牛胜鸟[1]2000年在《三种西瓜病毒的基因克隆及植物表达载体构建》文中研究表明本研究以从山西西瓜上分离纯化得到的西瓜花叶病毒2号(WMV-2)分离物为材料，用RT-PCR方法得到其外壳蛋白(CP)。基因的cDNA，经克隆和序列测定后，确认该基因是由846个核苷酸组成，可编码产生281个氨基酸。同源性比较分析结果表明，该基因的核苷酸序列及由此推导的氨基酸序列与已发表的4种WMV-2分离物CP基因相应序列同源性分别为92.8-93.9％和95.4-96.4％。WMV-2山西分离物CP的N端第10位氨基酸为Y，从而使对蚜传特性具有决定作用的结构域DAG改变为YAG。分别构建了含WMV-2 CP基因和ZYMV复制酶基因(NIb；缺失NIb保守序列GDD)的双价植物表达载体pBZW-31，含WMV-2CP基因、ZYMV复制酶基因(NIb；缺失GDD)和CMV复制酶基因(缺失GDD)的三价植物表达载体pBWCZ-44。并将此两种重组质粒分别转入根癌农杆菌菌株LBA4404中，供植物转化使用。
冯耿[2]2017年在《水稻条纹病毒胁迫下抗感品种的差异蛋白质组研究》文中认为由水稻条纹病毒(Rice stripe tenuivirus,RSV)引起的条纹叶枯病是一种重要病毒病害,给我国水稻生产带来严重的影响。病毒的侵染和寄主的防御是一个相互博弈的过程。为了完成自身的生命活动,病毒需要招募大量的寄主蛋白。而为了抵御病毒的入侵,植物则会产生大量的抗病相关蛋白,因此病毒与寄主间存在着复杂的互作关系,这种关系在蛋白质层面上则表现为蛋白质组的变化。因此,研究植物受病毒侵染影响的差异蛋白质组能够由表及里的阐明植物的抗病反应、症状形成机制等问题。本文利用iTRAQ技术分析了RSV侵染对高抗和高感水稻品种蛋白质组的影响,结果表明:高抗品种(镇稻88)共有541个蛋白发生了下调表达,496个蛋白发生了上调表达;在高感病品种(武育粳3号)则有544个下调表达蛋白和509个上调表达蛋白;其中两个品种共有的下调和上调表达蛋白分别有213个和207个。进一步通过RSV侵染后抗、感品种中上调蛋白的差异倍数的比对,获得了25个诱导性抗病相关蛋白。为了解诱导性抗病相关蛋白的功能及所参与的抗病反应,利用UniProt对其进行了GO注释,结果发现这些蛋白主要参与了活性氧代谢、次生代谢产物的生物合成、细胞的程序性死亡、翻译后修饰、细胞壁的结构增强等生命过程。通过对下调表达蛋白的生物信息分析发现,叶绿体蛋白受病毒侵染影响最大,其中包括牻牛儿基牻牛儿基二磷酸还原酶(Geranylgeranyl diphosphate reductase)、原叶绿素酸酯还原酶B(Protochlorophyllide reductase B)、镁离子螯合酶D亚基(Magnesium-chelatase subunit ChlD,CHLD)、氧依赖性粪卟啉原-III氧化酶(Oxygen-dependent coproporphyrinogen-III oxidase)、尿原卟啉原脱羧酶2(Uroporphyrinogen decarboxylase 2)和谷氨酸-1-半醛2,1-氨基变位酶(Glutamate-1-semialdehyde 2,1-aminomutase)等在内的9个蛋白参与了叶绿素的生物合成过程;包括1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基(Ribulose bisphosphate carboxylase small chain)、细胞色素f(Cytochrome f,Cytf)、叶绿体光系统I反应中心亚基II样蛋白I(Chloroplast photosystem I reaction center subunit II-like protein,PSI-D)、叶绿体中的NAD(P)H醌氧化还原酶亚基4L(NAD(P)H-quinone oxidoreductase subunit 4L)和叶绿体中的NAD(P)H醌氧化还原酶亚基J(NAD(P)H-quinone oxidoreductase subunit J)等在内的9个蛋白参与了光合作用。这些蛋白的下调表达可能导致寄主叶绿素的生物合成以及光合作用的受阻,从而导致叶绿体结构的破坏,使植株表现出黄化、褪绿等病害症状。为明确差异表达蛋白在转录水平上的差异,本文从上调表达蛋白中选择了微管蛋白α-1链(Tubulin alpha-1 chain)、多糖基二糖寡糖-蛋白质糖基转移酶亚基STT3B(Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit STT3B)、谷蛋白毒素-C6(Glutaredoxin-C6),Os02g0586400蛋白、铜-锌超氧化物歧化酶1(Superoxide dismutase[Cu-Zn]1)以及可能的V型质子ATP酶亚基H(Probable V-type proton ATPase subunit H)等6个可能与抗病反应的相关蛋白基因,从下调表达蛋白中选择了光系统I P700叶绿素a载脂蛋白A1(Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein A1)、细胞色素b6-f复合铁硫亚基(Cytochrome b6-f complex iron-sulfur subunit)、叶绿素还原酶B(Protochlorophyllide reductase B)以及镁离子螯合酶D亚基(Magnesium-chelatase subunit ChlD)、可能的V型质子ATP酶亚基H(Probable V-type proton ATPase subunit H)等4可能与症状形成相关的蛋白基因进行了RT-qPCR验证,结果表明这10个蛋白在转录水平和蛋白水平上差异趋势一致,说明了iTRAQ结果可靠。为进一步探索水稻条纹叶枯病的症状形成机制,利用酵母双杂交系统筛选了与镁离子螯合酶D亚基(CHLD)互作的病毒组分,结果表明,RSV的特异性蛋白(SP)能够与CHLD发生互作。随后构建了CHLD的超表达载体,并进行水稻的遗传转化,获得了33棵CHLD超表达植株,为了进一步探索CHLD在症状形成中的作用准备了实验材料。此外,利用高通量测序技术鉴定了贵州贵阳辣椒病毒病原,发现黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)、辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)和辣椒内源RNA病毒(Bell pepper endornavirus,BPEV)等多种病毒复合侵染是导致辣椒病毒病严重发生的主要原因。同时建立了BBWV2、ChiVMV、CMV和PVY四种辣椒病毒和小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)、甜瓜蚜传黄化病毒(Melon aphid-borne yellows virus,MABYV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)和西瓜隐潜病毒(Citrullus lanatus cryptic virus,CiLCV)等五种西瓜病毒的多重RT-PCR检测体系,为病害的早期诊断和有效防控提供技术手段。
胡京昂[3]2005年在《小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因介导的对西瓜病毒抗性的研究》文中研究指明通过病毒或植物来源的基因转化植物获得抗病毒的工程植株,已经成为生物工程中获得抗病毒资源的主要措施之一。病毒的外壳蛋白基因作为目的基因的转基因策略是研究最早、最成熟的技术,其介导抗性的机理(RNA水平或蛋白质水平)虽目前还存在争议,但由于RNA水平介导的抗性更安全、高效,已成为植物抗病毒基因工程研究的热点。本研究主要开展以下的工作: 1.构建非翻译的小西葫芦黄花叶病毒(Zuccini yellow mosaic virus,ZYMV)外壳蛋白基因植物表达载体。本研究以该病毒中国分离物外壳蛋白基因(不含起始密码子)的克隆载体ZCP-87为材料,利用分子生物学技术与pBin438载体连接构建非翻译的植物表达载体(重组质粒命名为:pBZCP5)。重组质粒经PCR和Sal Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切验证,均表明已将该病毒外壳蛋白基因克隆到植物表达载体上,本工作为利用植物基因工程培育抗病毒西瓜奠定了基础。 2.建立ZKM西瓜材料高效再生体系。该材料成熟胚的最佳消毒方案是70%酒精预处理30s,然后0.1%升汞消毒5min,无菌水冲洗3-5次,最适萌发培养基为0.8%琼脂糖,先暗培养3d,再转至培养室光照培养3d,种子萌发很快,无菌苗生长健壮。用生长一周后的无菌苗子叶作为外植体,适宜的诱导分化培养基是MS+2.0mg/L BA+0.1mg/L IAA,分化频率达97.7%,芽苗在MS固体培养基且附加KT浓度0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L时均可得到良好的伸长效果,都能促进芽苗生长健壮。西瓜转化体的卡那霉素(Kan)筛选浓度为100mg/L。 3.应用叶盘法将外源基因导入ZKM西瓜材料,再生苗在含有卡那霉素(Kan)的培养基上筛选培养,获得了抗卡那霉素抗性的芽,并对少许芽进行了PCR鉴定,已扩增出与目的基因大小一致的条带,这表明目的基因已经整合到植物基因组中。
秦新民[4]2005年在《NPR1基因的克隆及西瓜的遗传转化的研究》文中指出NPR1 基因为植物抗病基因表达和系统获得性抗性中的一个关键基因。本实验以PCR方法从拟南芥中克隆到NPR1基因,通过酶切,连接等技术构建了NPR1基因的植物表达载体。并以亲本西瓜品种”昌农黑冠”为材料,研究西瓜高频再生体系的建立,农杆菌转化过程中各种参数的确定,再生植株筛选、鉴定等问题。并以西瓜子叶为外植体通过农杆菌介导的遗传转化方法将NPR1 基因转入西瓜基因组中获得转基因再生植株;主要结果如下:以DNA-PCR 扩增的方法,从拟南芥中克隆到NPR1 基因,序列分析结果表明,该基因与发表的NPR1 基因序列完全相同。构建了NPR1 基因的植物表达载体——pCaMVNPR,并将该表达载体导入农杆菌,获得农杆菌基因工程菌株。在西瓜的组织培养中,不定芽的分化与外植体种类、苗龄、激素等因素密切相关。3～5 日龄的子叶诱导效果最好;BA 是诱导子叶芽分化的关键因素,但浓度在0.2～1.0mg/L 范围内对芽分化没有明显影响。诱导培养基内添加BA 即可使子叶外植体直接再生出不定芽,再生频率高,而且再生时间短,8-12 天可观察到不定芽的出现。筛选出的最佳诱导培养基为: 子叶:MS+BA1.0mg/L,再生频率为96%; 茎尖:MS+BA0.2mg/L,再生频率为100%。西瓜根的诱导比较容易,MS 基本培养基或添加少量的生长素IBA,NAA 等均能诱导根的分化,最佳生根诱导培养基为1/2MS+ NAA0.2+IBA0.05。农杆菌介导的遗传转化方法研究深入,技术方法成熟,使用广泛,是双子叶植物较为理想的转化方法。介导西瓜遗传的最适宜条件为:3d 苗龄的子叶预培养1d,侵染10-15min,共培养3d。非转化再生芽在含潮霉素20mg/L 的MS 诱导培养2~3周后,全部褪绿变枯,最后死亡。只有少数转化外植体在含潮霉素20mg/L 的诱导培养基上2~3 周后仍保持绿色, 并分化出再生芽。把抗性芽继代到MS+BA0.2+NAA0.05 的成苗培养基中培养。把1.5～2cm 高的植株切下,转接到含Hy 的生根培养基中进行生根筛选,但根对潮霉素等抗生素比较敏感,5mg/l 的潮霉素即可抑制西瓜根的分化。本实验共获得200 多株抗性植株,对部分西瓜转化试管苗进行微量DNA 提取,PCR检测12株,其中5株呈阳性,初步证明目的基因已经整合到西瓜基因组中。
张建新[5]2007年在《西瓜花叶病毒基因组全序列分析及其蚜虫体内受体蛋白的分离与鉴定》文中进行了进一步梳理西瓜花叶病毒(WMV)是马铃薯Y病毒属成员,由蚜虫以非持久性方式传播,广泛分布于世界各地,主要危害西瓜和甜瓜,引起花叶病。近几年该病害发生严重,已经成为制约西瓜和甜瓜高产稳产最主要的因素之一。本文完成了我国西瓜花叶病毒的基因组全序列的测定,在此基础上,克隆和体外表达了蚜传因子HC-Pro和CP蛋白,制备了相应抗体,利用Far western blot技术鉴定了其蚜虫体内的受体蛋白,并对三者互作关系进行研究,进一步阐明了非持久性传毒的分子机制。研究结果如下:1.利用RT-PCR和5′-和3′-RACE技术,克隆了西瓜花叶病毒基因组编码区和非编码区,经序列拼接,得到了WMV RNA的全长cDNA,GenBank登录号为DQ399708,命名为中国株系(WMV-CHN)。分析发现,WMV具有单链正义RNA基因组,全长为10037个核苷酸,具有单一的开放阅读框(ORF),5′-末端和3′-末端各有一段非翻译区(UTR),3′-末端具poly(A)尾序。ORF长9651个核苷酸,起始于密码子AUG位于第133～135位核苷酸,终止密码子UAA位于第9784~9786位,编码一个由3217个氨基酸组成的分子量为365.8kD的多聚蛋白。根据计算机分析,确定了WMV基因组的结构和相关保守基序。5′- UTR长132个核苷酸,富含A而少G(A占46.3%,G仅占6.1%),3′-UTR长254个核苷酸,富含T少C(T占近40%,而C仅占13%)。编码的多聚蛋白经自编码的蛋白酶裂解后可形成10个成熟蛋白,从N-端到C-端分别为P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP。WMV-CHN与法国株系(WMV-Fr)基因组同源性比较发现,整个基因组除3’-UTR比法国株系多2个核苷酸,其他区域数目相等。整个基因组核苷酸同源性为92.5%,多聚肽为92.4%,不同成熟蛋白之间核苷酸和氨基酸同源性分别为87.5%-96.8%和90.1%-100%,NIa-VPg核苷酸差异最大。把WMV-CHN的CP和其他国家的WMV CP核苷酸和氨基酸进行比对和同源性分析,结果发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%～95.0%和96.5%～98.6%。与其他Potyvirus属成员相比,同源性最高的是大豆花叶病毒(SMV),核苷酸和氨基酸同源性分别为78.4%和86.1%,其他依次是花生条纹病毒病毒(PStV)、菜豆普通花叶坏死病毒(BCMNV)、菜豆普通花叶病毒(BCMV)、黑眼豇豆花叶病毒(BCoMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV),核苷酸和氨基酸同源性分别为68.3%和70.9%,67.2%和71.2%,67.3%和70.3%,67.7%和70.9%,62.2%和62.9%。WMV的N末端与病毒进化密切相关,分析发现WMV-CHN的5’-UTR与近源的SMV、BCMV和PStV碱基数目相同,在N端有约50bp的保守区段。WMV P1蛋白N端的氨基酸与2个BCMV和3个PStV P1蛋白N端同源性较高,而C端与SMV同源性较高,WMV可能是BCMV或PStV与SMV种间重组的结果。2.将WMV CP基因定向插入EcoRI/Sal I切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导2-8h后,成功表达了分子量约为37kD的CP蛋白。通过不同时间诱导发现,加入IPTG 4h后蛋白开始表达,8h后表达量比较大。以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV CP抗血清,ELISA法测其效价为1/6400,Western blot分析能与CP发生血清学反应。3.将WMV HC-Pro基因定向插入EcoRI/Sal I切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WHC,转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导2-8h后,成功表达了分子量约为57kD的HC-Pro蛋白。通过不同时间诱导发现,加入IPTG 2h后蛋白就开始表达,继续诱导到8h后表达量变化不大。以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV HC-Pro抗血清,ELISA法测其效价为1/6400,Western blot分析能与HC-Pro发生血清学反应。4.将WMV HC-Pro基因定向插入EcoR I/Not I切开的pPIC9K中,构建了真核表达载体pPIC9K-WHC,经SalI单酶切后电转化Pichia pastoris GS115菌株,获得Mut+/His+表型高拷贝转化子。经1%甲醇诱导5d后,成功表达了分子量约为66kD的HC-Pro分泌蛋白。Western blot鉴定表明,表达蛋白可以和原核表达的HC-Pro蛋白的抗血清发生发生血清学反应,为筛选蚜虫体内传毒蛋白提供了基础。5.通过Far western blot技术,用HC-Pro蛋白做诱饵,在WMV传播介体桃蚜体内全蛋白中筛选出6种不同分子量蛋白,大小分别约86kD、84kD、66kD、63kD、48kD、46kD,均能与WMV HC-Pro结合的蛋白,其中与66kD和63kD蛋白结合反应较强;而在非介体条沙叶蝉的全蛋白中只筛选出出1种66kD蛋白,结合反应很弱,条带比较模糊;用CP做诱饵蛋白,在介体桃蚜和非介体条沙叶蝉没有鉴定出蛋白。6.用Far western blot研究了HC-Pro与CP之间的相互作用关系,结果发现,原核表达的CP蛋白能在NC膜上与HC-Pro特异结合,这不但验证了HC-Pro能与CP结合协助传毒的功能,说明体外原核表达的HC-Pro表现出与植物内分离的野生的蛋白有同样的生物功能。在研究受体蛋白、HC-Pro与CP三者互作时,受体蛋白结合HC-Pro后,不能再结合CP。综上所述,本研究对WMV基因组学进行了分析,通过用HC-Pro与CP作为诱饵,筛选到与蚜虫传毒相关的多种蛋白,为非持久性传毒机制提供了实验证据。
张大伟[6]2004年在《西瓜黄化花叶病合肥分离物的鉴定》文中研究表明西瓜、甜瓜、黄瓜、和南瓜等葫芦科作物是世界重要的经济作物。这些作物能被小西葫芦黄化花叶病毒（ZYMV）、西瓜花叶病毒-2号（WMV-2）、黄瓜花叶病毒（CMV）严重毁坏。虽然这些病毒不能使葫芦科瓜类作物死亡，但能为害它们自然生长过程，使果实产生畸形甚至绝产。我们从安徽合肥市郊区的西瓜病叶上分离出一病毒分离物代号为HF-WX。通过人工接种6科15种植物，结果发现有3科9种植物发病，其中西瓜Citrllus lanatus、南瓜Cucurbita moschata、西葫芦Cucurbita pepo表现黄化、花叶；苋色藜Chenopodium amaranticolor和千日红Gomphrena globosa表现局部褪绿斑。该分离物汁液钝化温度60～65℃，稀释限点为10-4～10-5，寄主体外存活期为20～23d。电镜观察病毒粒体为线状，长×宽=750nm×13nm，A260/A280的比值为0.84，病毒RNA含量为5.5％左右。该分离物与标准ZYMV抗血清及HF-WX抗血清呈阳性反应，与WMV-2、CMV、烟草花叶病毒（TMV）、南瓜花叶病毒（SqMV）抗血清呈阴性反应。与国内报道的ZYMV生物学特性极为相似。将分离物HF-WX在繁殖寄主西葫芦（早丰一号）上繁殖。用分离物HF-WX提纯物免疫母鸡和兔子，分别从母鸡蛋卵黄和兔子抗血清中提取免疫球蛋白IgY和IgG。测得IgY和HF-WX抗血清的效价为1/512和1/1024。蚜虫传毒实验表明，不同蚜虫种类对FH-WX的传播能力存在差异，传毒率为桃蚜>菜蚜>棉蚜、麦蚜。由于WMV-2与ZYMV生物学特性很相似，所以仅通过生物学检测很难区分WMV-2与ZYMV。为进一步确定分离物HF-WX的种类，我们进行了分子生物学研究。参考已发表的WMV-2序列（GenBank 登录号AB001994）和 ZYMV序列（GenBank 序列号AF435425）分别设计引物ZH1、ZH2和ZH4、ZH5，并进行PCR扩增。以ZYMV为引物的PCR反应获得840bp大小的目的片段，而以WMV-2为引物的PCR反应未得到目的片段。将PCR产物经XbaI、BamHI双酶切后，定向连接到质粒pGEM-3Zf(+)中，再转化入大肠杆菌Jm109中。以碱法提取质粒，分别以PCR法和双酶切法筛选阳性重组质粒pGEM-3Zf(+)/ZYMV- CP。挑取3个阳性克隆进行测序，测序结果完全一致，说明不存在由于DNA聚合酶引起的错配碱基，证明得到了准确CP基因序列。将分离物HF-WX CP基因序列登录GenBank,登录序列号为AY597207。分析CP基因序列并推导氨基酸序列发现：CP基因全长840nt，共编码279个氨基酸，与国内外报道的ZYMV-CP基因的核苷酸序列同源性为83.0%～97.3%，氨基酸序列的同源性为91.8%～99.8%。与GenBank中登录序列号为AF486823海南<WP=4>分离物同源性最高，核苷酸序列为97.3%，氨基酸同源性为99.8%。其中应用序列分析的16个ZYMV CP基因cDNA序列引自GenBank：AF435425、AF486822、AF486823、AF513551、AF513550、AF513552、AY074808、AY074809、AY074810、AJ429071、AJ459954、AJ459955、AJ459956、AB063251、D00692、D13914。应用DNAMAN软件以邻接法构建系统树，从核苷酸序列及氨基酸序列亲源关系角度分析各分离物间亲缘关系。将分离物HF-WX的复制酶、蛋白酶、VPg蛋白基因分为S1、S2、S3三个片段，长度均为1kp。根据已发表的ZYMV序列（GenBank 序列号AF127929），在S1、S2、S3三个片段的两端设计合成引物，并进行PCR扩增。琼脂糖凝胶分析表明,获得1kb大小的片段,与预期大小相符。通过以上生物学特性和分子水平的研究，可以确定分离物HF-WX为ZYMV。
徐千惠[7]2016年在《辽宁省蔬菜病毒病调查与鉴定》文中研究表明蔬菜病毒病是困扰蔬菜种植业的一大难题,无论是露地种植还是保护地栽培,病毒病都是制约蔬菜生产的重要因素之一,病毒病的发生会造成蔬菜减产甚至绝收,严重影响了蔬菜的品质。目前,辽宁省蔬菜病毒病系统性研究仍不完善,对病毒病的常发种类、分布特点、发生趋势还尚不明确,对一些在市场上具有良好前景的新兴蔬菜病毒病研究存在空白,对一些可造成严重损失的重要病毒还应继续关注。鉴于以上方面,本文对辽宁省蔬菜常发病毒进行了普查,对可以造成严重经济损失的重要病毒和近年来的新兴蔬菜病毒病进行了鉴定以明确病毒种类,为日后蔬菜病毒病的防治提供借鉴作用。1.针对辽宁地区主要蔬菜病毒进行普查,明确了我省蔬菜病毒病的分布特点、危害情况和病毒种类。2015年,在辽宁省采集茄科(番茄、辣椒)、葫芦科(黄瓜)、豆科(菜豆)、锦葵科(黄秋葵)、伞形科(三叶芹)等常见蔬菜类、保健蔬菜类和山野菜类多个蔬菜品种。使用烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)、蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus, BBWV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)的单克隆抗体,采用Dot-ELISA方法对常见蔬菜病毒病进行检测。在检测中,茄科样品主要检测TMV、CMV、PVY、BBWV、TSWV等病毒种类；豆科样品主要检测BBWV、TSWV等种类；葫芦科样品主要检测CMV、CGMMV等种类。常见蔬菜病毒病普查在辽宁省铁岭、锦州、新民、海城、凤城等五个地区22个乡镇共采集样品664份,包括常规蔬菜样品634份和重点调查的蔬菜样品30份。常规蔬菜共检测出117份阳性样品,检出率为18%。其中,TMV、CMV、PVY、BBWV、TSWV均有检出,平均检出率分别为11.2%、9%、2.8%、2.4%和0.9%,CGMMV在各地均未检出。从各科作物来看,茄科作物检出率较高为26.3%,葫芦科、豆科检出率分别为12.8%和13%。从各地区病毒发生情况来看,凤城地区蔬菜病毒种类较多,发生较重。此次调查中有12份样品被检测出有复合侵染的现象,占总检出率的1.9%,分别为TMV+CMV、TMV+BBWV、TMV+CMV+BBWV+TSWV的复合侵染。调查过程中,对曾为番茄产业带来毁灭性灾害的番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)和在辽宁省有持续蔓延、扩增的趋势的辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)进行重点调查；同时也针对保健类蔬菜黄秋葵和山野菜三叶芹上病毒病进行鉴定,以明确其病毒种类和变异情况,为日后该类蔬菜病毒病的研究及防治提供借鉴作用。2.针对辽宁地区番茄黄化曲叶病毒进行分子鉴定,明确了TYLCV的发生情况。在辽宁省新民、海城、锦州、沈阳、铁岭、凤城、阜新等地采样,采用分子生物学方法进行TYLCV的检测。针对在海城采集到的TYLCV样品选用背靠背引物进行全基因组序列扩增,经分离纯化、载体连接、序列测定后分析结果表明TYLCV海城分离物与山东TYLCV-SDCL (JQ038240.1)分离物核苷酸序列同源性最高为99.35%，基本无变异情况。在系统发育进化树中与其他国内、国外分离物同属一支可能拥有相同进化祖先。3.对在辽宁地区有加重趋势的PMMoV进行生物学、血清学、分子生物学鉴定。生物学检测中根据鉴别寄主反应症状：在心叶烟、三生烟、普通烟上产生枯斑,在苋色藜上产生褪绿斑点,初步判断为PMMoV侵染所致；经DAS-ELISA和RT-PCR检测,结果均为PMMoV;克隆获得PMMoV CP区域基因序列,通过核苷酸序列同源性比对后表明辣椒PMMoV辽宁分离物与河北保定PMMoV-BD (HQ699079)同源性最高为99.79%,且在系统发育进化树上同属一支。4.对营养价值丰富、市场前景广阔的保健蔬菜黄秋葵和山野菜三叶芹病毒进行了生物学、血清学和分子生物学鉴定。生物学结果表明黄秋葵、三叶芹上病毒在普通烟、苋色藜和千日红等指示植物上显症,根据症状初步判断为由TMV侵染所致。血清学检测结果表明三叶芹病样结果为阳性,从而进一步明确了病毒种类。分子生物学检测结果表明两者病样均为TMV侵染,通过克隆TMV部分基因序列,进行核苷酸序列同源性比对发现黄秋葵TMV分离物与云南昆明(HE818410.1)TMV分离物同源性最高为100%，并且在系统发育树上同出一支；三叶芹TMV分离物与贵州(HE818450.1)和云南昆明(HE818410.1)的分离物同源性相同为99.84%,并且在进化树也属于同一分支。
高金亮[8]2004年在《青海血蜱cDNA表达文库的构建和“隐藏抗原”基因的筛选、克隆与表达》文中认为青海血蜱(Haemaphysalis qinghaiensis)及其传播的血液原虫病严重威胁着我国畜牧业的发展。目前对蜱的防治主要以药物防治为主。但随着蜱耐约性的产生以及环境污染和药物残留等严重公共卫生问题的出现迫使人们寻求防治的新途径。在众多控制蜱的方法中，免疫学防制是前景最诱人的方法。本研究采用两种不同的免疫途径制备了羊抗青海血蜱唾液腺蛋白阳性血清和羊抗青海血蜱唾液蛋白阳性血清。应用Western Blot方法，将上述两种血清分别与青海血蜱唾液腺蛋白提取物杂交以进行蛋白的差异显示。结果表明羊抗青海血蜱唾液腺蛋白阳性血清能识别青海血蜱唾液腺更多的蛋白带。这些差异蛋白的分子量分别为49kDa、35.8kDa、31kDa和23.5kDa。通过制备性电泳，将所发现的差异条带切取回收并免疫家兔，获得兔抗青海血蜱差异蛋白阳性血清。以半饱血青海血蜱的唾液腺、马氏管和卵巢等器官为材料，构建青海血蜱的cDNA表达文库，库容量约为2×10~6pfu／ml。利用兔抗青海血蜱差异蛋白阳性血清对青海血蜱cDNA表达文库进行免疫学筛选，共获得Hq02、Hq03、Hq04、Hq05和Hq06等5个阳性克隆。经鉴定这5个基因均为青海血蜱所固有的新发现基因，它们的大小依次为1085bp、726bp、617bp、847bp利1178bp。在大肠杆菌中分别对Hq02、Hq04和Hq05基因进行了表达，利用表达产物免疫羊所得阳性血清能与青海血蜱天然蛋白发生免疫学反应。说明表达产物具有良好的免疫原性和反应原性。这为研制青海血蜱的分子疫苗奠定了基础。
参考文献：
[1]. 三种西瓜病毒的基因克隆及植物表达载体构建[D]. 牛胜鸟. 河南农业大学. 2000
[2]. 水稻条纹病毒胁迫下抗感品种的差异蛋白质组研究[D]. 冯耿. 中国农业科学院. 2017
[3]. 小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因介导的对西瓜病毒抗性的研究[D]. 胡京昂. 河南农业大学. 2005
[4]. NPR1基因的克隆及西瓜的遗传转化的研究[D]. 秦新民. 广西师范大学. 2005
[5]. 西瓜花叶病毒基因组全序列分析及其蚜虫体内受体蛋白的分离与鉴定[D]. 张建新. 西北农林科技大学. 2007
[6]. 西瓜黄化花叶病合肥分离物的鉴定[D]. 张大伟. 安徽农业大学. 2004
[7]. 辽宁省蔬菜病毒病调查与鉴定[D]. 徐千惠. 沈阳农业大学. 2016
[8]. 青海血蜱cDNA表达文库的构建和“隐藏抗原”基因的筛选、克隆与表达[D]. 高金亮. 中国农业科学院. 2004
标签：植物保护论文; 园艺论文; 核苷酸论文; 血清蛋白论文; 基因合成论文; 同源重组论文; 科学论文; 同源基因论文; 科普论文;