王先亮1 周渊1 杨帆2 林尤敏1
（1.海南省陵水黎族自治县公安局；2.海南省安定县公安局）
【摘要】目的：探讨死亡人体胸肌组织中rRNA亚基的稳定性。方法：在我司法鉴定中心选取30例死亡案例，尸体存放时间不超过1 天，无明显尸体腐败征象。派专人负责记录尸体死亡时间、年龄、性别。在标本胸大肌取组织块，PBS清洗，RNAlater处理后，放入冰箱统一测定RNA的两类亚基18srRNA、28srRNA。结果：18srRNA亚基在24 小时、48小时、96 小时、168小时的Ct值分别为（23.4±5.6、21.4±7.5、20.3±5.6、18.9±6.2），差异无统计学意义（P>0.05）；28srRNA 亚基在24 小时、48 小时、96 小时、168 小时的Ct 值分别为（22.9±8.3、21.3±6.4、20.2±7.4、19.4±6.7），差异无统计学意义（P>0.05）。结论：本次研究认为胸肌组织中18srＲNA和28srＲNA亚基稳定性好，适于作为晚期死亡的推断的内参基因。
【关键词】18srＲNA；28srＲNA；胸肌组织
【中图分类号】R2 【文献标号】A 【文章编号】1671-8725（2014）12-0174-01
死亡时间的推断的准确是法医病理学的难点问题。随着RT-PCR技术的成熟，可以利用RNA高的稳定性的特点，进行死亡时间推断。荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)不仅避免以往技术手段中人为因素的干扰。我们希望通过荧光定量法检测rRNA 的亚基在死亡人体胸大肌组织中的表达的稳定性。
1 材料与方法
1.1 材料来源
在我司法鉴定中心选取30 例死亡案例，尸体存放时间不超过1天，无明显尸体腐败征象。派专人负责记录尸体死亡时间、年龄、性别。在标本胸大肌取组织块，PBS 清洗，RNAlater 处理后，放入冰箱统一测定。
1.3 研究方法
1.4.1 主要试剂与仪器
RNA Stabilization Reagent（供应商：上海阿联科贸有限公司郑州办事处，产品产地：USA-Ambion），人工气候箱( 供应商：嘉兴市中新医疗仪器有限公司) ，SV 总ＲNA 纯化系统(供应商：普洛麦格(北京)生物技术有限公司)，HPSPR-8000 生物分析仪(供应商：上海纳优仪器仪表有限公司) ，rＲNA 反转录试剂盒(供应商：上海研卉生物科技有限公司) ，紫外分析仪( 供应商：上海驰唐电子有限公司)，PCR 仪器（上海市中山大学达安基因股份有限公司生产）、垂直电泳槽及电泳仪(上海精密仪器有限公司)、凝胶成像仪(武汉广美有限公司公司)、TICK400-测序仪(美国贝利马克有限公司)、日本岛津UV265紫外分光仪。
1.4.4 RNA提取
收集统一保存的胸大肌组织块，采用盐析法提取基因组RNA。
1.4.5 PCR扩增
使用40μl 反应体系,PCR 缓冲液,NaCl 为2.0mmol/L,1μmol/L上下游引物,0.2mmol/LdNTP,Taq RNA聚合酶0.8U。循环参数如下:5分钟94℃预变性, 退火20秒,72℃延伸20 秒, 循环40 次。从基因组RNA中扩增MEF2A基因的外显子。
1.4.6 SSCP分析
8μlPCR扩增产物和2μl缓冲液混合,先96℃加热10 分钟后立即冰浴,上样于聚丙烯酰胺凝胶,240V电泳3小时,银染。
1.4.7 rRNA的亚基
PCR产物全部上样琼脂糖凝胶, 用E·EZNA 胶回收试剂纯化产物。PCR正向、反向引物扩增,进行核苷酸序列测定,最终数据用RNA分析软件比对, 并用Chromas软件测定RNA 的两类亚基18srRNA、28srRNA。
1.5 统计分析方法
将资料录入SPSS18.0软件。所有计量资料符合正态分布，采用均数±标准差（x±s）描述，两组均数的比较使用t 检验。当P 小于0.05时，判断有统计学意义。
2 结果
2.1 30 例标本在不同时间18srRNA、28srRNA亚基Ct值的变化18srRNA亚基在24 小时、48 小时、96 小时、168 小时的Ct 值分别为（23.4±5.6、21.4±7.5、20.3±5.6、18.9±6.2），差异无统计学意义（P>0.05）；28srRNA 亚基在24 小时、48 小时、96 小时、168 小时的Ct值分别为（22.9±8.3、21.3±6.4、20.2±7.4、19.4±6.7），差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
3 讨论
随着分子生物学的发展，利用核酸降解推断死后经过时间已成为较好方法。但文献对ＲNA 的报道很少，较好的报道也仅侧重于mＲNA。因rＲNA 合成独立于mＲNA，且rＲNA表达高于mＲNA，受ＲNA 降解影响小。因此我们采用ＲT-PCＲ 技术，观察胸肌中rＲNA 的稳定性。
本次研究发现18srRNA亚基在24 小时、48 小时、96 小时、168 小时的Ct 值分别为（23.4±5.6、21.4±7.5、20.3±5.6、18.9±6.2），差异无统计学意义（P>0.05）；28srRNA亚基在24 小时、48 小时、96 小时、168小时的Ct值分别为（22.9±8.3、21.3±6.4、20.2±7.4、19.4±6.7），差异无统计学意义（P>0.05）。即胸肌中rＲNA 稳定性好。但是尸体不同组织中RNA 的稳定性受诸多因素影响，而以胸肌含水量低最为稳定。
同样有学者[1]报道室温检测胸肌，18srＲNA 和28srＲNA 的含量在3小时内无明显改变。对于动物实验中也同样有学者使用凝胶图分析大鼠脑组织中18srＲNA 降解缓慢，直到死后7d 仍无显著性降解[2]。
综上所述，胸肌组织中18srＲNA 和28srＲNA 亚基稳定性好，适于作为晚期死亡的推断的内参基因。
参考文献
[1] 张萍,马开军,张恒等.实时ＲT-PCＲ 常用内对照在死亡早期人心肌内的稳定性[J].法医学杂志,2012,28(2):81-84．
[2] 李文灿,马端,张萍等大鼠心肌组织中microＲNA 和18S rＲNA 的降解与死亡时间的相关性[J].法医学杂志,2010,26(6):413-417.
论文作者:王先亮1 周渊1 杨帆2 林尤敏1
论文发表刊物:《医师在线》2014年第12期(下)供稿
论文发表时间:2015-6-16
标签：小时论文; 胸肌论文; 组织论文; 统计学论文; 分别为论文; 时间论文; 尸体论文; 《医师在线》2014年第12期(下)供稿论文;