徐馨竹[1]2017年在《黑龙江省苏云金杆菌的分离及新型cry基因的克隆与表达》文中研究说明夜蛾科(Noctuidae)害虫种类多且危害广,发生周期长,给农业生产带来极大损失。目前夜蛾科害虫的治理仍以化学防治为主,化学农药长期大量施用造成的“3R”问题,使生态环境日趋恶化,也使得有害生物的绿色防控成为众望所归。苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)以其杀虫专一性强、环境友好等特点,在害虫生物防治中得到大量应用,但随着Bt大面积的推广应用,田间抗性种群也不断产生,因此,不断挖掘新的Bt菌株,筛选出高效、广谱的cry基因尤为重要。本研究利用醋酸钠选择筛选法从黑龙江省不同类型的土壤中分离出苏云金杆菌,并对其基因型进行了鉴定,以棉铃虫(Helicoverpa armigera Hubner)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae Linnaeus)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)为靶标,检测了菌株对夜蛾科害虫的生物活性,并对高毒力菌株的新基因进行了克隆与表达,获得以下实验结果:从黑龙江省不同地区采集的352土样中分离出Bt菌株46株,出菌率为13.6%,其中哈尔滨等地区的黑土与伊春等地区的暗棕壤分离出来的Bt菌株最多,出菌率分别占18.81%和18.83%;其次是加格达奇等地区针叶林土和齐齐哈尔等地区的草甸土,出菌率分别占7.89%与9.52%,佳木斯市风沙土的出菌率为2.38%,大庆等地区的盐碱地并没有分离出Bt菌株。通过光学显微镜镜检观察,分离株的伴孢晶体形态不一,主要以长菱形、钝菱形等不同类型的菱形为主,还存在不规则形、球形、镶嵌形等一些晶体类型,部分分离株还可观察到几种形态晶体共存的现象。采用PCR-RFLP鉴定体系,利用10对通用引物筛选出cry1、cry2、cry8以及cry9四种基因型。其中,检测出cry1类基因的菌株共34株,检出率最高,占73.91%,其次是存在cry2类基因的菌株共计18株,4株检测出cry8类基因,6株存在cry9类基因。有16株菌株仅有单一的cry1或cry2基因,其他呈现基因组合形式,如cry1+cry2型、cry1+cry2+cry9型等多种类型。有9株分离株并未检测出基因型,占总数的19.57%,却有蛋白表达,分析原因可能是鉴定引物数量较少而未检测出杀虫基因型亦或是有未知杀虫基因存在。通过SDS-PAGE方法,分析了Bt分离株的Cry蛋白表达的杀虫晶体量,发现分子量在130 kDa、90 kDa、70 kDa以及60 kDa的蛋白量最为丰富。13株仅有cry1型基因的菌株蛋白表达量约为130 kDa;3株仅有cry2型基因的菌株蛋白表达量约为60 kDa-70 kDa;兼有cry1型、cry2型基因的菌株其伴孢晶体为菱形,表达ICPs分子量大小为130 kDa和60 k Da;存在多种基因型的菌株蛋白表达大小多样,多为130 k Da和60 kDa;未鉴定出cry基因型的菌株却检测出了表达的蛋白,而且蛋白的表达量大小不一。本研究克隆获得了cry1Ab36与cry2Ab35两个新基因(登录号分别为KY440260和KY501107),均来自对夜蛾科害虫有较高杀虫活性的菌株HT2。对cry1Ab36与cry2Ab35基因进行了克隆与分析,结果表明:cry1Ab36基因开放阅读框共3546 bp,编码1181个氨基酸,分子量133.52 k Da,等电点为4.98;cry2Ab35读码框为1902 bp,编码633个氨基酸,分子量70.72 k Da,等电点为8.73,都具有叁个典型的结构域,不含有信号肽。经由SDS-PAGE分析、Western blot验证均证:cry2Ab35基因在大肠杆菌内成功表达了70 kDa左右蛋白,其上清液和沉淀均有蛋白的表达,说明该蛋白有部分溶解现象。
程林友[2]2004年在《高毒力苏云金杆菌菌株的筛选及基因型鉴定》文中指出苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis简称Bt)是目前研究最深入、使用最广泛的杀虫微生物之一，但甜菜夜蛾对目前已发现的绝大多数Bt菌株不敏感或低敏感，已商业化的苏云金杆菌杀虫剂对其效率很低。由于甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hubner)近些年来在我国大面积频繁爆发、猖獗成灾，因此深入发掘我国丰富的苏云金芽孢杆菌资源，筛选高毒力及特异性菌株，对其基因型进行分析，其结果对微生物杀虫剂的研制、构建高效广谱工程微生物和培育转基因抗虫植物都具有重要的理论及实践意义。 本研究从河北省境内55个县市采集土样700份，采用醋酸钠-抗生素分离法从中分离出苏云金芽孢杆菌34株，对田间采集的自然死亡的虫尸采用平板稀释法分离到Bt菌株13株。以甜菜夜蛾、棉铃虫(Helicoverpa armigera Hubner)、粘虫(Mythimna separata Walker)、玉米螟(Ostrinia furnacalis (Hubner))和小菜蛾(Plutells xylostella (Linnaeus))的一龄幼虫为试虫进行生物测定，从中筛选出11株对鳞翅目幼虫具有高毒力的Bt菌株。经复筛确定T4-3和CYZ-13两株对甜菜夜蛾活性最好，且这两株对鳞翅目幼虫表现出广谱性。以HD-1为标准菌株测定了两株发酵液的致死中浓度(LC_(50))分别为2.01×10~6 cells／mL(T4-3)、1.50×10~6 cells／mL(CYZ-13)和5.76×10~6 cells／mL(HD-1)，结果表明两株的毒力高于HD-1 2-3倍。随后对两菌株进行了V．P．反应、水解电泳、蔗糖产酸、菌膜、纤维二糖产酸、甘露糖、水解七叶灵、解朊反应、脲酶产酸和卵磷酯酶产生10项生化反应指标测定，结果表明Bt．T4-3的所有指标同B．t．subsp．subtoxicus一致。Bt CYZ-13同Bt．subsp．kurstaki一致。 用GT培养基发酵培养，以HD-1为标准菌株测定T4-3和CYZ-13的生长曲线表明叁种菌株生长曲线及叁种时期差异不显着，这两种菌株的实际发酵应用中不用特殊处理。 利用PCR-RFLP体系合成四对引物K5un2／K3un2，K5un3／K3un3，S5un2／S3un2，S5uni／S3uni，以T4-3和CYZ-13两菌株的质粒提取物为模板对四对引物进行PCR扩增，并分别采用限制性内切酶Pst Ⅰ／Xbal，EcoR Ⅰ／Pst Ⅰ，Msp Ⅰ／Mva Ⅰ和Bsp119 Ⅰ／Ban Ⅰ对四对引物的PCR产物进行双酶切，鉴定两菌株的基因型。结果表明T4-3含有cry1Aa、cry1Ac、cry1Ag、cry2Ac、cry1Ial基因。CYZ-13含有cry1Ac、cryBc、cry2Ab基因。琼脂糖凝胶电泳图谱显示，CYZ-13菌株的Cry1Ac基因酶切图谱不同于标准图谱，初步推断为新基因。 此外还以东亚飞蝗初孵若虫为试虫对21株Bt菌株进行筛选，得到两株对东亚飞蝗较高毒力的特异菌株UV-17和WY-17，校正死亡率达70％以上。
罗兰[3]2005年在《苏去金杆菌的分离、cry/cyt基因鉴定及杀线虫活性的研究》文中研究指明农业有害生物每年都对农作物的生产造成严重的损失,尤其是鳞翅目、鞘翅目、双翅目等害虫及植物病原真菌、寄生线虫等的危害最为严重。苏云金杆菌制剂是目前应用最为成功的一类微生物杀虫剂,在防治植物病害方面也取得了一定的进展。深入挖掘我国丰富的苏云金芽孢杆菌资源,分离克隆新型高毒力的杀虫蛋白基因,对构建高效广谱工程微生物和培育转基因抗虫植物具有重要的理论意义和应用价值。本研究从我国20 省市自治区共采集178 份土样,采用常规稀释平板法,并结合伴孢晶体的复红染色鉴定苏云金杆菌,共分离获得苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)51株。对51 株Bt 分离菌株的cry 基因进行了PCR 鉴定。以cry1,cry2,cry3,cry4,cry-n,cry7,cry8,cry11,cry13 和cyt 的通用引物作PCR 分析,研究结果表明:4 株含有cry4,12 株含有cry7,4 株含有cry8,4 株含有cry1,2 株同时含有cry1 和cry2,27 株无PCR产物,未检测到其它基因型。对4 株含有cry4 菌株进行了系统研究。结果表明:编号为BD-2-1,BD-2-2,HC-7-1和STG-21-7 的Bt 菌株主要形成球形伴孢晶体,部分为不规则形;前3 个菌株的11 项生理生化指标基本一致,但与STG-21-7 差别较大;这4 个菌株活性晶体蛋白主要由66~72kDa、27~31kDa 和20kDa 组成;从cry4 基因序列同源性分析认为,BD-2-1 和BD-2-2 为同一菌株,与另外2 株有差异,但4 菌株所含基因的同源性大于90%,都与cry40-like 同源性为88%。对4 株含有cry8 菌株进行了系统研究。编号为YN-1-1、SH-1-2、HZJ-35-17 和HZJ-3-3 的菌株主要形成扁长方形伴孢晶体,部分为不规则形;11 项生理生化指标差别较大;HZJ-35-17 的杀虫晶体蛋白主要为130kDa 和70~75kDa,其它菌株的杀虫晶体蛋白主要为70~75 kDa;从cry8 基因序列同源性分析认为,YN-1-1、SH-1-2、HZJ-35-17和HZ-3-3 的同源性大于90%; YN-1-1 与SH-1-2 所含cry8 基因的同源性高达99.67%;HZJ-3-3 所含cry8 基因和cry8Bb1 基因同源性达97%;HZJ-35-17 和YN-1-1 及SH-1-2的同源性为95%,这4 株所含基因与cry8B的基因同源性为89%,和cry8A 基因的同源性为83%。 用51 个苏云金杆菌菌株对松材线虫进行了活性测定,筛选到2 株活性较高的苏云金杆菌,(其编号分别为XZ-4-5 和HC-7-1)分别提取外毒素和内毒素对松材线虫生测,明确了活性物质主要是外毒素,内毒素活性不如外毒素高。通过温室盆栽试验,结果表明,2 个菌株对番茄根结线虫(Meloidogyne spp)均有一定的防效。菌株XZ-4-5 的外毒素对松材线虫有一定的活性,且含有对鞘翅目害虫有活性的cry7 基因,这对进一步研究其对松材线虫或其传播介体松褐天牛的杀虫活性具有重要
王永[4]2003年在《高毒力苏云金杆菌菌株的筛选及cry2Ab基因的克隆》文中研究说明苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是目前防效显着、应用广泛的微生物杀虫剂。深入发掘我国丰富的苏云金芽孢杆菌资源，筛选高毒力及特异性菌株，分离克隆新型高毒力的杀虫蛋白基因，对微生物杀虫剂的研制、构建高效广谱工程微生物和培育转基因抗虫植物具有重要的理论及实践意义。 本研究从河北省境内44个县市采集土样500份，从中分离出苏云金芽孢杆菌25株。生物测定结果表明：WZ-2，WZ-7，WZ-4，WZ-5对多种鳞翅目害虫幼虫具有高毒力，如小菜蛾、菜青虫、棉铃虫、玉米螟、甜菜夜蛾。特别是WZ-7菌株，对棉铃虫(Helicoverpa armigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、玉米螟(Ostrinia furnacalis)幼虫，LC_(50)分别为3.30×10~5cells／mL、1.16×10~5cells／mL、5.21×10~6Cells／mL；WZ-9对马铃薯瓢虫有特效，LC_(50)为2.95×10~7cells／mL 利用PCR-RFLP鉴定体系对WZ-7菌株进行基因型分析，鉴定结果显示该菌株含有cry1Ab、cry1Ca、cry1Ba、cry2Ab、cry1Ial基因，并且这5种基因型全部定位于质粒上。 根据已知的cry2Ab基因ORF序列，设计合成了一对特异性引物，PCR扩增出cry2Ab基因全长，并直接与pUCm-T载体相连。将其连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α，PCR-RFLP鉴定克隆转化子，得到阳性克隆pWZ2Ab。核酸序列分析及氨基酸同源性比较，该基因与已知的cry2Ab1、cry2Ab2、cry2Ab3、cry2Ab4基因的同源性分别是99.8％、99.8％、99.8％和99.5％，其编码的氨基酸在位点110、414、446、497、514与已知的4种Cry2Ab毒素蛋白发生了变化。该基因编码区为1902bps，编码633个氨基酸的晶体蛋白，分子量为70.6kDa，等电点为pI8.96，属于弱碱性蛋白。该基因序列目前已在向GeneBank登记注册，Accession Number为AY297091，并已提交国际Bt-δ-内毒素基因命名委员会命名。
朱勋[5]2011年在《对小菜蛾高毒力Bt菌株的分离、鉴定及菌剂研发》文中进行了进一步梳理苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂,在世界范围内得到广泛的应用。同时其编码Bt杀虫毒蛋白基因也作为主要的杀虫基因转入到多种作物中,在害虫防治中成效显着。室内汰选实验表明大多害虫都具备对Bt制剂及毒蛋白产生抗性的潜能,随着Bt制剂和转Bt基因作物的广泛种植,使得害虫长期处于Bt毒素的选择压力下,目前在田间已经发现对Bt产生抗性的小菜蛾(Plutella xylostella)种群。为得到对抗Bt小菜蛾具有毒杀活性的Bt菌株,明确小菜蛾对Bt产生抗性的机制。本文设计对小菜蛾进行室内抗Bt汰选并进行相关研究,借助敏感和抗性小菜蛾进行高活性Bt菌株的分离筛选,同时对分离菌株的生物学特性、cry基因种类及菌剂的制作开展研究。结果如下：(1)2009-2010连续两年,对黑龙江地区小菜蛾种群消长动态进行了调查,并对11种杀虫剂的毒力进行了比较分析。结果表明：受日最低气温的影响,2010年田间小菜蛾比2009年晚出现十天,但总体趋势一致,均从5月初田间始见小菜蛾成虫,6、7月份出现高峰,到8月末便逐渐消失。杀虫剂对小菜蛾幼虫的杀毒力测定结果表明：氟虫腈对小菜蛾幼虫的毒力最高,其LC50为0.58mg/L; Bt粉剂的毒杀活性良好,虽然略有抗性,但抗性水平极低；另外,小菜蛾对Bt粉剂的耐药性最差,对Bt粉剂最不容易产生抗药性。(2)在室内分别利用Bt粉剂和Cry1Ac毒蛋白汰选小菜蛾,最后得到两个Bt及毒素的高抗种群,其中上海抗性种群(SH-R)对Bt粉剂的抗性达到844.9倍,而深圳抗性(SZ-R)种群对Cry1Ac毒蛋白的抗性高于1500倍。(3)利用AFLP技术对小菜蛾抗性与敏感种群对Bt毒素抗药性差异进行研究。从65对AFLP引物组合中筛选到12对在抗敏小菜蛾间表现多态性的引物组合,共扩增出35条特异表达条带。从12对AFLP多态性引物组合中找到了一个与小菜蛾Bt抗性相关基因相连锁的标记(Eaaa/Mcta-776bp)。用煮沸法回收AFLP勺标记片段,并进行了测序。根据测序结果设计一对特异性引物,将此AFLP标记转化为一个共显性SCAR标记。利用获得的SCAR标记对Bt抗性与敏感小菜蛾种群进行了验证,表明该标记可以可用于小菜蛾对Bt抗性的早期检测。(4)从田间采集死亡小菜蛾幼虫,从中分离出10株苏云金芽孢杆菌。利用抗性和敏感小菜蛾幼虫室内生测表明：各菌株对敏感小菜蛾幼虫的死亡率均在85%以上,其中DBW902毒力最强,48h的LC5o为13.99mg/L；其中9株菌株对抗性小菜蛾具有毒杀活性,其中DBW903对小菜蛾上海抗性种群(SH-R)的毒力最高,其LC5o为43.85mg/L; DBW93对小菜蛾深圳抗性种群(SZ-R)的毒力最高,其LC5o为49.33mg/L。菌株生理生化检测与分析表明,菌株DBW904、DBW93、DBW962与已报道的苏云金芽孢杆菌山东亚种B. thuringiensis subsp.shandongiensis的生理生化特性一致。(5)本研究设计的cry1基因片段引物对筛选Bt菌进行鉴定,经测序分析发现10株菌株均含有cry1基因片段；设计的cry1Ac基因全长引物,得到8个菌的cry1基因全长,经测序比对发现各菌株之间无差别,与cry1Ac基因100%同源；设计的cry2基因引物,得到8个菌的cry2基因全长,经测序比对发现菌株中含有两类cry2基因,分别是cry2Aa和cry2Ab基因。(6)分离的对抗、敏小菜蛾均具有毒杀活性的所有菌株中,Bt.DBW902尤为突出。对Bt.DBW902进行一系列摇瓶发酵发现,在最佳摇瓶培养条件(种子液菌龄10h,接种量2%,初始pH值6.5-7.5,摇床转速200r/min,发酵温度30℃)下发酵48h,活菌数和活芽孢数分别可达到2.99x109CFU/ml和8.88×108CFU/ml,晶体蛋白含量为20.0mg/ml。(7)利用菌株Bt.DBW902制备出了一系列含不同浓度梯度矿物填料的Bt粉剂初型。对其进行芽孢数及活性测定发现人造沸石对Bt粉剂保护作用最佳,1.0%-3.0%的添加比例最有利于菌株Bt.DBW902对小菜蛾毒杀活性的发挥。
赵焕丽[6]2009年在《美国白蛾优良Bt菌株筛选及其与高效氯氰菊酯的相容性》文中提出美国白蛾(Hyphantria cunea (Drury))是世界性检疫害虫,自1979年传入我国后猖獗危害,给我国的农林业造成巨大的损失。为了得到对美国白蛾高毒力Bt菌株,本实验采用生物测定的方法,对优良菌株进行了筛选。在此基础上,对其杀虫谱、基因型及其与高效氯氰菊酯(β- cypermethrin)的相容性等方面进行了研究。包括以下主要结果。1.经过系统生物测定,得到了美国白蛾高毒力野生菌株Bt S-19,其杀虫谱较广。Bt S-19对初孵幼虫、二龄、叁龄、四龄和五龄美国白蛾幼虫72h LC50值分别为1.8×10~5 cells/mL、2.3×10~5 cells/mL、8.1×10~5 cells/mL、1.3×10~6 cells/mL和3.1×10~6 cells/mL。对棉铃虫(Helicoverpa armigera)、粘虫(Mythimna separata)、淡色库蚊(Culex pipiens paliens)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)表现了较好的活性,而对杨扇舟蛾(Clostera anachoreta)活性较差。对棉铃虫、粘虫初孵幼虫72 h LC_(50)分别为9.03×10~6cells /mL,3.1×10~7cells /mL;对淡色库蚊24 h LC_(50)为3.45×10~4 cells /mL;对初孵甜菜夜蛾72h校正死亡率为94±0.15%;对二龄杨扇舟蛾96h校正死亡率为26.8±0.05%。2. Bt S-19晶体为小菱形,生长对数期为2-5h。基因型丰富,与已报道的其他对美国白蛾高毒力菌株基因型存在差异。分别利用cry1、cry2、cry3、cry7、cry8、cry9和vip3A基因引物进行基因型鉴定,对扩增片段及限制性酶切片段进行分析比对结果表明,该菌株含有基因cry1Aa、cry1Ab、cry1Ga、cry1Af、cry2Ab和vip3A基因,SDS-PAGE分析也表明,晶体蛋白的分子量主要为130kD、70kD和57kD,营养期为88kD。3. Bt预处理提高高效氯氰菊酯对美国白蛾的杀虫活性。生物测定比较了Bt S-19预处理及与高效氯氰菊酯混用两种情况下,对美国白蛾活性的差异。经Bt预处理后再使用农药组,24h、48h LC50分别为1.243 0mg /L、0.762 5mg /L,单剂对照则分别为4.075 1mg /L、1.281 1mg /L,且高效氯氰菊酯浓度低至1.0 mg/L时,LT50较对照缩短36h,表现明显增效,增效系数分别为330、168;而混用组72h后,当高效氯氰菊酯浓度低于6 mg /L时两者间有增效作用,而高于7.5 mg /L时表现出轻微拮抗。因此,在实践中,先使用Bt再喷施高效氯氰菊酯,可以达到减少农药的用量,发挥两者协同增效作用的目的。4.高浓度高效氯氰菊酯影响Bt芽孢的萌发及营养体裂殖,可能是导致两者混用表现拮抗的原因。观察各浓度农药、Bt混合液中芽孢和晶体形态,随时间延长,两者形态变化均不明显,但高浓度农药、Bt混合液中Bt菌生长缓慢,对数期延迟,Bt菌蛋白浓度与农药浓度程负相关;混合时间越长,趋势越明显。由此推测高效氯氰菊酯可能影响芽孢的萌发及营养体的分裂,进而影响Bt的杀虫活性。
王立光[7]2010年在《苏云金杆菌cry7Ab7基因的克隆表达及融合基因和工程菌构建》文中提出苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前研究最深入的杀虫微生物,其杀虫蛋白基因也是应用最广泛和最有发展潜力的抗虫基因,因此,深入发掘Bt新菌株、分离克隆新型的杀虫基因对害虫的防治具有重要意义。本研究利用温度筛选法,对采自河北保定周边的的182份土壤样品进行分离,得到9株野生型Bt菌株。利用40对通用引物对9株野生型菌株的基因型进行PCR鉴定,分离克隆了对瓢甲科害虫有活性的新型杀虫蛋白基因,构建了新型Bt融合基因,为构建高效广谱的Bt工程菌和培育转基因抗虫植物提供新基因资源。本研究的主要内容和结果如下:1从保定周边采集的182份土壤分离出9株Bt菌株,Bt菌株的平均分出率为4.95%,主要为小菱形、大菱形、方形、不规则形等晶体形态。2.利用40对通用引物鉴定9株野生型Bt菌株的基因型,选择仅含有cry7基因的GW6菌株设计特异性引物cry7Forword/cry7Reverse,将PCR产物连接到pGEM Easy载体进行克隆,由上海生工完成了该基因的全序列测定,该基因核苷酸序列已在NCBI和GenBank中登记(Accession number:FJ940776),并由国际Bt-δ-内毒素基因命名委员会正式命名为cry7Ab7。cry7Ab7基因的读码框(ORF)3414bp,编码1138个氨基酸,亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和天冬酰胺(Asn)含量最高,分别为8.87%,7.11%,7.11%,预测分子量为129.64kDa。Cry7Ab7蛋白等电点pI 4.97,为弱酸性蛋白。3.将cry7Ab7全长基因插入表达载体pET21b,转化E.coli BL21得到高效表达;利用Bt-E.coli穿梭载体pSXY422b,构建了重组质粒pSXY422b-7Ab7,转化Bt无晶体突变株HD73(cry-),得到工程菌Bt HD7AB,工程菌Bt HD7AB蛋白表达量是野生型菌株的2.6倍。生物测定结果表明,在E.coli中表达的融合蛋白和HD73(cry-)的晶体蛋白对马铃薯瓢虫(Henosepilachna vigintioctomaculata)2龄幼虫的LC50分别为1.1664μg/μL和0.779μg/μL。4.以苏云金杆菌野生型菌株GW6和Bt11总DNA作为PCR反应模板,利用特异性引物CRY7AbF/CRY1IaR融合cry7Ab7和cry1Ia14基因得到融合基因Bt7Ia,克隆得到的全长基因提交GenBank登录号为GU462130。Bt7Ia基因具有Cry7Ab7的DomainⅠ和Cry1Ia14的DomainⅡ和DomainⅢ。将该基因分别插入表达载体pET21b和Bt-E.coli穿梭载体pSXY422b构建了重组质粒pET21b-7Ia和pSXY422b-7Ia,转化E.coli BL21和Bt无晶体突变株HD73(cry-),分别得到E.coli EC7Ia和Bt HD7Ia。在E.coli BL21中的EC7Ia获得了高效表达,而含有cry1I沉默基因片段的融合基因Bt7Ia,在无晶体突变株HD73(cry-)中不表达。生物活性测定表明EC7Ia的表达产物对粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)和小菜蛾(Plutella xylostella)的LC50分别为2.0953μg/mL和0.3927μg/mL。这些结果为扩大Bt基因的杀虫谱以及Cry7Ab7和Cry1Ia14各功能域功能的研究奠定了基础。
白雪峰[8]2007年在《高毒力Bt菌株的筛选及cry2Ac10基因的克隆、表达和活性研究》文中进行了进一步梳理苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种具有高度特异性，对环境友好的微生物杀虫剂，其cry基因也是应用最为广泛和最有潜力的抗虫基因。本试验从山东省土壤中分离Bt菌株，然后通过生物测定筛选对鳞翅目夜蛾科昆虫具有高毒力的菌株，并对筛选出的高毒力菌株的蛋白组成和杀虫蛋白基因型作相应的研究，在此基础上，分离克隆新型的Bt的cry基因，研究该基因的表达和杀虫活性。本试验主要结果如下：1采用芽孢杆菌选择性培养基与晶体染色相结合的方法，从山东省采集的750份土样中分离出Bt菌株57株，Bt菌株的平均分出率为7.6％。这些Bt菌株的晶体形态包括菱形、圆形等形状。2以粘虫和甜菜夜蛾初孵幼虫为试虫进行高毒力菌株的初筛，菌液浓度为6.0×10~8cfu／mL时，对粘虫初孵幼虫校正死亡率高于50％的菌株有QCL-1、QCY-3、QJN-1、WRC-1、WZ-1；对甜菜夜蛾初孵幼虫校正死亡率高于50％的菌株有QCL-1、WRC-1、HJY-1。对Bt菌株不同成分生物测定，试验结果表明菌株QCL-1对几种夜蛾科害虫的毒力主要来自于芽孢和晶体混合物，菌株QCL-1对甜菜夜蛾初孵幼虫的毒力显着高于标准菌株HD-1，对粘虫和粉纹夜蛾初孵幼虫的毒力与标准菌株HD-1相当。3 SDS-PAGE分析菌株QCL-1杀虫晶体蛋白主要为130kDa和70kDa两种，利用cry基因的PCR-RFLP方法鉴定菌株QCL-1中含有cry1Cb、cry1Fa、cry1Fb、cry2Ab和未知的cry2A类基因。4以菌株QCL-1质粒为模板，利用设计的cry2A类特异性引物FY2A5和FY2A3，PCR扩增出1.9kb的目的片段，将其克隆到表达载体pET-21b(+)，构建了T7启动子控制的大肠杆菌重组表达质粒pET21b-cry2Ac。序列分析表明，该基因的编码框由1872个碱基组成，该基因编码的蛋白质由623个氨基酸组成，其中亲水性氨基酸占38.35％，疏水性氨基酸占45.26％，酸性氨基酸占6.90％，碱性氨基酸占9.48％。蛋白质的分子量为69.7kDa，等电点为8.825，为弱碱性蛋白质。该基因编码的氨基酸序列与已公布的Cry2Ac蛋白的氨基酸序列均不同，氨基酸序列同源性在97.4％～99.7％之间。该基因的核苷酸序列已经在GenBank登录(GenBank accession EF405952)，并被Bt基因国际命名委员会确认为一个新的cry2Ac基因，正式命名为cry2Ac10。5将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导，SDS-PAGE分析表明该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达70kDa的蛋白。Cry2Ac10蛋白生测结果表明，该蛋白对棉铃虫、粘虫和粉纹夜蛾初孵幼虫具有高毒力，同时对甜菜夜蛾初孵幼虫生长有抑制作用，其中对棉铃虫和粘虫初孵幼虫的LC_(50)分别为30.0μg／g和16.7μg／g。
伍金元[9]2008年在《苏云金芽孢杆菌cry1Ab22基因的克隆与原核表达》文中研究表明苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Berliner,简称Bt)是目前应用最广的一类微生物杀虫剂,在过去的30多年中得到广泛的研究和应用。Bt的主要杀虫活性与其携带的编码ICPs(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)的cry基因密切相关,因此,cry基因工程研究便成为近几年研究的热点。自Schnepf和Whiteley(1981)分离克隆了第一个Bt cry基因,到目前为止,国际上已经克隆了407种杀虫蛋白基因,但是随着Bt应用的不断扩大,Bt ICPs基因均在不同程度上引发了昆虫的抗性,寻找新的高毒力菌株及基因是解决昆虫抗性问题的有效途径之一。本研究利用PCR-RFLP法对苏云金芽孢杆菌新菌株S249的cry1型基因进行鉴定,结果显示其含有cry1Aa/cry1Ag、cry1Ab、cry1B基因,并根据GenBank中cry1Ab型基因序列设计引物对P-1,从苏云金芽孢杆菌S249中扩增得到cry1Ab的全长基因,克隆到pGEM-T Easy载体上。通过引物步行法测定该基因长3633bp,其中开放阅读框(ORF)长3468bp,编码1155个氨基酸;经ExPASy分析,初步预测其蛋白质分子量为130.7kDa,等电点pI 5.04。序列比较结果表明,该基因与其它cry1Ab基因存在6~58个氨基酸的差异,已在GenBank中登录,登录号为EU220269,并被Bt毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ab22。将cry1Ab22基因克隆到表达载体pMAL-c2X上,得到重组质粒pM1a,然后转化到大肠杆菌TB1中,利用IPTG诱导进行表达,最佳IPTG诱导浓度为0.5mM,最佳诱导时间为4h,目的蛋白约占总蛋白的17%。经SDS-PAGE检测,发现转化菌株TB1能正确表达约170kDa的融合蛋白。对表达的cry1Ab22蛋白进行生物测定,结果表明,cry1Ab22蛋白对小菜蛾(Plutella xylostella)的LC50为225.1μg/ml。新cry基因的克隆,不但为cry基因家族增添了新成员,而且为构建新型转基因工程菌和转基因植物,提供了基因材料。
丁学知[10]2006年在《苏云金杆菌4.0718菌株的cry杀虫基因和功能蛋白质组学研究》文中提出研究和发展现代植物保护生物技术，确保食品安全，保护生态环境和维护人类健康具有重要意义。近年来，利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)取代有残留杀虫化学农药控制植物害虫，实施生态农业计划，已成为国际上发展的新趋势。但在对提高Bt杀虫毒力、挖掘新的cry杀虫功能基因和研究其蛋白质组学上有待深入进行。本文利用微生物技术，分子生物学技术和蛋白质组学方法，选育出Bt4.0718新菌株，系统研究了cry基因，发现了新的杀虫基因，利用烟草几丁质酶基因tchi B与Bt4.0718菌株的cry1Ac基因重组，获得高效杀虫工程菌。首次对Bt的杀虫功能蛋白质组进行了研究。Bt作为微生物杀虫剂在生产上成功推广和应用，很大程度上取决于高毒力菌株的选育。本研究从湖南不同生态区域采集的858份土样中，分离出30份Bt菌株。从中筛选一株具有典型Bt菌落特征和较高杀虫毒力的701~(2c)为出发菌株，经紫外线和两次亚硝基胍(NTG+LiCl)的交替复合诱变，发现菌体的伴孢晶体的形状、大小、数量和芽孢同伴孢晶体的比例与杀虫毒力密切相关。以此特征为依据进行快速初筛和毒力生测复筛，获得一株高毒力突变杀虫新菌株4.0718。该突变株杀虫毒力与出发菌株相比提高了7.5倍，在6h、12h、和24h内供试小菜蛾叁龄幼虫死亡率分别高达20％、97％和100％。此菌株经连续10代培养稳定遗传。这为高毒力杀虫菌株的选育提供了一种简单和快速的方法。在对4.0718进行单因子培养条件试验的基础上，采用正交设计试验和结合杀虫毒力生测，对该菌株进行发酵试验，获得了最佳发酵条件。Bt菌株的杀虫活性与其携带的编码杀虫晶体蛋白(ICPs)的cry基因密切相关。通过PCR扩增的产物电泳检测，4.0718含有cry1和cry类杀虫基因，显示出4.0718菌株cry基因类型丰富。将4.0718菌株质粒上的cry1Ac基因和烟草几丁质酶基因tchiB(去掉信号肽和去信号肽再加肠激酶位点)重组，经双酶切和亚克隆，将带有cry1Ac基因上游启动序列和下游终止序列的重组基因片段克隆至穿梭载体pHT315中，分别构建重组质粒pHUAccB6和pHUAccB7，转入E.coli，电转入Bt无晶体突变株XBU001中，获得重组菌株HAccB6和HAccB7。通过液体双相孢晶分离提取后，将晶体和上清液分别进行SDS-PAGE分析，双价重组基因与对照cry1Ac基因在无晶体突变株中表达量相比较，获得高效表达的双价融合蛋白。经定量分析：双价融合蛋白分别占总蛋白量的62.5％；Cry1Ac蛋白占蛋白总量的42.0％。经原子力显微镜和电子显微镜观察，表达后的融合蛋白呈菱形和椭圆形晶体，其规格约为1.5×3.0μm。经生测分析，两株工程菌HAccB6和HAccB7的重组基因表达的融合晶体蛋白二者在毒力上比较接近，而与对照工程菌HAc5和野生菌4.0718相比较，速杀时间提前36h。工程菌HAccB6对棉铃虫(Heli coverpa armigera)具有高效杀虫活性，其72h LC_(50)值为9.10μg／mL，为对照菌杀虫毒力的4.529倍。结果显示出tchiB基因与cry1Ac基因重组后的表达产物具有显着的杀虫增效作用。首次对Bt杀虫晶体蛋白质进行了研究。用液体双相法和等电点沉淀法纯化晶体蛋白，结合用2-DE分离的蛋白质进行质谱鉴定，确定了伴孢晶体蛋白总蛋白质的提取方法，获得了更清晰、分辨率更高和聚焦效果更好的2-DE图谱，建立了Bt晶体蛋白的双向电泳方法。对分别属于Bt的3个不同亚种的库斯塔克亚种4.0718、武汉亚种140菌株和以色列亚种H14菌株及相关工程菌株HAccB6和HAccB7的晶体蛋白质进行了系统的研究。工程菌HAccB6和HAccB7菌株分别检测到356±9和400±11个，其中两者129个蛋白质斑点相互匹配，平均匹配百分率为30％。等电点沉淀法双向电泳(2-DE)图谱中检测到90±9和193±11个蛋白质斑点数，其中两者的80个蛋白质斑点相互匹配，平均匹配百分率为40％，说明两者在毒力以及杀虫谱上的相似性和差异性。对2-DE胶上大部份蛋白质点进行了质谱分析，鉴定出各菌株的晶体蛋白成份中的7类功能蛋白质，即杀虫毒蛋白(Cry1Ac、Cry2Aa、CryIG，CryH2，Cry1Ab16，Cry2Ac_2)、晶体形成相关结构蛋白(伴侣蛋白dnak)、蛋白质折迭和组装的重要调节者热休克蛋白H_(SP)60，物质代谢酶类(分支链氨基酸转氨酶、烯醇酶、丙酮酸脱氢酶复合物E3)、蛋白质合成因子(ATP合成酶F1、ATP合成酶β-链、β-内酰胺酶、翻译延长因子Ts、Tu、G)、延长因子EF-Tu和EF-Ts、假想蛋白、转运蛋白(ABC transporter ATP-binding protein)、和蛋白引发因子(Trigger factor)等。从研究的Bt菌株中都鉴定有HSP-60，翻译延长因子Tu这两种蛋白，认为这两种蛋白很可能为晶体形成相关的重要蛋白，且杀虫晶体蛋白在结构与杀虫活性功能上的关系密切。这些表达谱和功能蛋白质组的研究将有助于对杀虫晶体蛋白杀虫机理的理解。特别是在Bt武汉亚种中新发现了Cry2Ac6蛋白。晶体蛋白种类的不同则有助于解释4.0718菌株高效杀虫的生化功能特征。结合利用CPHmodles、Ds ViewerProTrial和Swiss-Pdb Viewer软件，发现新型的Cry2Ac6与Cry2Aa的毒性核心片段空间结构有一定差异。说明与昆虫中肠受体蛋白结合的亲和力不同，引起其在杀虫毒力上的差异。总之，本项研究为苏云金芽孢杆菌高毒力杀虫菌株的选育、发酵条件、cry基因与外源毒素基因重组及亚种间功能蛋白质组学研究提供了一系列的方法和可借鉴的研究思路，鉴定了与杀虫毒力相关的cry基因及其功能蛋白质组，创新性研究了不同原毒素分子结构与杀虫活性之间的内在规律及其与昆虫细胞受体结合机制的信息。
参考文献：
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[3]. 苏去金杆菌的分离、cry/cyt基因鉴定及杀线虫活性的研究[D]. 罗兰. 西北农林科技大学. 2005
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[7]. 苏云金杆菌cry7Ab7基因的克隆表达及融合基因和工程菌构建[D]. 王立光. 河北农业大学. 2010
[8]. 高毒力Bt菌株的筛选及cry2Ac10基因的克隆、表达和活性研究[D]. 白雪峰. 青岛农业大学. 2007
[9]. 苏云金芽孢杆菌cry1Ab22基因的克隆与原核表达[D]. 伍金元. 西北农林科技大学. 2008
[10]. 苏云金杆菌4.0718菌株的cry杀虫基因和功能蛋白质组学研究[D]. 丁学知. 湖南农业大学. 2006