汪丽燕1 李滨(通讯作者)2 薄晓通2
(1哈尔滨医科大学附属第四医院 黑龙江 哈尔滨 150001)
(2桂林医学院附属医院消化内科 广西 桂林 541001)
【摘要】 目的：探讨siRNA沉默β-连环素基因对肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡的影响。方法：将SMMC-7721细胞分3组: 阴性对照组(n组)、转染试剂对照组(hd组)及重组质粒组(test组)。其中后者为应用RNA干涉技术设计构建了针对β-连环素mRNA的siRNA重组质粒，通过脂质体转染导入肝癌细胞株SMMC-7721中。用流式细胞技术检测细胞凋亡，半定量RT-PCR检测SMMC-7721细胞caspase-3、bcl-2、survivin mRNA表达。结果：针对β-连环素的siRNA转染肝癌细胞株SMMC-7721后，细胞凋亡率较对照组比明显增加(P<0.05)，caspase-3的mRNA的表达随时间并无明显变化，与对照组比无明显差异(P>0.05);而p-caspase-3的mRNA的表达于48h后明显增加，72h表达量减少，96 h减少至原有水平。bcl-2、survivin mRNA的表达在转染β-连环素的siRNA 48h后明显减少，96h后恢复至原有水平。结论：沉默β-连环素基因可以一定程度上抑制肝癌细胞的生长，促进其凋亡。
【关键词】 肝癌; RNA干扰; β-连环素;细胞凋亡
【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）26-0156-02
引言
研究发现Wnt基因与组织内环境稳定和肿瘤发生有关[1]， Wnt信号转导的关键，胞浆中存在的可溶性的β-连环素是Wnt信号的调节开关[2]。以β-连环素为中心的Wnt信号转导通路是肿瘤发生过程中关键的信号通路之一[3]。本研究通过沉默肝癌细胞株SMMC-7721中的β-连环素基因，揭示肝癌细胞中β-连环素对细胞凋亡的影响，证实Wnt/β-连环素信号传导通路在肝癌发生、发展中的作用及siRNA在肝癌基因治疗方面的作用，为研究肝癌发病机制的网络结构提供理论依据，同时也为肝癌的治疗提供方法及理论依据。
1.材料与方法
1.1 材料
基因扩增仪：肝癌细胞株SMMC-7721：购自于中科院上海细胞所；筛选有效的β-连环素-siRNA重组质粒序列：由上海吉玛制药技术有限公司建立与保存；DMEM及小牛血清为：G ibco产品；限制性内切酶BamH.及H ind ó、Tr izol及RT-PCR相关试剂：购自(invitrogene)；转染试剂HD：为Roche产品；抗β-actin多克隆抗体：为santa产品。
1.2方法
首先，进行细胞培养，采用DMEM培养基{FBS（10%）、温度为37摄氏度、氧气（5%）}来培养肝癌SMMC-7221细胞，并对细胞的生长情况做以观察及记录、每两天更换一次基液，之后做代传培养后取细胞实验；其次是进行重组质粒的转染；三是采用激光共聚焦的显微镜对基因转染率做判定；四是对SMMC-7721的细胞β-catenin-siRNA其表达采用半定量RT-PCR做以监测后再用Western做蛋白含量分析；最终对细胞生长的情况采用MTT做检测。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆而在对细胞凋亡的实验中，前两步骤相同，第三步骤开始为对SMMC-7721的细胞其凋亡采用流式细胞技术做监测；四是对SMMC-7721的细胞β-catenin-siRNA、bcl-2、caspase-3其表达采用半定量RT-PCR（分组）做以监测。
统计学处理 采用SAS9.1软件对数据进行分析，本实验的设计为重复测量，总体均存在交互作用，组内比较采用重复测量分析, 组间比较采用SNK-q检验。以a=0.05为检验水准。P<0.05统计学上有显著差异，P>0.05统计学上无显著差异。
2. 结果
2.1 重组质粒转染SMMC-7721细胞后细胞凋亡情况
β-连环素-siRNA重组质粒转染SMMC-7721凋亡细胞后SMMC-7721细胞凋亡率较对照组比明显增加，细胞凋亡发生于转染后48h, 72h凋亡率达最高, 无时间依赖性，较对照组比明显增加。
2.2沉默β-连环素后肝癌细胞株SMMC-7721中caspase-3、bcl-2、Survivin mRNA表达结果
针对β-连环素的siRNA转染肝癌细胞株SMMC-7721后, 分别在48h、72h和96 h通过半定量RT-PCR法检测caspase-3、bcl-2、survivin mRNA的表达(图2A-D).可见caspase-3的mRNA的表达随时间并无明显变化,与对照组比(P>0.05)；而p-caspase-3的mRNA的表达于48h后明显增加, 72h表达量减少，96h减少至原有水平。bcl-2、Survivin mRNA的表达在转染β-连环素的siRNA 48h后明显减少，96h后恢复至原有水平。
3. 讨论
本实验应用了流式细胞技术检测了肝癌细胞系SMMC-7721在沉默β-连环素基因后48h、72h、96h细胞凋亡情况。结果证实Wnt/β-连环素信号转导通路参与肝癌的形成, 抗凋亡因子bcl-2、Survivin是Wnt/β-连环素信号转导通路的下游靶基因,caspase-3是caspase家族成员中与凋亡的关系最为密切的凋亡相关因子，在肿瘤发生过程中参与细胞凋亡异常的病理过程[4]。bcl-2与细胞的恶性转化[5]。肝肿瘤中有bcl-2异常表达bcl-2与caspase家族有密切关系。沉默β-连环素基因可以有效地抑制bcl-2、Survivin的抗凋亡作用，增加促凋亡因子p-caspase-3的表达而抑制肝癌细胞的无限增殖，在一定时间内对肝癌可以起到治疗作用。上述结果提示沉默β-连环素基因96h后肝癌细胞再次出现增殖,这可能与96h后β-连环素基因表达再次恢复有关，但是否与其他的信号转导通路参与肝癌的发生发展，在沉默β-连环素基因后出现其他信号转导通路的代偿有关，需要我们进一步证实。
【参考文献】
[1] Glinka A, Wu W, Delius H, Monaghan AP, Blumenstock C, Niehrs C. Dickkopf-1 is a member of a new family of secreted proteins and functions in head induction. Nature 1998; 391: 357-362 [PMID: 9450748]
[2] Peifer M, Polakis P. Wnt signaling in oncogeneisis and embryogenesis-a book outside the nucleus. Science 2000; 287: 1606-1609
[3] Kim W, Kim M, Jho EH. Wnt/β-catenin signalling: from plasma membrane to nucleus. Biochem J 2013; 450: 9-21 [PMID: 23343194 DOI: 10.1042/BJ20121284]
[4] Galluzzi L, Kepp O, Kroemer G. Caspase-3 and prostaglandins signal for tumor regrowth in cancer therapy. Oncogene 2012; 31: 2805-2808 [PMID: 21963852 DOI: 10.1038/onc.2011.459]
[5] Thomas S, Quinn BA, Das SK, Dash R, Emdad L, Dasgupta S, Wang XY, Dent P, Reed JC, Pellecchia M, Sarkar D, Fisher PB. Targeting the Bcl-2 family for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets 2013; 17: 61-75 [PMID: 23173842 DOI: 10.1517/14728222.2013.733001]
基金项目：黑龙江省青年科学基金资助项目，No.QC2009C110
论文作者:汪丽燕1,李滨(通讯作者)2,薄晓通2
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第26期供稿
论文发表时间:2015/10/29
标签：连环论文; 肝癌论文; 细胞论文; 转染论文; 凋亡论文; 细胞株论文; 基因论文; 《医药前沿》2015年第26期供稿论文;