（1协和干细胞基因工程有限公司；天津 300384 ；2中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）；天津300020）
【摘要】目的：探讨在大肠杆菌中HCV重组基因的表达条件及临床应用。方法：采用不同培养方式对含有丙肝炎症病毒E基因、C基因和NS基因进行重组表达，并将表达蛋白抗原进行提取、纯化，并采取一定操作对表达产物进行检测。结果：经检测，重组表达物中含有特异性HCV抗原，对100份血清样本进行试验，其中50份为参比血清，其阴性检测符合率为96.0%，50分血清阳性检出率为92.0%。
关键词：HCV重组基因；大肠杆菌；丙型肝炎病毒
在本次研究中，我研究中心将HCV重组基因在大肠杆菌中的表达条件和测定结果进行研究，以100份国家参比血清样本作为检测对象，对检测结果进行测评，具体内容如下：
1资料与方法
1.1基本资料
HC-1蛋白表达及提取：将已转化在大肠杆菌中的HCV重组基因质粒，在含有氨苄青霉素的LB中，温度设定为30℃，进行复苏，经过振摇、菌种扩增，次日转入大瓶，温度同样为30℃，培养3小时后，温度调整为42℃，继续培养4-5小时，以转速为5000r/min进行离心，时间为15分钟。之后洗涤，再离心，之后将菌种放置于预冷的超生液中，用超声破碎仪进行破碎，频次为60s/次，操作10次。之后以转速为10000r/min进行离心，15分钟后去上清液，沉淀物则为包涵体。用7mol尿素对包涵体进行超声溶解，并进行10000r/min进行离心，15分钟后，其上清液为粗提蛋白抗原，即HC-1蛋白提取物。
HC-2蛋白表达及提取：将温度设定为37℃，对菌种进行培养，12小时后，温度调整为42℃，12小时后，转入大瓶，同样在37℃下进行培养，3小时后温度调整为42℃，5小时后，采用同上方法进行提取，此为HC-2蛋白提取物。
HC-3蛋白表达及提取：将温度设定为37℃，培养，次日转入35℃细胞培养箱，静置斜放至下午5点，之后转入35℃摇床中培养，3小时后，温度调整为4℃，次日上午转入大瓶培养，3小时后，温蒂调整为42℃，4小时进行提取，方法同上，此为HC-3蛋白提取物。
1.2方法
对表达物进行鉴定，1）血清样本选取。选取我省疾病防控中心门诊部体检血清100份为研究样本，包含阴性参比血清、阳性参比血清各50份。2）配备实验材料。实验中所需的HRP标记物，1:10000使用，包括稀释液、洗涤液、终止液、底物进行配备。3）蛋白抗原的包被与封闭。将粗体的蛋白按照1:200进行稀释，并将稀释后蛋白抗原放置于ELISA硬板条中，每孔放置100ul，温度设定为4℃，进行包被，16小时后，倒掉包被液，加入110ul封闭液，温度设定为37℃进行封闭，2小时后倒掉封闭液，室温下吹干，可进行检测。4）人体血清检测。对以上蛋白抗原提取物板条进行检测，将血清按照1:10比例进行稀释， 每孔加入100ul，设阴性孔和空白孔进行对照。在温度设定在37℃湿盒中培养30分钟，之后洗涤4次，将经过1:10000稀释的HRP抗人Ig加入湿盒，继续培养30分钟，再洗涤4次，之后拍干，加入底物A、B各1滴，在37℃下显色10分钟，之后每孔加入50ullom/LH2SO4终止反应，并进行检测，其中P/N≥2.1为阳性。4）采用以上方法对100份血清样本进行检测。
2结果
2.1采用ELISA对蛋白表达物的鉴定
经检测，2份血清为疑似丙肝抗体阳性，HC-1蛋白提取物和HC-C蛋白提取物经包被后，与其他血清检测结果一致。而HC-2、HC-3蛋白提取物包被后与HC-C相比，对阴性、阳性血清样本的检测结果差别较大，其中有20份阴性血清中出现8分假阳性反应，而20份阳性血清中出现6份漏检的情况。
2.2对100份血清样本测定结果统计
对100分国家标准血清样本进行测定，结果显示50分阴性参比血清样本，有2份为阳性，其余均为阴性，阴性符合率为96.0%。而在50份阳性参比血清样本中，有4份漏检，检出率为92.0%。具体数据如表1所示。
3讨论
大肠杆菌蛋白表达受特异蛋白表达量和不同纯化方法的影响较为明显，为此我研究中心对不同培养环境下丙肝重组基因的表达进行研究。结果显示，HC-1蛋白表达与HC-C蛋白完全一致，说明HC-1的表达条件较好。而HC-2、HC-3蛋白表达和HC-C相比，有很大差异，原因在于前二者非特异性成分较多，而特异性蛋白表达量不足，从而说明HC-2、HC-3表达条件下培养的表达物不适合重组基因的表达。血清样本检出率方面，效果较好，阴性血清符合率为96.0%，而阳性检出率为92.0%，说明HCV重组基因的在大肠杆菌中的表达敏感度较高，由此说明我研究中心研制的HCV重组抗原达标，特别是对抗原的进一步纯化后，HCV抗体的灵敏度和特异性显著提高。
参考文献：
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[3]赵玫.HCVNS2、NS3/4A蛋白对人肝癌Huh7细胞基因组稳定性的影响[D].山西医科大学,2018.
论文作者:谢云富1 王艳生2
论文发表刊物:《医师在线》2019年7月13期
论文发表时间:2019/10/25
标签：血清论文; 蛋白论文; 基因论文; 大肠杆菌论文; 阳性论文; 抗原论文; 阴性论文; 《医师在线》2019年7月13期论文;