关键词:心型脂肪酸结合蛋白；化学发光法；方法学评价
心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）由10条反平行的β链折叠排列，形成一个蛤壳形结构，顶端有两个α螺旋相邻，其内部呈现一个较大的空腔［1］，共有132个氨基酸组成。H-FABP分子量小，为12-16KD，其等电点PI为5.1，是一种酸性可溶性蛋白。在患者发生心肌损伤或者心肌缺血时，H-FABP会迅速释放至血液中，其浓度变化在早期心肌损伤标志物中表现突出，使之能够应用于心肌损伤和心肌缺血的早期辅助诊断［2］。目前检测H-FABP的方法主要有时间分辨免疫荧光法，免疫比浊法，免疫传感器测定法，酶联免疫法，免疫层析法等多种方法。化学发光法结合高灵敏度的化学发光技术和高特异性的免疫反应，目前广泛应用在各种抗原，半抗原，抗体，药物，激素等项目的检测。目前采用化学发光法检测H-FABP的试剂盒比较少，为此我们初步建立了定量检测H-FABP的化学发光试剂盒，并对该试剂盒进行评价，以评估各项性能指标是否能够满足临床需要。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1实验样本
血清样本：采集2018年10月到2019年4月的37例胸痛患者及50例体检人群的血液3ml，离心取上清液后，分装-20℃保存。
1.1.2试剂与仪器 初步建立的心型脂肪酸结合蛋白化学发光检测试剂盒，批号为181011，仪器采用安图化学发光免疫分析仪，心型脂肪酸结合蛋白免疫比浊法试剂为英国朗道实验诊断有限公司，批号为448222，仪器采用日立7600 全自动生化分析仪。
1.2方法
1.2.1检测原理 免疫比浊法原理：共价包被有H-FABP抗体的乳胶微球与含有H-FABP的待测样本混合时，由于抗原抗体的特异性反应，乳胶微球会发生凝集，从而提升浊度，而浊度的变化与样本中的H-FABP含量成正比。化学发光法原理：样本中的H-FABP与包被有H-FABP单克隆抗体的磁珠反应后，再与标记有辣根过氧化物酶HRP的H-FABP单克隆抗体反应，温育清洗后，加入发光底物后，测定发光强度，发光强度与样本中H-FABP含量成正比。
1.2.2 统计方法 用 SPSS18.0 进行数据分析。对于符合正态分布的数据，以均数±标准差 （x±s） 表示，采用 t 检验比较两种方法是否有差异，检验水准 α＝0.05。
2 结果
2.1 精密度 根据 CLSI EP9-A2 文件对精密度评价的要求，以三种不同浓度的混合血清作为实验样本，浓度包含高中低三个梯度，用化学发光法试剂在安图化学发光仪上连续测定 20 次，计算出均值、标准差和变异系数得到批内精密度结果，再将此三种混合血清每天上午和下午各测定1 次 ，每次重复测定2次，连续测定20d，计算出均值、标准差和变异系数得到批间精密度相关结果，具体结果见表1。
表1 化学发光法测定H-FABP的批内和批间精密度结果
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2.2 线性 将146.47ng/ml的临床样本作为高值样本（H），0ng/ml的临床样本作为低值样本（L），依照10L，9.96875L+0.03125H，9.9375L+0.0625H，9.875L+0.125H，9.75L+0.25H，9.5L+0.5H，9L+1H，8L+2H，6L+4H，2L+8H，10H比例配制成11个浓度梯度的样本，每个样本用化学发光法试剂在安图化学发光仪上重复测定三次，计算平均值作为实测值。以每个样本的理论浓度作为横坐标，实测浓度作为纵坐标，进行线性回归分析，结果显示，H-FABP浓度在1.87ng/ml～146.47ng/ml范围内有良好的线性，线性相关方程为：y=0.9751x-0.4516, r=0.9996。
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图1 化学发光法线性
2.3 准确度 H-FABP项目无国家或国际标准品，所以通过回收率来衡量试剂的准确度。将浓度为61.29ng/ml，64.32ng/ml，86.12ng/ml的血清样本样本分为2份，每份100ul，其中分别加入900ul的0ng/ml样本，每个样本重复测定3次，结果取平均值，计算回收率，结果见表2。
表2 化学发光法测定H-FABP的回收率.png)
2.4 干扰实验 取浓度为5.51ng/ml和31.89ng/ml的H-FABP临床样本，每份样本分为4份，一份对照，另外三份中分别加入浓度为500mg/dL的血红蛋白，500mg/dL的甘油三酯，30mg/dL的胆红素，每份样本重复测定三次，计算平均值，观察不同浓度的干扰物是否会影响H-FABP的检测，结果见表3。
表3 化学发光法测定H-FABP的干扰实验结果
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2.6 方法学比对 选择40份新鲜临床样本，浓度梯度分布在0～150ng/ml，同时使用化学发光法及免疫比浊法测定H-FABP含量。每天测试8个样本，各测两次取平均值，连续测定5天，以免疫比浊法结果为横坐标，化学发光法为纵坐标，进行线性回归分析，回归方程为：y=1.0018x-0.0863，两者相关性较好，r= 0.994，见图2。
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图2 两种方法学相关性分析
3讨论
急性心肌梗死发病急，死亡率高，且发病率逐年上升，及时诊断，明确病因，是降低死亡率的关键。目前常用的用于辅助诊断心肌损伤的标志物有心肌肌钙蛋白I、心肌肌钙蛋白T、肌酸激酶同工酶，肌红蛋白等。Glatz等对79名健康人和83名AMI患者进行研究，结果显示：对AMI的诊断灵敏度，H-FABP为78%，MYO为53%，CK-MB为57%［3］。H-FABP与MYO对于心肌损伤的早期诊断具有相同的时效性,但它的诊断特异性和敏感性方面优于MYO。H-FABP在心肌组织中的含量只有MYO的1/5，但是正常情况下，血中H-FABP的含量只有MYO的1/16。另外，骨骼肌中也含有丰富的MYO，因此在骨骼肌受损时，MYO也会大量释放进入血液当中，而H-FABP心肌含量占总含量的90%左右，所以H-FABP诊断特异性要高于MYO。在AMI首次发作时，H-FABP在 1.5～3 h 内开始升高，6～8 h达高峰，12～ 24h恢复正常 ［4］，对于心肌损伤的诊断具有很高的特异性和灵敏度。
检测H-FABP方法学众多，其中放免法具有放射性污染，操作时间长等缺点，无法满足临床使用需要，酶联免疫法较为成熟，但是操作繁琐，检测时间长。免疫层析法可以检测全血样本，而且操作快捷方便，可以在15min以内报告结果，但是控制重复性是一个仍需要攻克的难题。时间分辨法是利用Eu螯合物作为标记物的免疫分析法，其检测灵敏度高，需要特殊仪器，目前应用不多。而免疫比浊法使用的样本量和试剂量极少，结合免疫分析仪可以进行大批量的临床样本检测，实用性较高［5］。而化学发光法则是近些年被越来越认可的一种高灵敏度检测方法，利用化学发光法开发心型脂肪酸结合蛋白，结合小型化学发光免疫分析仪可以使得检测应用场景得以延伸，能够适用于床旁快速检测。
为评估建立的化学发光法心型脂肪酸结合蛋白试剂盒的可靠性，本文依 CLSI EP文件要求对试剂盒的性能进行了初步评价，结果显示该试剂盒重复性好，批内和批间重复性均在5%以内，平均回收率为 95.2%，在 1.87ng/ml～146.47ng/ml范围内线性良好，抗干扰能力强，与目前进口朗道的免疫比浊法试剂具有较好的相关性。因此，化学发光法测定 H-FABP 具有较好的试验性能，能够满足临床的需求。
参考文献：
1.Ghani F,Wu AHB,Graff L,et al. Role of heart-type fatty acid-binding proein in early detection of acute myocardial infarction［J］.Clin Chem,2000,46:718-719
2.McCann CJ， Glover BM， Menown IB， et al． Novel biomarkers in early diagnosis of acute myocardial infarction compared with cardiac troponin ［J］．Eur Heart J， 2008，29( 23) : 2843 － 2850．
3.Glatz JFC.Fatty acid-binding protein and the early detection of acute myocardial infraction ［J］.Clin Chim Acta,1998,272:87.
4.张静，王欣，徐晓非. 急性心肌梗死中H-FABP 和 NT-proBNP检测的临床意义［J］. 山东医药，2008，48（14）：75-76.
5.冯建忠 李铁军.心型脂肪酸结合蛋白的临床应用及测定方法研究进展［J］.临床和实验医学杂志,2012,11（1）：73-74 .
论文作者:杨振鹏,尚晓楠 李双法 于林
论文发表刊物:《中国医学人文》2020年3期
论文发表时间:2020/4/9
标签：样本论文; 化学论文; 免疫论文; 心肌论文; 脂肪酸论文; 蛋白论文; 浓度论文; 《中国医学人文》2020年3期论文;