许磊
（天津民祥生物医药股份有限公司 天津 300000）
【摘要】目的：确定石斛总多糖的最佳提取工艺及含量测定方法。方法：通过正交实验，采用苯酚-硫酸法测定的多糖含量为指标，研究提取温度、提取次数、提取时间、料液比对石斛总多糖提取率的影响。结果：石斛总多糖最佳提取工艺条件为提取温度为100℃、提取时间为2h、料液比为5:4。结论：该工艺简单、方便、快捷，可用于不同品种石斛总多糖的提取。
【关键词】石斛；总多糖；单因素；正交试验；含量测定
【中图分类号】R284.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）27-0368-02
石斛为兰科植物马鞭石斛、铁皮石斛、环草石斛、黄草石斛的新鲜或干燥茎，被称为“九大仙草”之首，为珍稀、名贵、道地中草药，当下多以其总多糖含量的高低来判断石斛品质的优劣。本研究以总多糖含量为指标，通过正交实验，优化并最终确定了石斛总多糖的最佳提取工艺，以期为石斛总多糖的提取工艺研究提供参考和借鉴。
1.材料与试剂
石斛采自安徽省霍山县，无水葡糖糖、苯酚、硫酸等化学试剂均为分析级，实验用水均为Milli-Q超纯水机制备（密理博（上海）贸易有限公司）。紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；LC-4016型低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；十万分之一天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；双层铁皮电炉（上海日用电炉厂）。
2.方法与结果
2.1 石斛中总多糖含量的测定
2.1.1对照品溶液的制备
取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，于100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，制成每1mL含90μg/mL的溶液，即得对照品储备液。
2.1.2供试品溶液的制备
取石斛粉末（过三号筛）约0.12g，精密称定，加水80mL，加热回流2小时，放冷，转移至100mL量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置15mL离心管中，精密加入无水乙醇10mL，摇匀，冷藏1h，取出，离心（转速为每分钟4000转）20min，弃去上清液（必要时滤过），沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次8mL，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至25mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。
2.1.3总多糖含量的测定
精密量取供试品溶液1mL，置10mL具塞试管中，精密加入5% 苯酚溶液 1mL，摇匀，再精密加硫酸5mL，摇匀，置沸水浴中加热20分钟，取出，置冰浴中冷却5分钟，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（2015药典通则0401），在488nm的波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的量，计算，即得。
总多糖提取率=总多糖质量/原药材的干品重量×100%。
2.1.4标准曲线的制备
精密量取对照品溶液0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分别置10mL具塞试管中，各加水补至1.0mL，振摇，精密加入5%苯酚溶液l.0mL（现配现用，注意避光），摇匀，再精密加硫酸5mL，摇匀，置沸水浴中加热20分钟，取出，置冰水浴中冷却5分钟，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（2015药典通则0401），在488nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。在9.016～90.160 µg/mL范围内线性良好（y=0.00881x+0.11252，R2=0.99904）。
2.1.5精密度实验
按标准曲线确定的范围内，精密吸取葡萄糖对照品溶液6份，各1mL，按照2.1.3项下操作测定吸光度，计算RSD=2.4%，精密度良好，符合方法学要求。
2.1.6稳定性实验
在标准曲线确定的范围内，精密吸取2.1.2项下制备的供试品1mL，分别于0h，2h，4h，6h按照2.1.3项下操作测定吸光度，计算其RSD=0.88%，稳定性良好，符合方法学要求。
2.1.7重复性实验
在标准曲线确定的范围内，精密量取2.1.2项下制备的供试品1mL，按照2.1.3项下操作测定吸光度，连续测定6次，计算RSD=3.2%，重复性良好，符合方法学要求。
2.1.8加样回收率实验
取已知含量的石斛粉末100mg，精密称定，共六份，分别加入适量的对照品溶液，按照2.1.3项下操作测定吸光度，计算提取回收率，RSD=3.4%，加样回收率合格，符合方法学要求。
2.2 石斛总多糖提取工艺考察
以提取温度、提取时间、料液比、提取次数为因素，选用L9（34）正交表进行正交实验（表1）。进而得到石斛总多糖加热回流提取的最优条件。石斛总多糖最佳提取条件正交实验表见表2。
从表3计算结果可知，石斛总多糖提取效果的因素影响为C>A>B>D，最佳工艺的组合为A1B3C2D2。以极差最小的D因素为误差项进行方差分析，结果显示C因素对石斛总多糖提工艺具有显著性影响，结合生产实际与成本考虑，选择A1B3C2D2，即料液比为100:80（mg/mL），提取温度为100℃，提取时间为2h，提取次数为2次。
3.讨论
通过研究，我们发现对于石斛的总多糖成分的提取影响因素比较多的是提取时间>料液比>温度>提取次数，最终我们得到的结果是在石斛总多糖的提取过程中应优先考虑提取时间的影响，综合其他影响因素，得出最佳具有方便，经济，有效率的提取工艺。
石斛经过加热回流法提取，最后采用苯酚-硫酸法进行测定其总多糖的含量，该方法简洁、方便、适用性强，用来评价石斛质量的优劣，具有重要的的意义。对于石斛产业的发展具有巨大的促进意义。
【参考文献】
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[2]张炜玲,王新生,戴亚峰,等.响应面法优化霍山米斛多糖提取工艺[J].安徽农业科学,2012,40(12):7061-7064.
[3]纵伟,李翠翠.石斛多糖超高压提取工艺条件的优化[J].郑州轻工业学院学报(自然科学版),2012,27(4):36-39.
论文作者:许磊
论文发表刊物:《医药前沿》2018年27期
论文发表时间:2018/11/23
标签：石斛论文; 多糖论文; 精密论文; 溶液论文; 光度论文; 工艺论文; 正交论文; 《医药前沿》2018年27期论文;