黄冰艳[1]2004年在《水稻淀粉极限糊精酶基因RNAi载体构建及其遗传转化》文中指出淀粉是许多谷类作物籽粒的重要贮藏物质,是人类主要的热量来源,它作为工业原料广泛应用于食品、医药等工业中。淀粉的功能和用途由其结构和特性所决定,葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉脱支酶是参与淀粉生物合成的关键酶。基因工程技术的发展使通过调控淀粉合成关键酶活性,进而定向改变淀粉组成和结构成为可能,转录后基因沉默技术(PTGS)或RNA干扰技术(RNAi)为实现这一目标提供了新的途径。 通过构建RNAi载体抑制水稻淀粉脱支酶基因的表达研究,获得如下结果: 1.经酶切、序列测定及Southern杂交证实,成功构建出水稻极限糊精酶RNAi载体——胚乳特异表达启动子启动、含intron的水稻极限糊精酶基因iHP载体。 2.获得抗性再生株系29个,经RCR及Southern杂交检测,28个水稻转基因再生株系含有所构建的iHP结构。 3.以极限糊精酶为抗体对转基因株系胚乳发育期籽粒蛋白质进行Western杂交结果显示,该iHP结构在胚乳发育期表达,减少了极限糊精酶的积累,获得不同沉默效果的转基因株系,012号株系籽粒极限糊精酶积累小于野生型的10%,表明所构建载体表达效果良好。 4.水稻反转录转座子Tos17插入突变151株系中,极限糊精酶基因位点的Tos17插入并未使该基因失活,Tos17插入突变纯合体中极限糊精酶积累与野生型相同,可能与插入位点位于intron有关。
韦克苏[2]2012年在《花后高温对水稻胚乳淀粉合成与蛋白积累的影响机理》文中认为花后高温是影响稻米品质的主要气候因子,同时也是制约许多高产品种产量潜力发挥与品质稳定的逆境因素之一。本文在前期研究工作的基础上,以品质性状的生态表现具有代表性(高温敏感和高温钝感)、且生育期和其他农艺性状相仿的两个早籼稻品种(嘉935和嘉353)为材料,利用大田异季种植和人工气候箱控温处理试验,对不同温度处理下稻米胚乳的淀粉粒径、链长精细结构和贮藏蛋白(蛋白亚基、氨基酸组分等)等品质理化指标的差异变化进行比较分析,并结合cDNA微阵列、定量RT-PCR和蛋白表达分析等技术,对花后高温胁迫下水稻胚乳淀粉合成与蛋白积累代谢途径的相关基因表达模式与表达谱进行了检测,以揭示花后高温对水稻胚乳淀粉精细结构与贮藏蛋白组分影响的效应机理。主要结果如下：1、花后高温所导致的稻米蒸煮食味品质变劣现象(如糊化温度升高和胶稠度下降等),与不同温度处理下稻米淀粉的粒径分布差异、链长精细结构之间存在着密切联系。花后高温胁迫对稻米淀粉粒粒径的影响表现为：导致小型淀粉粒和中型淀粉粒的数量与相对比例降低,大型淀粉粒的数量与相对比例显着增大,淀粉粒的平均粒径增大,这是稻米糊化温度与糊化热焓值明显升高的重要因素。此外,花后高温会导致稻米直链淀粉的聚合度降低、支链淀粉长B链组分(B3链,DP≥37)的比例上升,短B链组分(B1链,DP13-24)的比例有所下降。与稻米表观直链淀粉含量(AC)的品种类型间差异相似,花后高温胁迫对稻米B2链(DP25-36)与短A链(DP5-12)也表现出一定的品种类型差异。低AC类型品种嘉935在花后高温下的B2链比例上升、短A链比例下降,而高AC类型品种嘉353呈相反趋势。2、花后高温下发育胚乳中的蔗糖转运体(SUT)和蔗糖合成酶(SuSy)主要同工型基因(SUT1, SUT2, SuSy2和SuSy3)的相对表达量降低,但质体转化酶基因(CIN2和CIN7)的相对表达量上升,高温胁迫破坏发育胚乳糖卸载代谢环节两个关键蔗糖合成酶和质体转化酶间的平衡,降低蔗糖的卸载效率；此外,高温胁迫下己糖激酶类的几个主要功能基因(HxKI和HxKⅡ等)上调表达,而果糖激酶类和糖信号作用蛋白的相关功能基因(FrK Ⅰ和FrKⅡ)下调表达,两类基因(HxK类和FrK类)在高温胁迫下的相对表达量呈“此消彼长”变化,说明花后高温抑制己糖磷酸化代谢途径,并改变发育胚乳中的有关糖信号途径及其应答机制,不利于淀粉的合成代谢。3、花后高温对水稻胚乳淀粉精细结构的影响效应涉及到淀粉合成代谢途径多个功能基因及相应同工型的特异性表达。淀粉合成酶基因(如SSS Ⅰ、SSSⅢa、SSSⅣa等)呈上调表达,淀粉合成酶与分支酶基因(如SSS Ⅱa、SBE Ⅰ、SBEⅢ等)呈下调表达,异淀粉酶基因ISA1的相对表达量上升,普鲁兰酶基因PUL的相对表达量下降,花后高温对稻米淀粉精细结构的影响效应(例如,B3链比例上升、B1链比例下降,等)受上述功能基因与同工型的共同调控,而SSS Ⅰ、SSS ⅡaQ两同工型基因对支链淀粉链长合成的催化作用最为明显。此外,GBSS Ⅰ是在发育胚乳中相对表达量较高的颗粒结合型淀粉合成酶基因同工型,高温胁迫下,GBSS Ⅰ在低直链淀粉品种嘉935胚乳中的相对表达量下降,而高直链淀粉品种嘉353中则呈相反趋势,这与不同温度处理下两水稻品种胚乳中的直链淀粉含量变化趋势是一致的。4、水稻籽粒糊粉层临时淀粉的正常降解,对胚乳淀粉合成所需的碳源和能量保障具有重要意义。花后高温胁迫对临时淀粉降解代谢(包括磷酸化降解和非磷酸化降解两条途径)相关基因的影响主要表现为：“上游基因”(如GWD、AMY3和SEX4等)在高温胁迫下呈上调表达,导致代谢中间产物的快速累积；而“下游基因”(如ISA3、PUL和MEX1等)大多呈下调表达,抑制淀粉降解中间产物进一步分解。“上游基因”和“下游基因”的表达模式引起淀粉降解中间产物在糊粉层的过量累积,影响稻米糊粉层的营养转运功能,这可能是导致花后高温胁迫下胚乳淀粉合成所需的碳源和能量供应不足,并引起总淀粉积累量降低的重要原因。5、花后高温胁迫下,水稻籽粒中的蛋白和氨基酸组分含量在灌浆前期普遍上升；醇溶蛋白含量在灌浆后期下降,蛋白和氨基酸组分含量差异主要表现在灌浆后期。高温加速蛋白体的形成,改变谷蛋白和醇溶蛋白亚基的相对含量,其中,醇溶蛋白13kDa亚基相对含量略微降低,17-19kDa亚基相对含量上升,谷蛋白亚基和谷蛋白前体相对含量均上升。水稻胚乳蛋白积累不仅受蛋白亚基前体基因的调控,同时还受到蛋白质修饰相关基因的调控。与蛋白亚基前体基因相比,蛋白质修饰调控和逆境防御相关基因对高温胁迫更为敏感。其中,内质网细胞腔结合蛋白基因(BiP)在高温下的上调表达有利于醇溶蛋白的折迭与聚集,加速蛋白体1的形成：蛋白质二硫同分异构酶基因(PDI)、水稻碱性亮氨酸拉链蛋白基因／醇溶谷蛋白框结合蛋白基因(RISBZ1/RPBF)组合的上调表达与高温胁迫下的蛋白前体聚合过程和逆境防御代谢有关。
弓淑芳[3]2011年在《木薯SBEⅠ、SBEⅡ基因RNA干扰载体的构建及农杆菌介导的遗传转化》文中研究表明淀粉分支酶(SBE)是淀粉合成中的关键酶之一,它具有双重功能：断开α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键。在淀粉合成过程中,它一边把直链淀粉和支链淀粉直链区上的葡聚糖短链切下来,同时它又能把切下来的短链通过α-1,6糖苷键连接于受体链上,这样就不断的形成支链淀粉。抑制木薯中淀粉分支酶(SBE)的活性,可以降低淀粉中支链淀粉的生产量,获得高直链淀粉的木薯新品种,为工业需求提供足够的原材料。本研究主要内容和结论如下：1、构建了块根特异启动的可编码发夹结构的RNAi表达载体。本研究分别选取SBEⅠ、SBEⅡ基因的开放阅读框架中的一段编码序列为靶基因,通过重迭延伸PCR方法,扩增出融合SBEⅠ、SBEⅡ基因片段的大片段SⅢ,并将其正向、反向插入植物RNAi表达载体pART27中,同时还克隆了块根特异性启动子Sporamin,取代了原来载体上自有的35S启动子,构建了块根特意启动的可编码发夹结构的RNAi表达载体。根据酶切鉴定,确认载体构建成功。通过冻融法,将RNAi表达载体3s-pART27导入农杆菌菌株GV3101中,为下一步实验做准备。2、本研究在体细胞胚胎发生再生体系的基础上,利用体胚做原材料,在含有毒莠定(12mg/L)和维生素的GD培养基上,诱导出木薯脆性胚性愈伤。3、通过含有3s-pART27载体的农杆菌工程菌GV3101介导,对华南8号木薯品种的脆性胚性愈伤共计109块做了遗传转化；经过壮观霉素抗性筛选,共出芽12株,但经过生根实验和PCR检测,只获得阳性转化子1株。4、抗性筛选试验证明,木薯对壮观霉素比较敏感,不定芽生成选择压力为17.5mg/L,生根选择压力为7.5mg/L实验证明,木薯体胚诱导脆性胚性愈伤的方法基本可行,但是诱导成功率还比较低,每块体胚上能出现的脆性胚性愈伤仅能覆盖体胚表面积的1/5-1/3,需要进一步优化各项条件；转化过程中,出芽率还是相对较高的,平均每皿约10块脆性胚性愈伤,可以出1-2个芽,但是能通过生根实验的比例低,需要进一步优化农杆菌介导的转化条件,以及转化后胚的恢复、再生条件。
刘光快[4]2013年在《蛋白二硫键异构酶和淀粉合成酶基因沉默对水稻耐热及结实特性的影响》文中研究指明高温胁迫是制约水稻产量潜力发挥和品质稳定的主要逆境因素之一,它对水稻产量和品质形成的影响作用,与水稻‘库”、‘源”器官中的碳、氮代谢过程存在着密切联系。本实验室的前期研究工作表明,蛋白二硫键异构酶基因(PDI)、可溶性淀粉合成酶的SSSⅠ和SSSⅢa基因,不仅是水稻“库”器官中的贮藏蛋白积累和淀粉合成途径的重要调控基因,而且对高温胁迫的响应也表现较敏感,可能是高温胁迫对稻米品质形成及其优劣产生影响的几个重要功能基因位点。为此,本文构建了淀粉合成酶SSSⅠ和SSSⅢa基因的RNAi沉默载体,以及PDI基因的RNAi沉默和超表达载体,并通过转化日本晴的愈伤组织,获得其转基因水稻植株,在此基础上,结合水稻在不同生育时期的高温胁迫试验,对上述基因沉默或超表达后的有关生理生态特征及相关基因的表达模式进行了研究分析。主要研究结果如下：1.以野生日本晴的发育籽粒为材料,通过PCR法克隆了PDI基因保守区450bp大小的靶标序列作为干扰区段,构建了含有内含子hpRNA (ihpRNA)的双元表达载体pTCK303-RiOsPDI,经农杆菌介导转化日本晴,获得8株转基因植株；通过在T0代对其潮霉素(Hyg)抗性基因的PCR鉴定及Southern杂交检测,确证携带有干扰片段的T-DNA区已整合到水稻基因组中,且在转基因T1代符合3：1的分离模式：半定量RT-PCR和荧光定量PCR的检测结果表明,PDI基因沉默转基因阳性植株不同器官中的PDI表达量均显着降低,尤其是其籽粒中的PDI表达量较微,几乎能引起靶基因80%左右的沉默：对转基因T2代植株的高温结实特性和籽粒理化品质的检测结果表明,PDI基因沉默会引起水稻的耐热性显着下降,在高温肋迫处理下的结实率大幅度降低,但其在常温处理下的结实率与对照之间无显着差异。此外,PDI基因沉默后,稻米的透明度下降、垩白度有所增加,但对籽粒粗蛋白总量和直链淀粉含量的影响不甚明显。2.以PCR法从日本晴发育胚乳中克隆了水稻PDI基因编码区(coding sequence region,CDS),目标片段为1631bp,包含了PDI基因的全表达序列,构建了Ubiquitin启动子驱动的超表达载体pTCK303-OsPDI,并转化日本晴成熟胚的愈伤组织,获得有9株转基因阳性植株,T1代半定量RT-PCR检测结果显示,PDI基因沉默后,其幼苗器官中的PDI表达量显着低于其野生对照植株,而PDI基因的超表达则存在相反效果,表现出其抑制或促进PDI基因表达的效果；水稻苗期的高温生态试验结果揭示,PDI基因在高温胁迫下呈上调表达,但持续高温胁迫会引起PDI基因表达量的下降,但Bip基因在高温胁迫前期的表达量较低,随着处理时间的延长,其相对表达量大幅升高,与PDI基因呈“此消彼长”的变化趋势,两者可能在水稻抵御高温胁迫响应过程中起“互补”作用。3.利用PCR法分别克隆了水稻淀粉合成酶基因SSS Ⅰ和SSS Ⅲa保守区399bp和389bp大小的靶标序列作为干扰区段,分别构建了含有内含子hpRNA (ihpRNA)的双元表达载体pTCK303-RiOsSSS Ⅰ和pTCK303-RiOsSSSⅢa,转化日本晴后,分别获得了12株和13株SSSⅠ和SSSⅢa基因沉默的阳性植株。半定量RT-PCR分析结果显示,SSSⅠ和SSSⅢa基因沉默后,T1代转基因植株苗期叶片中的SSSⅠ或SSSⅢa基因在常温下表达量均显着低于其对照植株,分别都起到了较明显的干扰效果,而其他同工型基因(如SSSⅡb、SSSⅢb、 SSSⅣa、SSSⅣb)的表达水平并未受明显影响；在高温胁迫下,SSS I基因RNAi沉默植株可溶性糖含量有所上升,其原因可能是SSSI基因受到抑制后由蔗糖转化为淀粉效率降低所导致；而高温胁迫下SSS I和SSSⅢa基因RNAi沉默叶片器官中的SSSⅡb表达量均有所上升,可能是高温胁迫下SSSⅡb基因对SSSⅠ和SSSⅢa基因功能缺失的一种补偿效应。
陈国梁[5]2008年在《以gbss、ssⅢ和ssⅡ为靶标的RNAi载体构建及转基因马铃薯植株的获得》文中提出马铃薯(Solanum tuberosum L)是淀粉生产的重要原料,其淀粉具有优良的特性,广泛应用于工业、食品及化工行业。但在大多数应用领域中,一般要求淀粉具有较低的糊化温度和较弱的凝沉(老化)性,因而淀粉的糊化和凝沉特性成为其应用的重要参考指标,而这两种性质主要与直链淀粉与支链淀粉比例、淀粉链长以及淀粉的结构有关。因此,培育具有较低糊化温度和优良凝沉特性的品种,对于提高马铃薯淀粉的应用范围和促进产业的发展具有重要的意义。随着人们对淀粉生物合成途径相关酶生化代谢途径及分子机理研究的不断深入,使得应用基因工程技术调控淀粉合成过程中相关酶基因的表达,从而使得降低淀粉糊化温度和提高冻融稳定性成为可能。为此,本研究开展了以RNAi技术对马铃薯块茎内源gbss、ssⅢ和ssⅡ基因进行同时干扰,期望通过改变淀粉合成相关酶的活性,进而改变块茎中积累的淀粉分子组成,获得糊化温度低且冻融稳定性更好的加工型马铃薯品种。经过研究,已取得了如下结果:(1)应用blast及分子生物学软件DNAstar对gbss、ssⅡ和ssⅢ基因的cDNA序列同源性进行分析比较,分别从gbss、ssⅢ和ssⅡ基因cDNA片段ORF中筛选出了1～261、2 164～2 407、161～441之间的序列片段作为靶标,采用一步PCR法将靶标基因片段进行融合,得到了大小为785 bp的gbss、ssⅡ和ssⅢ叁个基因片段的融合基因。(2)为便于构建RNAi载体,分别以LS-8质粒(含gbss基因5'侧翼序列)、LS-4质粒(含patatin启动子序列)为模板,亚克隆了马铃薯块茎颗粒结合型淀粉合成酶gbss基因5'侧翼序列及马铃薯patatin启动子,并在这两个启动子5'和3'加入了Sac I和Xho I限制性酶切位点。(3)分别构建了以gbss基因5'侧翼序列和patatin组织特异性启动子驱动的含有“正向gbs3s2融合片段-pdk内含子-反向gbs3s2融合片段”的植物表达载体pART-GF、pART-PF,并将其成功导入根癌农杆菌LBA4404。(4)选用马铃薯“NHD3”、“NF”和“NC”的茎段作为外植体材料,在MS培养基基本成分的基础上,对生长激素的浓度和配比进行了优化,筛选出有利于受体材料高效再生的培养基配方,其中有利于茎段愈伤诱导的培养基为:MS0 + 1.0 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L NAA(NHD3);MS0 + 1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA(NC);MS0 + 1.0 mg/L 6-BA + 0.4 mg/L NAA(NF)。初步建立并优化了遗传转化体系。(5)用携带pART-GF植物表达载体的农杆菌对NHD3、NF和NC叁个优良马铃薯品种进行了遗传转化,初步获得了抗性植株,经PCR检测有10株呈阳性,其中在NC、NF和NHD3品种上分别得到的转基因阳性植株为2株、3株和5株。
陈坚[6]2008年在《水稻中一个SUSIBA2相似基因的功能研究》文中认为禾谷类作物的胚乳具有重要的经济价值。淀粉是谷类作物胚乳中最主要的贮存碳源,它由直链淀粉和支链淀粉混合而成的,两者在胚乳中的比例决定了禾谷类作物谷粒的质量。胚乳中淀粉的生物合成主要由腺嘌呤-葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和脱分支酶(DBE)这4种酶参与完成的,其中后两者在支链淀粉的形成过程中起重要作用。大麦糖信号因子SUSIBA2是一个WRKY家族的转录因子,它能够识别大麦的一种淀粉脱分支酶基因——异淀粉酶基因isol和一种淀粉分支酶基因sbeIIb的启动子区域上的糖响应元件SURE,激活isol基因和sbeIIb基因的表达,从而影响胚乳中淀粉的积累状况。为了了解水稻中是否存在与大麦相似的淀粉合成调控机制,本论文进行了四个方面的研究:1)构建了由ubi启动子驱动的SUSIBA2基因的正反义表达载体,通过农杆菌介导对水稻进行了转化。用PCR对再生苗的潮霉素基因(hpt)、目的基因SUSIBA2、启动子ubi等均进行检测,共证实获得4株转入正义表达的SUSIBA2基因的T_0代植株。2)根据SUSIBA2的序列,从水稻基因组序列中搜索到一个与其相似的WRKY基因,它由6个外显子和5个内含子组成。利用PCR方法从水稻基因组DNA中克隆出该基因的第3外显子的片段,长度为455bp,它包含1个WRKY保守结构域。以此作为干扰序列,构建了RNA干扰载体,并对水稻进行了遗传转化。对再生苗潮霉素基因(hpt)的PCR检测,共获得16株T_0代阳性植株,转化率为8%。于田间种植至结实,有2株结实率为0,有11株转基因植株的结实率为0.5%-28%之间,表明T_0转基因植株结实状况极不正常。将收获的正常种子继续播种至出苗,再进行PCR检测,发现有6株在其T_1代单株间出现约3∶1的hpt基因分离比。3)在非编码区设计引物,采用RT-PCR技术,从水稻幼穗中克隆到该基因的cDNA,长度为1921bp,其中ORF长1755bp,可编码584个氨基酸。其蛋白序列具有典型的双WRKY结构域,与大麦的SUSIBA2相似度达81%。我们将该基因命名为SUSIRI。Southern分析表明,SUSIRI在水稻基因组中只有一个拷贝。Northern blot分析结果显示,该基因在稻穗中的表达活性在水稻抽穗至种子成熟的发育过程中逐渐减弱。这与SUSIBA2基因在大麦胚乳中的表达模式有着明显的不同。4)已证实水稻淀粉分支酶sbe1基因是在胚乳中特异表达的。本研究从水稻基因组中克隆了长度为849bp的sbe1基因的启动子区域片段。利用植物cis调控元件数据库PLACE对克隆到的sbe1启动子序列进行了分析,共发现存在有77种可能的调控元件,包含有W-box。但未发现其上存在糖信号应答元件SURE。将克隆的sbe1启动子与前面克隆的SUSIRI基因融合,构建成由胚乳特异启动子驱动的SUSIRI正义与反义表达载体。同时,将SUSIRI基因与Ubi启动子融合,构建成组成型的SUSIRI正义表达载体。为进一步通过转基因手段验证该基因的作用奠定了基础。
张建[7]2008年在《水稻淀粉合成关键酶基因的克隆及分子调控研究》文中研究指明淀粉是许多粮食作物的种子、马铃薯块茎及多种植物块根的主要组成成份,在人类生活中起着举足轻重的作用。开展淀粉合成相关基因的研究是阐明淀粉合成机理以及利用基因工程改良淀粉品质的基础,具有重要的理论和应用价值。本文根据发表在GeneBank中的基因序列,设计特异性引物,利用RT-PCR方法,从粳稻品种日本晴未成熟种子的cDNA中克隆到完整的水稻淀粉粒结合型淀粉合成酶(Granule-bound starch synthaseⅠ,GBSSⅠ,即WAXY)蛋白质编码区cDNA及完整的水稻淀粉分支酶3(Starch branching enzyme 3,RBE3)蛋白质编码区cDNA;利用PCR方法从粳稻品种日本晴基因组DNA中克隆到水稻Waxy基因和水稻RBE3基因的片段各一个。克隆的水稻Waxy基因蛋白质编码区(coding sequence region,CDS)cDNA全长1830bp,编码610个氨基酸。编码序列与已发表的水稻淀粉粒结合型淀粉合成Ⅰ蛋白质编码区cDNA序列相比,核酸序列有两个核酸的突变,推导的氨基酸序列也有两个氨基酸的突变,但没有影响到蛋白质的正常活性。从水稻基因组DNA中克隆到的水稻Waxy基因片段长206bp,与已发表序列完全一致。克隆的水稻RBE3基因蛋白质编码区(coding sequence region,CDS)cDNA全长2478bp,编码826个氨基酸。编码序列与已发表的水稻RBE3基因蛋白质编码区cDNA序列相比,核酸序列有两个核酸的突变,推导的氨基酸序列也有一个氨基酸的突变,但没有影响到蛋白质的正常活性。从水稻基因组DNA中克隆到的水稻RBE3基因片段长195bp,与已发表序列完全一致。利用获得的完整水稻Waxy基因蛋白质编码区cDNA及完整的水稻RBE3基因蛋白质编码区cDNA,以克隆的谷蛋白A3基因(GluA3)启动子控制基因的表达,构建了这两个基因的过量植物表达载体;再根据siRNA选取原则,选择了水稻Waxy基因及水稻RBE3基因片段,分别以GluA3启动子和高分子量麦谷蛋白基因(HMW)启动子调控这两个基因的转录,构建了这两个基因的siRNA植物表达载体;构建了基因过量表达和RNAi结合的多基因表达载体。用农杆菌介导的方法对水稻品种中花11进行转化,获得了41株RBE3基因的RNAi转基因植株。PCR检测及Southem杂交分析转基因植株,表明抗除草剂基因(Bar)和目的基因均整合到水稻基因组中。半定量RT-PCR检测显示RBE3基因的表达量明显降低。对转基因植株籽粒直链淀粉含量和千粒重分析表明胚乳中的直链淀粉含量有明显的提高,平均提高140%,单株最高提高了238%,而转基因水稻的千粒重显着降低,平均下降值47%。
吴兴超[8]2017年在《水稻PUL和SSⅢ-1下调对淀粉合成酶基因表达及胚乳淀粉含量的影响》文中研究说明水稻是主要的粮食作物之一,种植面积广。随着生活水平的提高,人们对稻米的蒸煮和食味品质要求也越来越高。淀粉作为稻米的主要储藏物质,直链淀粉和支链淀粉占有比例的不同会直接影响大米蒸煮食味品质,继而影响稻米的的经济价值,因此改良稻米品质在育种上显得尤为重要。在淀粉合成途径中,直链和支链淀粉的合成分别受不同基因控制。SSIII-1和PUL是两个在支链淀粉合成途径中的关键基因。SSIII-1是可溶性淀粉合成酶之一,在淀粉合成的过程中主要是参与分支链的合成从而延长支链淀粉;PUL是去分支酶之一,负责剪切各个分支链达到合适的长度。研究SSIII-1和PUL基因对稻米品质理化指标的变化以及支链淀粉合成过程具有不同的作用,通过对转化植株SSIII-1和PUL基因表达量的研究,了解和研究稻米淀粉的生物合成过程SSIII-1和PUL基因下调对其他淀粉合成酶相关基因以及对稻米蒸煮和食味品质的影响。本文中通过构建SSIII-1和PUL基因靶序列的RNAi表达载体,通过农杆菌介导转化方法侵染低直链淀粉材料籼稻R372愈伤组织,下调SSIII-1和PUL的表达,降低支链淀粉的合成,从而提高直链淀粉的含量。研究了RNAi干扰植株淀粉合成酶基因在转录后水平的调控。同时对转基因植株和对照植株成熟种子的淀粉含量进行测定,从而更深入地理解淀粉合成过程中相关基因之间的表达关系。具体研究结果如下:1.根据NCBI数据库查阅水稻SSIII-1和PUL基因序列,确定了淀粉合成酶(SSIII-1)和极限糊精酶(PUL)部分序列作为RNAi靶序列设计PCR引物。通过从籼稻R372水稻中同源克隆SSIII-1和PUL基因的200bp正义片段和200bp反义RNAi片段,分别构建SSIII-1和PUL基因的干扰载体PTCK303-SSIII-1和PTCK303-PUL。2.将含有PTCK303-SSIII-1和PTCK303-PUL载体的农杆菌侵染受体籼稻R372成熟胚性愈伤组织,经过潮霉素抗性筛选、分化,获得转化植株。3.通过对转化植株进行潮霉素抗性基因PCR和GUS染色鉴定,确定SSIII-1和PUL基因的RNAi干扰片段整合到受体材料籼型水稻品种R372的基因组上,最终获得RNAi阳性植株。其中获得SSIII-1-RNAi阳性植株2株,PUL-RNAi阳性植株49株。4.大田种植转化材料,通过对T0代阳性植株灌浆后期的胚乳提取RNA进行荧光定量PCR分析,发现当SSIII-1-RNAi阳性植株中SSIII-1基因的表达量比对照材料下降50%,而GBSSI、GBSSII、SSII-1、sbe4的表达量增加,其中GBSS I的表达量增加了7倍,AGPlar、AGPiso、AGPsma、SSI、SSII-2、SSII-3、SSIII-2、SSIV-1、sbe1、sbe3、ISA、PUL的表达量下降;在PUL-RNAi阳性植株中,发现当PUL基因的表达量下降80%,淀粉合成酶基因中AGPiso、GBSSI、SSSIII-1、SSIII-2、sbe1、sbe3、sbe4的表达量增加,GBSSI的表达量增加2倍,淀粉分支酶基因(sbe1、sbe3、sbe4)表达量也显着地增加,AGPlar、AGPsma、GBSSII、SSI、SSII-1、SSII-2、SSII-3、SSIV-2、ISA、PUL的表达量降低。说明下调SSIII-1和PUL基因能够提高直链淀粉合成基因GBSSI的表达。5.分别对部分SSIII-1-RNAi植株和PUL-RNAi植株以及对照植株进行淀粉含量和直链淀粉含量测定。发现在PUL-RNAi植株和SSIII-1-RNAi植株中淀粉含量均有明显地所提高,其中PUL-RNAi植株中淀粉含量增加了330-400 mg/g,SSIII-1-RNAi植株中淀粉含量增加了70-170 mg/g;PUL-RNAi植株和SSIII-1-RNAi植株中直链淀粉含量变化不是很明显,其中PUL-RNAi植株中直链淀粉含量增加了43-61.5 mg/g,SSIII-1-RNAi植株中直链淀粉含量增加了55-56 mg/g。
周冰彬[9]2009年在《赤霉素合成酶基因沉默诱导植物矮化的研究》文中认为矮化和盆栽的木本花卉植物在园林绿化、室内装潢等方面有着重要作用,现有的木本花卉主要以乔木和小乔木为多。在控制木本花卉高生长的因素中,赤霉素合成酶(GA20-oxidase)通过反馈调节赤霉素含量,影响植物的高生长,是最重要的内源影响因子之一。本研究利用反义RNA及RNA干扰技术,在烟草上对GA20-oxidase基因的表达进行抑制,为最终实现木本花卉植物矮化性状的基因工程遗传改良奠定基础。主要研究结果如下:1.从cDNA中克隆烟草NtGA20ox基因,构建了以NPTⅡ为标记基因的反义载体pBIantiW和RNA干扰载体pBIRNAiW;从载体pGEX-4T-2中克隆PttGA20ox基因,构建了以抗除草剂bar基因为标记基因的反义载体pBIbarantiG和RNA干扰载体pBIbarRNAiG。将四个载体转化到根癌农杆菌菌株LBA4404中。2.建立并优化普通烟草W38及转基因烟草GW(转化超量表达PttGA20ox基因)的再生和遗传转化体系。继代培养基:MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+琼脂5.5g/L;生根培养基:1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+琼脂5.5 g/L;分化培养基:MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+琼脂4.8 g/L。3.建立最优遗传转化程序。通过选择剂敏感性试验,确立了叶片不定芽诱导的选择剂浓度为:Kan 75 mg/L,Glu 0.5 mg/L。茎段增殖和生根的选择剂浓度为Kan150 mg/L,Glu 1.0 mg/L。结合Cef对农杆菌的抑菌效果,在遗传转化和再生、扩繁、生根时都选择250 mg/L为最适抑制浓度。对预培养时间、菌液侵染时间、菌液浓度、共培养时间、延迟选择时间、AS浓度等影响转化的因素进行研究,结果表明,预培养时间、延迟选择时间、AS浓度对转化的影响不大;当菌液浓度OD_(600)=0.6时,10～15 min为比较合适的菌液侵染时间,此时抗性芽的转化效率最高;共培养最适宜时间为2 d。4.对四种转化苗烟草AW(转反义NtGA20ox基因)、烟草RW(转反向重复NtGA20ox基因)、烟草AG(转反义PttGA20ox基因)、烟草RG(转反向重复PttGA20ox基因)进行叶片的再分化培养检测和分子生物学鉴定,证明目的片段已经插入到转基因植株基因组DNA中。5.对转基因植株进行移栽和表型性状的统计与观测。转基因植株AW、GW与对照W38相比,明显矮化,茎段增粗,节间距变短,叶片变大,生根时间推迟且根数量相对稀少。转基因植株AG、RG与对照GW相比也呈现矮化状态,节间距明显缩短,茎段粗细变化不明显,叶片细长与对照相似,根稀少,生根时间推迟。6.对转基因植株进行细胞学比较。显微观察显示,转基因植株在细胞层面上与对照植株有显着差异,生长初期叶片细胞更为致密,茎段细胞长度小于对照,实施RNA干扰的细胞甚至成为椭圆形,细胞长度远远小于对照。7.对转基因植株进行内源激素含量的测定,并对转化苗进行外源GA喷施实验。内源激素测定结果表明,转化苗体内ABA、ZR的含量与对照相比没有显着差异,而其体内的IAA、GA_3、GA_4含量明显低于对照。外源GA喷施实验表明,转基因造成的GA含量降低是可逆转的,外源GA的喷施,可以提高植株体内GA的含量,使转基因植株的矮化状态得到恢复。
冉秀华[10]2016年在《稻米淀粉理化性质的研究及通过基因工程提高稻米直链淀粉含量》文中提出改良稻米的蒸煮食用品质已成为近年来我国水稻研究的热点和重点,稻米的蒸煮食用品质主要由直链淀粉含量(AC)决定。为了提高直链淀粉含量,目前主要通过两种途径：第一,诱导淀粉合成相关基因突变,从中选择高直链淀粉含量的突变体；第二,利用转基因的方法人工调控淀粉合成相关基因的表达,从而改变稻米淀粉的结构和组成,最终培育符合生产需求的水稻新品种。为了改良并提高现有水稻品种的直链淀粉含量,我们主要进行了以下几方面的研究,主要研究结果如下：1.本研究分别测定了5个不同AC品种稻米籽粒淀粉的理化性质,结果表明它们籽粒淀粉颗粒特征和糊化温度都不相同。接下来我们对它们发育种子(开花后3、5、7天)的10个淀粉合成关键基因进行了Q-PCR检测,结果表明,Wx、RBE1和RBE3在水稻发育中的种子中表达丰富且在不同品种间差异较大,其中Wx基因在发育中胚乳的表达丰度与AC值的大小呈正相关。2.本实验室从通过Tilling筛选和基因测序一批经EMS诱变后的中花11的突变体群体,鉴定出一个在BE Ⅱa (RBE4)基因的第四个外显子上有一个G到A的单碱基突变的纯和突变体,这个碱基的改变导致此处的氨基酸由丝氨酸(S)变为了天冬酰胺(N)。对BE Ⅱa基因进行蛋白质结构域分析发现,该突变位点位于蛋白质的非保守区域中,接下来通过对中花11和突变体的BE Ⅱa基因做定量表达分析,结果也表明该基因表达量在二者之间并无明显差异。对该突变体稻米淀粉的理化性质检测结果表明,该突变体的AC与野生型相比有一定程度增加,平均增加比例为4.97%,且突变体的糊化温度类型也由原来野生型中等(70-74℃)变为低等(≤70℃)。对它们的淀粉颗粒进行电镜扫描观察发现突变体的淀粉颗粒与野生型相比变大且轮廓不明显,此外它们的大小、形态相同且无规律,但排列较为紧凑。3.根据查阅的文献资料以及我们前期的实验结果,我们发现Wx、RBE1和RBE3这叁个基因对水稻籽粒的直链淀粉含量影响较大。我们利用RT-PCR的方法,从籼稻品种IR36的未成熟种子中克隆到完整的水稻Wx基因的cDNA编码区、水稻胚乳特异性启动子GluB1以及水稻淀粉分支酶基因RBE1基因片段。构建了Wx过表达与RBE1干涉结合的多基因复合表达载体,并以GluB1启动子调控这两个基因的转录表达。将构建好水稻多基因表达载体导入受体籼稻品种IR36ae (amylose extender),筛选鉴定阳性转基因植株。
参考文献：
[1]. 水稻淀粉极限糊精酶基因RNAi载体构建及其遗传转化[D]. 黄冰艳. 西北农林科技大学. 2004
[2]. 花后高温对水稻胚乳淀粉合成与蛋白积累的影响机理[D]. 韦克苏. 浙江大学. 2012
[3]. 木薯SBEⅠ、SBEⅡ基因RNA干扰载体的构建及农杆菌介导的遗传转化[D]. 弓淑芳. 海南大学. 2011
[4]. 蛋白二硫键异构酶和淀粉合成酶基因沉默对水稻耐热及结实特性的影响[D]. 刘光快. 浙江大学. 2013
[5]. 以gbss、ssⅢ和ssⅡ为靶标的RNAi载体构建及转基因马铃薯植株的获得[D]. 陈国梁. 甘肃农业大学. 2008
[6]. 水稻中一个SUSIBA2相似基因的功能研究[D]. 陈坚. 福建农林大学. 2008
[7]. 水稻淀粉合成关键酶基因的克隆及分子调控研究[D]. 张建. 安徽农业大学. 2008
[8]. 水稻PUL和SSⅢ-1下调对淀粉合成酶基因表达及胚乳淀粉含量的影响[D]. 吴兴超. 湖北大学. 2017
[9]. 赤霉素合成酶基因沉默诱导植物矮化的研究[D]. 周冰彬. 北京林业大学. 2009
[10]. 稻米淀粉理化性质的研究及通过基因工程提高稻米直链淀粉含量[D]. 冉秀华. 四川农业大学. 2016
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