的促增殖作用被c-Kit抗体所抑制。向培养体系中添加PKC信号转导途径的激活剂PMA或抑制剂H7后,SCF促膜细胞增殖作用将分别被显着增强或抑制。PKA信号转导途径激活剂FRSK和抑制剂H89对SCF的促膜细胞增殖作用无明显影响。以上结果表明,SCF通过与细胞表面c-Kit结合,在PKC信号转导途径参与下,发挥其促小黄卵泡膜细胞增殖的作用,从而调节等级前卵泡的发育。5. Ghrelin对鸡等级前卵泡发育的影响Ghrelin是一种主要由胃肠道分泌产生的多肽,具有促进生长激素分泌、促进摄食、参与能量代谢等多种生理作用。近年来研究表明,Ghrelin及其受体(GHSR)在卵巢组织中的表达并在卵泡发育中起调节作用。本实验旨在研究Ghrelin对产蛋鸡等级前卵泡发育的调节作用。首先通过RT-PCR法检测卵泡GHSR的表达情况,然后利用全卵泡培养和颗粒细胞单独培养模型结合组织学和免疫组化方法探讨了Ghrelin对鸡等级前卵泡形态和颗粒细胞增殖的影响及相关机制。结果表明,GHSR mRNA在颗粒层和膜层上均有表达,其表达量随着卵泡的发育先而逐渐上升,至LWF和SYF阶段升至最高,随后逐渐降低。悬浮培养的卵泡经100 ng/ml的Ghrelin处理24 h后,LWF和SYF的颗粒层和膜层厚度及颗粒细胞密度均显着增加(P<0.05)。鸡小黄卵泡的颗粒细胞在体外预培养12h后,用1-1000 ng/ml的Ghrelin处理24 h,细胞增殖效应呈现出剂量依赖性。颗粒细胞经100 ng/ml的Ghrelin处理后,PKA和PKC阳性率显着上升(P<0.05)；H89及H7能够显着抑制Ghrelin的促颗粒细胞增殖作用,而FRSK及PMA作用正好与之相反。同时,体外培养的颗粒细胞和悬浮培养卵泡的颗粒细胞中层粘连蛋白(LN)和缝隙连接蛋白43(C×43)的标记率显着提高(P<0.05)。上述结果提示,Ghrelin可通过PKA和PKC信号转导途径和提高LN和Cx43的表达以增强颗粒细胞连接功能,促进鸡等级前卵泡颗粒细胞的增殖,从而调节卵泡发育。总之,本实验通过形态学和免疫组化方法研究了产蛋鸡卵巢发育过程中卵泡形态学变化特点；通过将局部生长因子(EGF、bFGF和SCF)及Ghrelin作用于全卵泡或不同卵泡细胞体外培养,发现他们分别与各自的受体结合并通过蛋白激酶信号途径促进细胞增殖,揭示了上述卵巢局部性促生长因子对卵泡发育的调控作用及其机理。这些结果必将为阐明家禽卵泡发育和优势卵泡选择的调控机理及提高家禽繁殖性能奠定一定的理论基础。
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