摘要:目的:观察益智灵胶囊对Aβ 1-42致阿尔茨海默病模型大鼠Tau蛋白、磷酸化Tau蛋白及Aβ1-42表达影响，并对其可能的机制进行初步探讨。方法:通过在大鼠海马区立体定向注射凝聚态Aβ1-42复制AD动物模型,采用免疫组织化学法检测大鼠脑神经细胞T-Tau蛋白和P-Tau蛋白的表达情况及大鼠大脑Aβ1-42表达的变化。将SD大鼠随机分为7组。假手术组右侧海马单次注射生理盐水5μL，模型组、石杉碱甲组及益智灵各组分别右侧海马注射Aβ 1-42 (10μg),阳性药组和益智灵各组分别灌胃给予石杉碱和益智灵提取物。给药3周后，采用免疫组织化学法检测海马区Aβ、Tau蛋白、磷酸化Ta蛋白表达。结果：益智灵可通过抑制Aβ1-42聚集、降低T-tau及P-tau浓度，从而起到早期干预AD的作用。结论：益智灵提取物能改善Aβ 1-42引起阿尔茨海默病大鼠学习记忆障碍，其机制可能与抑制Aβ1-42聚集、降低T-tau及P-tau浓度有关。
关键词:益智灵; Aβ 1-42;Tau蛋白;磷酸化Tau蛋白;表达影响
随着老龄化社会的来临，阿尔茨海默病(Alzheimer’s desease)的患病率和发病率逐年上升，已经成为继心脑血管疾病和癌症之后，危害老年人生命健康的“第四位杀手”。目前，公认的AD早期特异性的脑脊液生物学标志[1]，但西药对Aβ 1-42水平、T-tau及P-tau浓度的影响效果不理想，故研究中药对AD早期特异性脑脊液生物学标志的影响日益受到重视。益智灵胶囊是在古代许多延年益智方的基础上筛选而成的一种新中药制剂,它含有人参、何首乌、枸杞子、菟丝子、核桃仁、远志等药物,具有补肾益精、滋阴填髓、健脑益智等功效,临床上主要用于老年人记忆功能减退及老年性痴呆症。本研究通过大鼠海马区立体定向注射凝聚态Aβ 1-42复制AD动物模型,采用免疫组织化学法检测大鼠脑神经细胞T-Tau蛋白和P-Tau蛋白的表达情况及大鼠大脑Aβ 42表达的变化影响。
1材料与方法
1.1动物 健康雄性SD大鼠120只，8～12周龄，体质量270～300g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供。饲养在湖南省长沙市长沙医学院，光照12h/d，温度20～26℃，相对湿度40%～70%。
1.2药物益智灵胶囊采用醇提水沉法提取药物的有效成分，提取液经过滤、真空浓缩、干燥得到干浸膏。所提取的干浸膏加辅料乙醇混匀，干燥后填充[2]。棕色粉末，5.178g生药/g干粉(石家庄以岭药业股份有限公司，批号20121101);石杉碱甲片(哈伯因)，50μg/片，24片装(河南太龙药业股份有限公司豫中制药厂，批号120605);Aβ1-42寡聚体(北京交通大学理学院生物科学与技术研究所)。
1.3主要仪器大鼠脑立体定位仪(瑞沃德生命科技有限公司);微量注射泵(恒流泵有限公司);凝胶成像分析仪。
2方法
2.1造模Abeta寡聚体造模:除正常对照组以外的各组大鼠分别用水合氯醛腹腔麻醉[3]，将大鼠固定在脑立体定位仪上，参照《大鼠脑立体定位图谱》，在颅骨相应位置钻孔(前囟后3.6mm，中线右侧2.1mm，左右耳杆刻度为4.5～5.5mm，门齿钩的平面低于耳间线平面3.3mm)。在无菌条件下，右侧海马注射寡体Aβ 1-42 10μg，注射量为5μL，恒速垂直注射到右侧海马内(硬膜下3.96mm)，注射时间持续5min(体积流量为0.2μL/min)，注射后留针5min，以保证溶液充分弥散[4];假手术组注射等量的生理盐水，其余操作同前。皮肤切开处给予少许青霉素粉剂，缝合切口。
2.2分组给药方法120只SD大鼠随机分为7组:正常对照组、假手术组、模型对照组、阳性药对照组(石杉碱甲)、益智低剂量组、益智中剂量组、益智高剂量组。正常对照组18只，其余各组17只，正常组、假手术组以及模型组分别按体质量(10mL/kg)给予生理盐水，阳性药对照组的给药剂量为60μg/kg、益智灵低、中、高剂量组每日给药剂量分别为1.78g生药/kg、3.56g生药/kg、7.12g生药/kg(拟临床用量26.7g生药/d)。一个月后，禁食，常规处死，进行检测。
2.3免疫组织化学法检测海马区Aβ、Tau蛋白、磷酸化Ta蛋白表达通过标记抗体与特异性抗原反应显色[5]。
2.4统计学处理采用SPSS17.0统计软件，计量资料用均数±标准差(x±s)表示。首先进行正态性检验，符合正态分布的数据，多组间比较采用单因素方差分析(One-WayONOVA)，若方差齐采用最小显著差法进行两两比较，若方差不齐则采用Dunnett’s T3[6]检验进行两两比较;若不符合正态分布，则采用非参数检验进行统计分析，均以P＜0.05为具有统计学意义。
3结果
对Aβ引起阿尔茨海默病大鼠海马区Tau蛋白、磷酸化Tau蛋白及Aβ42的表达水平的影响。正常对照组大鼠海马区Aβ蛋白表达水平较低，大鼠海马区注射Aβ后，引起模型组大鼠海马区Aβ蛋白表达水平显著升高;经药物治疗后，给药组海马区的Aβ蛋白表达水平均显著降低且具有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01)正常对照组与假手术组相比，T-tau蛋白表达水平没有明显变化;大鼠海马区注射Aβ后，引起模型组T-tau蛋白表达水平显著升高(P＜0.01)，与模型组相比，给药组T-tau的蛋白表达水平均有不同程度的下调，具有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01)。与正常对照组相比，假手术组P-Tau蛋白表达水平没有明显变化;模型组与假手术组相比，P-Tau蛋白表达水平显著升高(P＜0.01)，经药物治疗后，给药组P-Tau蛋白表达水平显著降低，其中益智灵中、高剂量组具有统计学差异（P＜0.05)，见表1。
4讨论
AD患者的神经病理特征之一就是神经元纤维缠结，而tau蛋白是神经元纤维缠结的主要成分[7]。在正常细胞中，tau蛋白有助于轴突微管的稳定，这种微管是细胞内物质运输的通道，而在病理情况下，tau蛋白被异常磷酸化，形成双螺旋丝，也就失去了维持微管运输的能力，并沉积在细胞内导致神经元变性。脑脊液中Aβ1-42水平的降低、T-tau及P-tau浓度的升高是目前公认的AD特异性的脑脊液生物学标志，反映了AD的病理生理学特征[8]。中医药在AD早期治疗方面有一定优势，具有多系统、多途径、多环节整体调节的特点，其运用复方与辨证论治，使用天然药物，疗效较好，毒副作用小。老年性痴呆属于中医“痴呆”、“善忘”、“呆病”等范畴，临床以智能减退、学习记忆障碍等为临床特征，病变脏腑多责之于肾、脾、心，涉及精、气、血、痰、郁、瘀等病机[9]，中医认为年老体弱精亏气虚血少，气运血无力，血停留为瘀，血瘀阻滞气机，气郁则痰迷，痰瘀胶结、脑络不通，清窍失灵而为本病。故肾精亏虚、脑髓失养是阿尔茨海默病发病的主要病理机制[10]。根据上述病机，确立了益智灵胶囊的基本理论组方。方中以首乌，菟丝子为君，补肾填精益髓，统领诸药;臣以人参、远志，补肾健脾、益气养神;佐以胡桃仁、枸杞子等补肾固精，加强君药之填精益髓，养精固肾的功效。组方药简效宏，临床观察显示，益智灵胶囊不仅有助于改善肾精亏虚所致智力减退、学习记忆障碍等痴呆表现，同时可显著改善阿尔茨海默病患者头晕耳鸣，齿摇发脱，腰酸腿软，步行艰难，懈惰思卧等肾精亏虚所致全身性临床症状表现，提高生活质量。综上所述，本研究采Aβ 1-42建立阿尔茨海默病大鼠模型，运用免疫组织化学法对阿尔茨海默病大鼠脑组织进行一系列的观察。发现益智灵胶囊提取物对阿尔茨海默病模型大鼠的学习记忆障碍有明显的改善作用，其作用机理可能是通过抑制Aβ1-42聚集、降低T-tau及P-tau浓度，从而起到早期干预AD的作用。本研究将为运用中药复方对AD早期特异性脑脊液生物学标志进行干预奠定基础，为AD的早期预防提供新的方案。
参考文献
[1]Dominik Blum,Inga Liepelt-Scarfone,Daniela Berg,Thomas Gasser,Christian Fougère,Matthias Reimold. Controls-based denoising, a new approach for medical image analysis, improves prediction of conversion to Alzheimer’s disease with FDG-PET[J]. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging,2019,46(11).
[2]A. N. Simonov,T. P. Klyushnik,L. V. Androsova,N. M. Mikhaylova. Quantitative Evaluation of Links between Inflammatory Markers and Alzheimer’s Disease[J]. Neuroscience and Behavioral Physiology,2019,49(7).
[3]José Enrique de la Rubia Ortí,Vicente Prado-Gascó,Sandra Sancho Castillo,Mariano Julián-Rochina,Francisco J. Romero Gómez,María Pilar García-Pardo. Cortisol and IgA are Involved in the Progression of Alzheimer’s Disease. A Pilot Study[J]. Cellular and Molecular Neurobiology,2019,39(7).
[4]张运辉,周小青,杨梦琳.淫羊藿、三七及其有效成分防治阿尔茨海默病的研究概况[J/OL].亚太传统医药,2019(08):191-194[2019-09-05].
[5]Audrain Mickael,Haure-Mirande Jean-Vianney,Wang Minghui,Kim Soong Ho,Fanutza Tomas,Chakrabarty Paramita,Fraser Paul,St George-Hyslop Peter H,Golde Todd E,Blitzer Robert D,Schadt Eric E,Zhang Bin,Ehrlich Michelle E,Gandy Sam. Integrative approach to sporadic Alzheimer's disease: deficiency of TYROBP in a tauopathy mouse model reduces C1q and normalizes clinical phenotype while increasing spread and state of phosphorylation of tau.[J]. Molecular psychiatry,2019,24(9).
[6]李长生. 首乌益智胶囊对血管性痴呆的保护作用及作用机制探讨[A]. 中华中医药学会.第十次中医药防治老年病学术交流会论文集[C].中华中医药学会:中华中医药学会,2012:3.
[7]苏莉娟,曹晓岚.益智灵方治疗轻度血管性认知障碍的临床观察[J].中西医结合心脑血管病杂志,2010,8(08):930-931.
[8]苏莉娟. 益智灵方治疗轻度血管性认知障碍的临床研究[D].山东中医药大学,2008.
[9]苗琦,张效科,陈美芳,杨志宏.益智灵胶囊对老年性痴呆大鼠健脑益智作用机制的实验研究[J].现代中医药,2007(04):70-72.
[10]徐凡叶. 益智灵胶囊对老年痴呆大鼠血及脑组织中MDA、β-AP含量影响的实验研究[D].陕西中医学院,2006.
论文作者:戎相霖[]，叶露，廖冰，刘艳鑫，余田甜，薛丽君
论文发表刊物:《医师在线（学术版）》2019年第15期
论文发表时间:2019/9/30
标签：蛋白论文; 大鼠论文; 阿尔论文; 磷酸化论文; 模型论文; 水平论文; 胶囊论文; 《医师在线（学术版）》2019年第15期论文;