吴小军[1]2008年在《Nogo-B在人胶质瘤组织和微血管内皮细胞中差异表达的研究》文中认为颅内绝大多数肿瘤都起源于星型细胞、少突胶质细胞、许旺氏细胞或其前体细胞,它们是神经元的支持细胞,这些肿瘤中以星型细胞瘤最为常见,占中枢神经系统肿瘤的40%以上。WHO按组织病理学将星型细胞瘤分为4级:Ⅰ级和Ⅱ级星型细胞瘤为低度恶性,而Ⅲ级和Ⅳ级为高度恶性。Ⅲ级胶质瘤很容易发展为Ⅳ级星型细胞瘤,即多型胶质母细胞瘤。胶质瘤新生血管的形成在肿瘤发生发展过程中起着重要作用,低度恶性胶质瘤低到中度血管化,而高度恶性的胶质瘤具有较高的血管密度。我们知道,肿瘤扩张必须通过血管生成,即“血管化转换”(Angiogenic switch,AG),以获取氧气和营养,AG是通过肿瘤表达促血管生成因子(包括多肽和蛋白)而完成的,促血管生成因子的生成与环境信号和遗传因子有关,主要包括缺氧、低PH值、低血糖、肿瘤内压力增加、免疫系统所诱发的免疫反应、基因突变等等。研究表明,胶质瘤血管在结构和功能上都与正常血管不同。例如,肿瘤血管缺乏保护性的生长调节机制,并缺乏有功能的组织特异性血管周细胞。此外,血管并不总是由同源性的内皮细胞层所构成,有时肿瘤细胞和内皮细胞混杂在一起,肿瘤血管管腔差别较大,通透性较高。胶质瘤表现为高度血管化,并且微血管与正常血脑屏障不同,血管通透性增高,由此可引起脑水肿。此外,胶质瘤脑血管超微结构的研究发现微血管内皮之间紧密连接出现异常,紧密连接蛋白的缺失与血脑屏障的开启密切相关。另外,肿瘤血管形成需要不同的分子信号。例如内皮细胞的趋化和增生信号,细胞基质受体的表达,与细胞外基质降解相关的蛋白酶的表达等。Nogo-B蛋白是一类中枢髓鞘源性抑制蛋白,是抑制中枢神经元轴突再生的抑制因子,分布广泛,在神经系统中高表达。在外周组织如血管组织、肾脏、肺脏、软骨、肾脏、皮肤、脾中也有表达。组织损伤后Nogo-B的作用首先表现在参与中枢神经系统轴突再生抑制。Neuron杂志2003年发表了3篇有关Nogo基因缺陷小鼠文章。Strittmatter和同事发现Nogo-A/Nogo-B缺陷小鼠的轴突再生能力改善;Tessier-Lavigne团队分别制造出Nogo-A,B,C3亚型同时缺失模型和Nogo-A,B缺失模型,未发现轴突再生改善;Simonen等人报道伴随Nogo-A缺陷小鼠轴突生长抑制作用降低,中枢神经系统中Nogo-B表达上调。虽然以上文献报道有关Nogo-B功能略有矛盾,但是在某种程度上证明了Nogo-B参与中枢系统损伤后再生。2004年Nature Medicine上的一篇文章充分揭示了Nogo-B限制外周血管损伤后的再生。Acavedo等人采用质谱分析和RT-PCR等技术首先发现血管的内皮细胞和平滑肌细胞中Nogo-B高表达,进而将其功能片段分别引入这两个细胞系,发现Nogo-B促进内皮细胞的迁移和抑制平滑肌细胞的再生,采用Nogo-B缺失小鼠研究发现,股动脉损伤后平滑肌细胞再生活跃造成血管闭塞,转染Nogo-B后平滑肌增生减弱。国内Jing-Wei Pan等在2007年发表了Nogo-B和主动脉内皮细胞的关系的文章。文章报道在粥样硬化斑块组织中Nogo-B的mRNA和蛋白表达下调和动脉瘤的形成密切相关,Nogo-B在其中起保护血管的作用。在国外有研究建立了体外细胞模型,发现了Nogo-B更值得关注的功能,其可溶性N端片段对于内皮细胞具有显着的类似VEGF样趋化修复作用,但对于血管平滑肌细胞有阻断PDGF诱导的增生作用。该发现产生了巨大影响,Raines EW在Nature Medicine上作出“Nogo-B为血管病变安装了闸门”的评论,高度评价了Nogo-B在血管病变中的重要功能。但是Nogo-B在血管病变损伤中的作用机制仍未能完全明确。英国Rousseau S等的意外发现表明,Nogo-B为SAPK2a/p38a通路中MAPKAP-K2的磷酸化底物,提示Nogo-B活性与MAPKs通路密切相关。MAPKs信号通路由一组以级联方式依次活化的丝/苏氨酸蛋白激酶组成,将与细胞膜受体结合的胞外刺激逐级放大并传导到细胞内,调节效应分子参与细胞生长、分化和凋亡等阶段的病理生理活动。其中P38和P42/44已被证明在内皮细胞的迁移和平滑肌细胞增殖中起重要作用。Nogo-B在MAPKs通路中的功能为Nogo-B的机制研究提供了线索,提示Nogo-B对血管的保护作用与MAPKs通路有关。除了对调节血管生成的作用外,Nogo-B对肿瘤起了到底什么作用?有文献报道Nogo基因表达导致肿瘤细胞凋亡,这个基因在恶性肿瘤细胞系中有一个很强的促凋亡倾向,例如SaOS-2,HT-1080等。这些发现表明Nogo基因是一种新型促凋亡基因。研究表明这些凋亡蛋白位于内质网上,它编码内质网reticulum靶蛋白,其通路和目前已知的前凋亡蛋白不同,在肿瘤细胞中该基因的丢失非常明显。尽管研究表明Nogo-B基因导致凋亡,它不和目前已知的任何一种凋亡相关基因或者功能域同源。相反,它有独特的功能基序,即在它的C末端有一个重复赖氨酸内质保守基序,这个抗凋亡作用与该C-末端分子区域有关,但目前尚不清楚这一作用是否与NgR有关,Nogo-B可与内质网上促凋亡基因Bcl-x1、Bcl-2作用,诱导内质网张力改变和Ca~(2+)内流,影响肿瘤生长。对于中枢神经系统肿瘤,特别是胶质瘤,目前只有Nogo-A方面的研究内容。Nogo-A的胞外功能域Nogo-66和髓鞘相关糖蛋白(Myelin-associated glycoprotein,MAG)可以让人胶质瘤细胞系U87MG的黏附性和迁移能力显着下降。他认为Nogo-66和MAG可以通过NgR激活,调节胶质瘤生长和迁移,这个现象具有潜在的临床治疗应用价值。但是目前尚没有Nogo-B和胶质瘤的报道。更多的是VEGF、PDGF等常见血管增殖相关生长因子方面的研究。我们知道VEGF是一种与血管增殖相关生长因子,又称血管通透性因子。其主要生物学活性有:1、促进内皮细胞的增殖。2、增加血管的通透性、维持毛细血管周围内皮细胞的通透性。3、改变细胞外基质,促进血管生长,促进血管构建。4、促进血管形成前暂时性基质沉积。5、选择性激活小动脉、小静脉的内皮细胞,促进内皮细胞分裂、增殖。6、促进内皮细胞的趋化。7、保护新生血管。已有文献报道恶性肿瘤中肿瘤细胞和血管内皮细胞中VEGF都有表达,且随着肿瘤恶性度的增加,VEGF的表达增加。VEGF主要分布于高度恶性的胶质瘤细胞中和血管内皮细胞,定位于细胞浆,低恶性胶质瘤表达相对较低,正常脑组织几乎检测不出。最新的研究表明肿瘤细胞表面也有VEGF受体高表达,并且受VEGF信号通路的调节,且很多肿瘤高表达VEGF,肿瘤细胞的生长和存活在部分程度上也受VEGF通路的调节。因此阻断VEGF的信号传导通路可以从多个方面抑制肿瘤的生长。目前已有报道采用VEGF单克隆抗体、VEGF受体拮抗剂等抑制肿瘤生长,最近还有利用RNA干扰技术,利用VEGF siRNA实行抗肿瘤血管生成疗法的报道,取得了一定进展。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指细胞中导入与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA(dsRNA),可致该mRNA发生特异性降解从而导致基因表达沉默的现象。因基因沉默现象发生在转录后水平,又称为转录后基因沉默(PTGS)。目前,RNAi技术作为一个强有力的遗传学工具,提供了高效、特异性的抑制基因表达的手段,成为基因功能研究、抗病毒感染研究和基因治疗研究的重要方法。恶性胶质瘤的发生、发展离不开微血管内皮细胞,微血管内皮细胞同样受到恶性胶质瘤细胞分泌的各种细胞因子的作用。目前对这些因子中的Nogo-B蛋白的研究主要集中于周围血管的内皮细胞上,在中枢神经系统中,Nogo-B对胶质瘤细胞和胶质瘤微血管内皮细胞到底起了什么样的作用,Nogo-B和VEGF之间到底存在什么样的关系,VEGF是否参与了Nogo-B的调节通路,如何利用Nogo-B和VEGF实行抗肿瘤血管生成疗法,这些是本课题的研究内容和目的。研究分四个部分,第一部分:人胶质瘤组织中Nogo-B的功能表达。第二部分:人胶质瘤源性微血管内皮细胞中Nogo-B的功能表达。第叁部分:VEGF参与胶质瘤微血管内皮细胞Nogo-B表达的调控机制。第四部分:干扰Nogo-B表达抑制微血管内皮增生。研究采用以下研究方法:1、免疫组织化学、Western blotting法、Real-time PCR法分析在不同级别的胶质瘤组织中Nogo-B在蛋白和mRNA水平上的功能表达。2、利用免疫磁珠内皮细胞分选系统纯化胶质瘤源性微血管内皮细胞(Glioma derivedmicrovascular endothelial cells,GDMECs)。3、利用免疫组织化学法、Western blotting法、Real-time PCR法分析Nogo-B在不同级别的GDMECs中的功能表达。4、将VEGFsiRNA瞬时转染至GDMECs中,采用ELISA法、Real-time PCR法分析VEGF对GDMECs中Nogo-B表达的功能调控。5、采用小鼠脑血管内皮细胞系bEnd.3,将Nogo-B siRNA和bEnd.3共培养,观察bEnd.3增殖情况,探讨以Nogo-B作为靶点实行抗胶质瘤血管生成疗法的可行性。本研究得到如下结果:1、人胶质瘤组织中Nogo-B与正常脑组织相比,染色阳性率降低。2、在高级别的胶质瘤中Nogo-B在蛋白和mRNA水平上表达下调,Nogo-B表达水平随着肿瘤恶性程度增加而显着降低。3、在GDMECs中,Nogo-B蛋白、mRNA表达强度随着其来源胶质瘤的恶性程度增加而显着增加。4、瞬时转染VEGFsiRNA到GDMECs后,Real-time PCR、ELISA结果表明干扰VEGF表达能显着促进降低Nogo-B的蛋白表达。5、Nogo-B siRNA和bEnd.3细胞共孵育后,bEnd.3中Nogo-B表达显着抑制,其抑制程度具有siRNA剂量依赖性;抑制Nogo-B表达后,和对照组相比,bEnd.3增殖受到抑制。本研究得出结论:1、在人胶质瘤组织中,Nogo-B在蛋白和mRNA水平的表达与肿瘤恶性度成负相关。2、在GDMECs中,Nogo-B在蛋白和mRNA水平与其来源的胶质瘤恶性度成正相关。3、Nogo-B在GDMECs和胶质瘤肿瘤组织中存在双向表达。4、Nogo-B在胶质瘤中低表达,其促进肿瘤细胞凋亡能力下降,参与了胶质瘤的恶性进展。同时在GDMECs中,高表达的Nogo-B参与了胶质瘤血管的恶性进展。5、由于恶性胶质瘤可以高表达VEGF,VEGF可能通过Nogo-B途径作用于内皮细胞,促进了胶质瘤血管的发生发展,这是Nogo-B在胶质瘤组织和GDMECs中存在双向表达的原因之一。6、Nogo-B siRNA可以抑制内皮细胞增殖,以Nogo-B为靶基因,采用Nogo-B siRNA实行抗胶质瘤血管生成疗法具有一定的理论基础和可行性。
郭伟[2]2001年在《人脑肿瘤血管内皮生长因子的表达和微血管检测及意义》文中指出目的：探讨人脑胶质瘤、脑膜瘤、垂体瘤中血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达与微血管数量（MVQ）和肿瘤良恶性程度的关系，进一步揭示脑肿瘤的发病机制，为脑肿瘤的基因治疗提供理论根据。 方法：用免疫组织化学染色方法检测手术切除石蜡包埋的47例人脑胶质瘤（Ⅰ-Ⅱ级22例，Ⅲ级15例，Ⅳ级10例）、36例脑膜瘤（良性27例，恶性9例）和30例垂体腺癌肿瘤组织中的VEGF蛋白表达情况与MVQ数量，借助显微镜观察其阳性细胞数和阳性血管数；另外分别取脑外伤后开颅内减压术中切除的正常脑组织和脑膜组织各10例作为对照组。 结果：（1）正常脑组织和脑膜组织中均未检测到VEGF蛋白的表达，而MVQ数量少，表达强度弱；（2）各种肿瘤及各级别肿瘤组织中均有VEGF和MVQ表达，主要表达于肿瘤细胞的胞浆和血管内皮细胞胞膜中；（3）叁组胶质细胞瘤中VEGF的表达阳性率分别为22.2％、86.7％、90％，Ⅰ-Ⅱ级组与其它两组间有明显差异（P＜0.05；P＜0.01），VEGF表达阳性的MVQ平均值（46.8±12.4）明显高于阴性组MVQ值（22.4±11.5）（P＜0.01）；（4）两组脑膜瘤中VEGF的表达阳性率分别为77.8％、100％，两组间有显着差异（P＜0.05），VEGF表达阳性的MVQ平均值（47.6±8.5）明显高于阴性组（24.3±7.9）（P＜0.001）；（5）在胶质瘤、脑膜瘤中，VEGF的表达与MVQ均相关（r=0.61，P＜0.001；r=0.75，P＜0.001）；而垂体瘤无相关性（r=0.07，P＞0.05）。 结论：（1）叁种脑肿瘤中均有VEGF蛋白和MVQ的表达，主要表达于肿瘤细胞的胞浆和血管内皮细胞的胞膜中；（2）VEGF蛋白表达与MVQ呈正相关，说明VEGF在脑肿瘤血管生成中起重要作用，能促进脑肿瘤血管的形成；（3）VEGF和MVQ与脑肿瘤良恶性程度明显相关，可作为脑肿瘤病理诊断的指标之一；（4）VEGF可作为治疗脑肿瘤的靶向，为脑肿瘤的基因治疗提供了指导方向。
孙登彬[3]2013年在《瘦素与CD105在胶质瘤组织中的表达及其相关性研究》文中研究说明目的胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，手术、放射及化学药物治疗均难以治愈，呈侵袭性生长、易于复发，且多为原位复发，极少远处转移。瘦素（Leptin）在某些恶性肿瘤中已成为一种重要的生物标记物，但瘦素系统在人脑肿瘤发生发展中的作用仍不十分清楚，其作用机制仍未得到明显的证据。CD105可在新生血管内皮细胞上作为一种微血管密度（Microvascular Density MVD）的标记物。本课题旨在通过免疫组化的方法检测Leptin在脑胶质瘤组织中的表达情况及其与血管生成之间的关系及意义，分析二者之间的关系及可能作用，并试分析Leptin、CD105与脑胶质瘤病理级别之间的关系，从而能更准确地评价胶质瘤的恶性程度、判断预后、制定有效的预防措施及治疗策略提供依据。方法选取济宁市第一人民医院神经外科肿瘤病区自2010年01月至2011年12月的胶质瘤患者的标本组织共计54例，另选取颅脑外伤或功能性疾病术后正常脑组织14例作为对照。所有患者术前均未接受化疗或放疗。所选标本纳入标准均参照世界卫生组织（2007年版）的关于脑胶质瘤的组织分类标准及病理级别标准。所选取的实验组组织标本均经过10%福尔马林液体溶液固定，然后常规石蜡进行包埋。对照组14例为因颅脑外伤后行手术治疗内术后或其他功能性疾病行手术治疗后而切除的部分正常脑组织作为对照，同法固定。试验方法均采用免疫组织化学法。正常脑组织作为对照组，对照组以PBS作为一抗进行空白对照。Leptin阳性结果表达为肿瘤细胞的细胞浆中出现棕黄色颗粒。CD105阳性结果表达为新生血管内皮细胞膜出现棕黄色颗粒。Leptin计分标准均参照Hilbe等的方法，随机选取4个高倍镜视野（×400），计数视野内阳性细胞占细胞总数的百分比。标准为：未发现阳性细胞的为（－），阳性细胞数占细胞总数的25%以下为（+），25～50%为（++），51～75%为（+++），75%以上为（++++），分别计分为0、1、2、3、4分。CD105计数方法以与背景明显有别的任何一个棕黄色染色的内皮细胞或细胞丛作为一个血管，只要在结构上不保持连续性，一些分支结构也可以作为一个血管用来计数，管径大于8个红细胞并具有肌层的血管不作为新生血管。先在低倍镜下选取微血管分布密集区域，然后在200倍显微镜下计数5个视野被染成棕黄色的血管数目，取其平均值作为微血管密度，染色模糊或分辨不清的细胞排除在外。采用统计学软件SPSS17.0对数据进行处理，结果根据数据类型，对结果分别选用非参数检验分析及Spearman等级相关分析，p<0.05为差异有统计学意义。结果(1)14例正常脑组织标本中未检测到Leptin及CD105的表达。(2)54例人脑胶质瘤标本中Leptin阳性表达率平均值为25.38±2194%，CD105的阳性表达率平均值为31.95±27.41%。(3) Leptin及CD105总的阳性细胞表达率应用spearman等级相关分析得出：均随着胶质瘤病理级别的增加而增高（p<0.01）。(4)人脑胶质瘤中Leptin的阳性细胞表达率和CD105的阳性细胞表达率应用spearman等级相关分析得出：二者成正相关（p<0.01）。结论1、人脑胶质瘤标本中Leptin和CD105呈现高表达。而正常脑组织标本中无Leptin和CD105的表达。2、人脑胶质瘤标本中Leptin和CD105的阳性表达率，III、Ⅳ级（高级别）均明显高于I、II级(低级别)。3、人脑胶质瘤标本中Leptin和CD105的阳性表达率在人脑胶质瘤中表达强度随病理级别增加而增强。4、Leptin的阳性细胞表达率和CDl05的阳性细胞表达率在人脑胶质瘤病理级别中都成正相关，二者之间有同一趋势。
贺亚龙[4]2012年在《人脑胶质细胞瘤中MACC1基因的表达及其RNAi对生物学特性的影响》文中研究表明人脑胶质细胞瘤是中枢神经系统(central nervous system, CNS)中最常见的肿瘤类型。其发病率约占颅内原发肿瘤的40%，其中有近80%为高度恶性肿瘤。脑胶质细胞瘤的预后差，5年存活率为20-30%，高级别恶性胶质瘤的平均存活期仅为9-12月。近年来，尽管胶质瘤的手术、放疗及化疗等技术有很大提高，但临床治疗效果并未显着改善。高级别恶性胶质瘤治疗困难的原因主要是其具有高度恶性生物学特征，包括：过度增殖、较强的侵袭和迁移能力等。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，在分子生物水平治疗胶质细胞瘤已成为国内外学者研究的重要方向。寻找关键的治疗恶性胶质瘤的分子靶点，从根本上改变其恶性生物学特性，对治疗这一疾病有着重要的科学意义和临床应用价值。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)及其酪氨酸激酶受体c-Met是影响脑肿瘤生长和血管发生的重要分子。HGF和c-Met在脑肿瘤中广泛表达，且表达水平与肿瘤的恶性程度、血管密度及患者预后密切相关。HGF和(或)c-Met在脑肿瘤细胞中过表达会促进肿瘤发生、生长以及肿瘤相关的血管生成。相反，在体内荷瘤实验中，通过下调HGF和c-Met的表达可以抑制移植肿瘤生长和瘤内血管生成。HGF主要由肿瘤细胞合成并分泌，而其所结合的受体c-Met则表达于肿瘤细胞和血管内皮细胞。c-Met激活后不但促进了肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移和侵袭，还抑制了肿瘤细胞凋亡。体内实验发现，肿瘤血管内皮细胞中c-Met激活后诱导了胞外基质降解、微管形成以及血管发生。HGF诱导脑肿瘤细胞血管发生的方式包括直接作用和间接作用两种：间接作用为HGF通过调控某些与血管发生相关的蛋白来发挥作用；目前对于直接作用的分子机制还不明确。鉴于HGF/c-Met信号通路在脑肿瘤发生发展中的重要作用，通过阻断该通路达到抑制脑肿瘤生长和血管发生，已成为近年来人脑胶质瘤分子靶向治疗的重要研究方向。Ulrike Stein等于2009年利用全基因组表达分析技术首次在人结肠癌组织标本发现了结肠癌转移相关分子1(metastasis-associated in colon cancer1,MACC1)。该研究发现，在结肠癌细胞中MACC1与c-Met的启动子结合，调节了c-Met基因的表达和活化，决定性的影响了c-Met所参与的信号传递，最终通过调控HGF/c-Met信号通路促进细胞增殖、侵袭和迁移。随后多项研究证实，MACC1在肝癌、肺癌、卵巢癌的发生、侵袭及转移过程中均发挥重要作用。关于MACC1与脑胶质瘤病理分级的相关性；其在脑肿瘤组织中的表达和细胞内定位情况；对胶质瘤的恶性生物学特性的影响；在胶质瘤细胞中与HGF的受体c-Met及其所调控的下游信号分子间的关系。目前国外尚未有相关报道，本课题基于以上问题进行了系列研究，结论如下：1检测MACC1基因在人脑胶质瘤中的表达情况本研究首先采用RT-PCR和Western blot方法检测了四株人恶性胶质瘤细胞系(U251、U87、SHG44、BT325)中MACC1mRNA和蛋白的表达水平。实验结果发现，MACC1mRNA和蛋白在四株细胞系中均有表达，且在U87细胞中的表达量相对较高。这提示MACC1在人恶性胶质瘤细胞细胞系中的普遍高表达可能与胶质瘤细胞的恶性生物学特性相关。同时，也为后续RNAi实验中细胞系的选择提供了依据。接着利用realtime-PCR和免疫组化染色方法检测了MACC1mRNA和蛋白在98例不同临床病理级别的人脑胶质细胞瘤标本中的表达情况。实验结果发现，MACC1分子定位于胶质瘤细胞的胞核与胞浆；MACC1mRNA和蛋白在各病理分级的胶质细胞瘤组织中广泛表达，且表达量随病理级别的升高而增高。这提示MACC1在人脑胶质瘤的发生和恶性演化过程中具有重要功能。最后运用免疫组化染色方法观察了上述脑胶质细胞瘤组织中的c-Met的细胞定位和表达情况。结果显示，c-Met在脑胶质瘤细胞中定位于胞浆和胞膜；表达量随病理级别升高而增高，且与MACC1的表达高度正相关。这提示，与结肠癌细胞中MACC1发挥作用方式相同，MACC1在胶质瘤细胞中可能是通过调控c-Met的表达间接影响肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭的恶性生物学行为的。2构建MACC1基因RNAi慢病毒载体及稳定转染细胞系本研究以MACC1表达水平较高的人脑胶质瘤细胞系U87为研究对象，设计合成了特异性RNAi片段，并将其克隆入pLKO.1载体，构建了经测序正确的MACC1基因RNAi慢病毒载体pLKO.1-MACC1shRNA-1和pLKO.1-MACC1shRNA-2。通过慢病毒包装，感染目的细胞，嘌呤霉素筛选，建立了稳定转染的细胞系U87-S1（MACC1shRNA-1）、U87-S2（MACC1shRNA-2）和U87-NC（阴性对照组）。经RT-PCR与Western blot验证U87-S1和U87-S2两组细胞的MACC1mRNA和蛋白的表达明显下调。最终成功获得了能够稳定下调MACC1基因表达的胶质瘤细胞系。这为MACC1基因在胶质瘤细胞中的生物学功能及分子作用机制的后续研究奠定了实验基础。3观察MACC1基因干涉后胶质瘤细胞生物学行为改变本部分实验以U87、U87-NC、U87-S1和U87-S2四组细胞为研究对象。体外实验中，首先通过MTT实验绘制细胞生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期，平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验检测细胞克隆形成数量的实验方法，观察了MACC1基因对胶质瘤细胞增殖和周期的影响。结果显示，与其它两组相比，生长明显减缓增殖数明显降低；G1期细胞明显增多，S期细胞显着减少，出现G0/G1期阻滞；U87-S1和U87-S2组的克隆形成数量明显低于对照组。研究表明，MACC1基因表达下调后明显抑制了胶质瘤细胞的增殖。进一步运用细胞划痕实验和Transwell侵袭小室方法研究了MACC1基因对胶质瘤细胞侵袭和迁移能力的影响。实验结果发现，U87-S1和U87-S2组细胞的迁移能力与对照组相比明显减弱； U87-S1和U87-S2组细胞穿过基质胶的数量也明显低于其它两组。研究证明，MACC1基因RNAi对胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力具有明显的抑制作用。在体内研究中，采用裸鼠荷瘤实验研究了MACC1基因RNAi对胶质瘤细胞体内成瘤性、增殖和侵袭能力的影响。将U87、U87-NC、U87-S1和U87-S2各组细胞分别接种于裸鼠皮下，定期测量肿瘤体积，观察28天后处死。结果显示，U87干涉组细胞在裸鼠体内的成瘤能力和肿瘤生长速度与对照组相比明显降低；移植瘤体积和重量与对照组相比也明显减少。裸鼠荷瘤实验进一步验证了，MACC1基因表达下调后抑制了胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力。4初步探讨MACC1影响胶质瘤细胞生物学行为的分子机制本实验以U87、U87-NC、U87-S1和U87-S2为研究对象，利用western blot方法观察了c-Met的表达情况；检测了与胶质瘤细胞增殖和侵袭密切相关的，由MAPK/ERK信号通路主要调控的几个下游分子的表达情况。结果显示，U87细胞中MACC1基因下调后，p27表达量显着升高；c-Met、cdk2以及MMP2的表达量明显减少。这提示，MACC1可能是通过调控c-Met的表达来调节HGF/c-Met信号通路，继而影响了其下游MAPK/ERK信号途径，从而间接的影响了与细胞增殖和侵袭密切相关的p27、cdk2和MMP2等下游分子，最终参与了胶质瘤的发生、生长和恶性演化的过程。上述研究结果，为MACC1成为脑胶质瘤恶性程度判断的生物标志物提供了理论依据；同时，也为脑胶质瘤基因治疗提供了一个潜在分子靶点。
苟章洋[5]2006年在《TP、MVD在人脑星形胶质细胞瘤中表达及意义》文中提出目的：星形胶质细胞瘤(astroglioma，AG)是一种常见的神经上皮性肿瘤。肿瘤起源于中枢神经系统白质或灰质的星形胶质细胞。分为低级别(LGAs)／分化良好型(WHOⅠ—Ⅱ级)与高级别(HGAs)／分化不良型(WHOⅢ—Ⅳ级)两大类，根据WHO 2000年神经系统肿瘤的组织学分类，星形胶质细胞瘤分为6个亚型。星形胶质细胞瘤预后与组织学分化、病理类型、浸润部位、手术切除程度等因素有关，星形胶质细胞瘤的发生、发展是多种因素共同作用的结果。其中肿瘤血管形成在肿瘤生长、浸润及转移过程中起着重要的作用，它不仅可以实现瘤组织氧和养料的供给，而且为肿瘤细胞提供了播散转移的捷径。血管形成有赖于血管生成因子及血管生成抑制因子在实体肿瘤中表达，如酸性成纤维细胞生长因子(αFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(βFGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管生成素(angiogenin)等。胸苷磷酸化酶(Thymidine Phosphorylase，TP)是近年来发现并受重视的肿瘤细胞生长因子，与血小板源性内皮细胞生长因子(platelet-derived endothelial cell growth factor，PD-ECGF)的结构和作用相似，因此TP又被称为肿瘤相关血管生成因子，它可能通过血管生成作用促进癌细胞的生长和转移。近年来，研究发现TP在乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、子宫癌中水平升高、且发现与微血管密度(microvascular density，MVD)相关。但目前TP在脑肿瘤研究较少，本试验在于探讨TP在人脑星形胶质细胞瘤中的表达，分析TP表达及微血管密度与病理分级关系，讨论其表达是否可以作为病理分级及判定预后的参考指标。方法：本次实验从川北医学院附属医院病理科获得2003～2005年诊断明确的脑星形胶质细胞瘤208例，并从计算机随机抽样60例，调出相应的病理切片，光镜下排除有明显出血坏死等不宜做免疫组化石蜡标本后获得符合条件病例50例，并记录病例年龄、性别、组织学类型、病理分级。尸解正常脑组织病例5例，鼠抗人单克隆抗TP抗体选取乳腺炎石蜡标本1例(阳性对照)。鼠抗人单克隆抗CD34抗体选取扁桃体炎石蜡标本1例(阳性对照)。将上述符合条件病例蜡块每例切片3张，利用免疫组化技术SP法检测它们TP、CD34的表达，TP表达依据阳性细胞百分数及染色强度计分，并分为TP(+)和TP(-)两种表达结果，CD34染色标记微血管计算MVD，用统计学方法分析TP与病理级别、MVD与病理级别关系，以及TP与MVD相关性。结果：1.5例正常尸解脑组织TP表达均阴性(-)。2．高级别星形胶质细胞瘤(WHOⅢ～Ⅳ级)TP阳性表达率明显高于低级别星形胶质细胞瘤(WHOⅠ～Ⅱ级)(X~2=20.07，P＜0.05)。3．高级别星形胶质细胞瘤的微血管密度(MVD)值明显高于低级别星形胶质细胞瘤(t=7.20，P＜0.05)．4．TP(+)组MVD值高于TP(-)组，且TP表达与MVD明显正相关(r=0.692，P＜0.05)．结论：TP表达及MVD与星形胶质细胞瘤恶性程度密切相关，而且TP表达与MVD呈正相关，TP可能通过肿瘤微血管生成促进星形胶质细胞瘤恶性生长并影响预后，TP及MVD可以作为星形胶质细胞瘤恶性程度病理分级及判定预后的参考指标，并可以进一步研究TP具体作用机制，为星形胶质细胞瘤化学治疗开辟新途径。
黄纯海[6]2008年在《EGFL7基因在人脑胶质瘤中的表达、作用及机制研究》文中认为背景:胶质瘤是最常见的脑部恶性肿瘤,尽管目前在外科治疗及肿瘤基因治疗上取得了一些进展,但是总的来说其预后仍然很差,尤其是胶质母细胞瘤尚无有效的措施从根本上改善其预后。所以,深入研究其发生发展的细胞及分子机制具有重大现实意义。血管新生是生理性及病理性血管生成的主要形式,研究发现实体性肿瘤的生长高度依赖于血管的新生,因而关于血管新生与恶性肿瘤的发生、发展及转移的关系近年来已逐渐成为研究热点。目前国内外学者也进行了一系列针对肿瘤血管新生的实验及临床研究,并取得了一些可喜的成果。绝大部分脑胶质瘤属于实体性肿瘤,研究表明它亦具有高度血管化的的特征,它通过新生的血管供应必需的O_2及营养物质而不断增殖并向周围组织侵袭。因此,抗血管生成是治疗胶质瘤极具希望的策略之一,但其血管新生的调节机制目前尚不太清楚,寻找和识别在这一过程中的关键性调控因子将是抗胶质瘤血管生成的有效途径,具有重要意义。EGFL7是一新发现的内皮细胞源性分泌性因子。它在胚胎及富血管组织存在高表达,而在大多数成熟组织中表达水平均很低。研究表明,当沉默EGFL7基因表达后胚胎血管形成过程中其血管不能形成管状结构,提示它是血管新生过程中的管状结构形成的关键调控因子。由于管状结构的形成对于新生血管发挥其正常功能至关重要,所以EGFL7将有望成为抗血管生成治疗的关键性靶点。目前关于EGFL7的报道研究尚不多,而且主要集中于胚胎发育及血管损伤等生理性血管新生方面。它在肿瘤等病理性血管新生中的表达及作用尚未见报道;在人脑胶质瘤中的表达及其作用机制目前国内外亦无相关研究报道。我们推测其在胶质瘤的血管生成中亦起着关键性调控作用,但是这一推测尚待在体内外胶质瘤模型中去研究证实。目的:探讨EGFL7基因在人脑胶质瘤组织中的表达情况;并通过RNAi沉默EGFL7基因在人胶质母细胞瘤细胞株U251及人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC中的表达,探讨了EGFL7在胶质瘤血管新生过程中的可能作用及机制。方法:收集36例新鲜胶质瘤标本,其中包括21例低度恶性(Ⅰ～Ⅱ级)及15例高度恶性者(Ⅲ～Ⅳ级),用RT-PCR检测其EGFL7mRNA的表达。另收集45例胶质瘤石蜡标本,其中包括24例低度恶性(Ⅰ～Ⅱ级)及21例高度恶性者(Ⅲ～Ⅳ级),用免疫组织化学检测EGFL7蛋白、Ⅷ因子及Ki-67的表达情况。并分析EGFL7蛋白的表达与胶质瘤的病理分级、胶质瘤Ki-67标记指数(LI)及微血管密度(MVD)的关系。构建针对人EGFL7的小RNA干扰序列以研究其对胶质瘤血管生成的影响:设计选取四对不同的RNAi序列及一对普适性阴性对照序列构建短发夹结构RNA,然后将其克隆入pGCL-GFP载体并进行PCR及DNA测序鉴定。同时,构建含有增强型绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)的人EGFL7-flag过表达的重组质粒载体pEGFP-C1以用于外源性筛靶。用Lipofectamin脂质体法将重组pGCL-GFP及pEGFP-C1共转染293T细胞,然后用Western Blot检测各shRNA序列对EGFL7的基因沉默效率。选取基因沉默作用最明显的序列进行慢病毒包装,命名为pGCL-GFP-vshEGFL7。通过检测GFP的表达来测定包装的慢病毒滴度。先用real-time quantitative PCR及免疫组织化学方法检测EGFL7 mRNA及其蛋白在人胶质母细胞瘤细胞株U251及人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC中的表达情况,然后用慢病毒载体pGCL-GFP-vshEGFL7感染该两种细胞。用real-time quantitative PCR验证shRNA对U251细胞及HUVEC中EGFL7基因的沉默作用。为研究体内胶质瘤微环境中肿瘤细胞对内皮细胞的作用,用Transwell技术体外建立了U251细胞与HUVEC共培养模型。然后沉默EGFL7基因表达,用MTT检测U251细胞及HUVEC的增殖活性;流式细胞仪检测HUVEC的细胞周期分布及凋亡率;结晶紫染色法检测HUVEC的粘附及迁移能力;体外毛细胞血管样结构形成实验分析HUVEC成血管能力变化。结果:①检测到EGFL7mRNA及其蛋白在人脑胶质瘤中存在表达,EGFL7蛋白表达主要定位于肿瘤细胞及血管内皮细胞的胞浆,且其表达与肿瘤的恶性程度(t=4.399,P＜0.01),Ki-67 LI(r=0.793,P＜0.01)及MVD(r=0.684,P＜0.01)有明显的相关性;EGFL7在正常脑组织中没有表达。②含针对EGFL7的shRNA慢病毒载体pGCL-GFP及EGFL7真核过表达载体pEGFP-C1经PCR及测序鉴定完全正确;pEGFP-C1转染293T细胞后能够强烈表达报告基因EGFP;pGCL-GFP与pEGFP-C1共转染293T细胞后,Western Blot检测发现四对shRNA序列中,序列5′-CCGAACCATC7ATAGGACC-3′(512～530)对EGFL7基因特异性沉默作用最为显着;进行病毒包装后经检测干扰组及普适性阴性对照组慢病毒滴度分别为4.8×10~7TU/ml及5.0×10~7TU/ml以上。③U251细胞及HUVEC中均存在EGFL7mRNA及其蛋白的表达。EGFL7免疫阳性产物主要位于该两种细胞的胞浆中。与普适性对照及正常对照组相比,pGCL-GFP-vshEGFL7对U251细胞及HUVEC中EGFL7mRNA表达有显着的沉默作用(P＜0.01);而两对照组之间无明显差异(P＞0.05).④EGFL7基因沉默48h后,U251细胞的增殖活性亦明显低于普适性对照及正常对照组(P＜0.01),而后两组无明显差异(P＞0.05);EGFL7基因沉默对单纯培养的HUVEC增殖活性、迁移能力、细胞周期及凋亡率无明显影响(P＞0.05);其对胶质瘤微环境中HUVEC迁移能力亦无明显影响(P＞0.05),但是EGFL7基因沉默后48h至4d时HUVEC细胞增殖活性与两对照组相比明显下降(P＜0.01),第5d后又恢复至正常(P＞0.05);无论单纯培养还是与U251共培养,EGFL7基因沉默均可导致HUVEC的粘附能力明显下降,并且均不能形成毛细血管样结构,与普适性阴性对照及正常对照组相比差异显着(P＜0.01),而后两组无明显差异(P＞0.05)。结论:1.人脑胶质瘤中肿瘤细胞及其血管内皮细胞均可表达EGFL7。HUVEC及U251细胞亦可合成和分泌EGFL7蛋白。在胶质瘤组织中EGFL7的表达与肿瘤恶性程度、KI-67 LI及MVD具有明显相关性。提示EGFL7在胶质瘤的生长、侵袭中发挥重要作用。2.本研究筛选出了针对人EGFL7基因的siRNA有效靶序列;并成功构建了针对EGFL7基因的慢病毒介导的shRNA载体;并证明该shRNA可显着地沉默U251细胞及HUVEC中EGFL7基因的表达。3.慢病毒介导的EGFL7基因沉默可以明显抑制HUVEC的粘附能力、成管能力及U251细胞的增殖活性。提示EGFL7在胶质瘤血管内皮细胞管状结构形成过程中起着关键性调控作用,并可直接促进肿瘤细胞的增殖活性。提示EGFL7可能是胶质瘤基因治疗一潜在靶点,并且以shRNA为基础针对EGFL7基因RNAi可能是一新的极具希望的治疗策略。
谢云鹏[7]2011年在《星形细胞瘤组织中TGF-β1、Smad7、VEGF和MVD的表达及其相互关系》文中研究表明目的：本实验通过检测正常脑组织及不同级别星形细胞瘤中TGF-β1、 Smad7、VEGF及微血管密度(MVD)的表达,证实上述因子在星形细胞瘤发生发展中的作用及其相关性,及以上指标与星形细胞瘤患者的性别、年龄、肿瘤的组织分化程度等临床病理指标间的关系,从而探讨以上指标与预后的关系,用于指导临床治疗。方法：收集承德医学院附属医院2008年6月至2010年6月手术治疗后经病理证实的低级别星形细胞瘤(Ⅰ-Ⅱ级)15例,高级别星形细胞瘤(Ⅲ-Ⅳ级)25例,脑外伤患者内减压术中正常脑组织10例。所有患者术前均未进行放疗、化疗,病理与临床资料完整。1.采用免疫组织化学法检测TGF-β1、Smad7、VEGF及CD34的表达情况,通过CD34标记的微血管,计算微血管密度,结合星形细胞瘤临床病理资料进行统计学分析。2.蛋白印迹法测定TGF-β1、Smad7、VEGF蛋白的表达情况。结果：1.免疫组化法检测正常脑组织、低级别组星形细胞瘤、高级别组星形细胞瘤中TGF-β1、Smad7、VEGF的表达及MVD记数。1.1TGF-β1、Smad7、VEGF在高级别组星形细胞瘤中的表达显着高于低级别组及正常组(P<0.01),低级别组星形细胞瘤亦显着高于正常脑组织(P<0.01)。1.2MVD值在高级别组星形细胞瘤(62.75±13.62)中高于低级别组(32.91±9.56)(P<0.05),低级别组的MVD值高于正常组(11.68±4.37)(P<0.05)。2.TGF-β1、Smad7、VEGF的表达水平及MVD值与星形细胞瘤临床病理指标间的关系2.1TGF-β、Smad7、VEGF的表达水平及MVD值随着星形细胞瘤临床病理分级的增加而增高。其与肿瘤的恶性程度是一致的,恶性程度高的星形细胞瘤中TGF-β1、Smad7、VEGF的表达水平及MVD值明显高于恶性程度低的星形细胞瘤(P<0.05)。2.2TGF-β1、Smad7、VEGF的表达水平及MVD值在不同性别、年龄(<44岁,≥44岁)分组中的表达无明显差异(P>0.05)。3.星形细胞瘤中TGF-β1、Smad7、VEGF的表达水平及MVD值的相互关系TGF-β1与Smad7、VEGF、MVD有显着正相关性(r=0.72,P<0.01；r=0.74,P<0.01;r=0.69,P<0.01); VEGF与Smad7、MVD表达呈正相关性(r=0.70,P<0.01;r=0.71,P<0.01); Smad7与MVD表达同样呈正相关性(r=0.66,P<0.01)。4.蛋白印迹法结果TGF-β1、Smad7、VEGF蛋白在高级别组星形细胞瘤中的表达明显高于低级别组,低级别组高于正常组,组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。检测结果与免疫组织化学法结果相符。结论：1.正常脑组织、低级别星形细胞瘤、高级别星形细胞瘤中TGF-β1、Smad7、 VEGF蛋白表达水平呈逐渐增高趋势,表明TGF-β1、Smad7及VEGF的高表达与星形细胞瘤的发生发展密切相关,发挥着重要作用。2.TGF-β1、Smad7、VEGF的表达及MVD值随着星形细胞瘤恶性程度的增加而增加,且有统计学意义。表明上述指标在星形细胞瘤浸润生长及恶性转化过程中起到一定作用,可作为判断星形细胞瘤预后的预测因素；而这些因子的表达水平与患者的年龄、性别无明显关系。3.TGF-β1、Smad7、VEGF及MVD在星形细胞瘤中的表达呈显着正相关性,且随肿瘤级别的增加而增加。表明星形细胞瘤的发生发展是一个多种因子共同参与、协同作用的复杂过程,上述指标的相互关系与星形细胞瘤的发展关系密切。TGF-β1、Smad7、VEGF与MVD联合检测是判断星形细胞瘤恶性程度有价值的指标,以四者为靶点的抗肿瘤治疗将为星形细胞瘤的治疗带来新的选择。
吴娜[8]2007年在《人脑星形细胞肿瘤IL-8、SDF-1和CXCR4的表达及其与血管生成的关系》文中研究指明恶性胶质瘤是中枢神经系统常见的肿瘤之一,血管生成在肿瘤的生长、侵袭和演进中起重要作用。这一过程受到促血管生成因子和抗血管生成因子以及相应受体的精密调节。近年来趋化因子及其受体作为一类肿瘤血管调控分子日益受到人们的关注。我室新近研究证实,白介素-8(Interleukin-8,IL-8)在胶质瘤细胞系U87和肿瘤干细胞中分泌、表达,且CXCR4(chemokine receptor4)与其配体SDF-1(stromal cell-derivedfactorl)结合后,可上调胶质瘤细胞和肿瘤干细胞的IL-8和VEGF的分泌、表达量。为了进一步研究IL-8及SDF-1/CXCR4生物轴在人脑星形细胞肿瘤中的表达、分布情况及与肿瘤血管生成的关系。本实验以不同级别的星形细胞肿瘤组织为材料,应用组织芯片技术,通过免疫组织化学染色、激光共聚焦显微术,检测上述趋化因子和受体在瘤组织中的表达情况,及其与肿瘤血管生成的关系,探究趋化因子及其受体作为肿瘤相关分子在影响肿瘤的分级、生长、侵袭和演进等方面的生物学作用,为脑胶质瘤治疗提供新的思路。主要结果和结论如下:1.组织芯片的构建。构建共153位点的组织芯片,其中含不同分化程度人脑星形细胞肿瘤45例,每例3个点,共135位点,毛细胞型星形细胞瘤5例(WHOⅠ级),15位点;弥漫性星形细胞瘤22例(WHOⅡ级),66位点;间变性星形细胞瘤8例(WHOⅢ级),24位点;胶质母细胞瘤10例(WHOⅣ级),30位点:正常脑组织6例,18位点。采用免疫组织化学染色,分别检测组织芯片IL-8、VEGF和血管内皮标记物CD34的表达情况。结果显示,45例不同级别的脑胶质瘤均表达不同强度的IL-8和VEGF,且随着胶质瘤恶性程度增高而增强,Ⅲ级、Ⅳ级明显高于Ⅰ级、Ⅱ级,并具有统计学意义。作为阴性对照的6例正常脑组织中的IL-8、VEGF表达均为阴性。IL-8表达主要位于瘤细胞的细胞浆,偶见于浸润的炎症细胞。VEGF表达主要位于瘤细胞的细胞浆,部分可见于内皮细胞的胞浆。计算CD34阳性的肿瘤微血管密度(MVD)发现,IL-8、VEGF表达同MVD呈正相关,IL-8表达同VEGF表达之间亦为正相关。MVD同患者的性别、年龄之间无显着差异。2.30例手术切除后脑胶质瘤新鲜组织,病理分级为弥漫性星形细胞瘤(WHOⅡ级)10例、间变性星形细胞瘤(WHOⅢ级)10例、胶质母细胞瘤(WHOⅣ级)10例。肿瘤组织连续冰冻切片,CD34、SDF-1、CXCR4两两进行间接免疫荧光双标记,用激光共聚焦显微术观察。SDF-1、CXCR4平均荧光强度随肿瘤级别的增高而增强,Ⅲ级、Ⅳ级的荧光强度明显高于Ⅱ级。SDF-1与CXCR4共表达,定位于血管内皮细胞和肿瘤细胞的胞膜与胞质。在高级别的肿瘤组织中CXCR4的荧光强度高于SDF-1。综上所述,IL-8、SDF-1/CXCR4的表达均与肿瘤血管生成密切相关,不同级别的星形细胞瘤中表达有差异,并随着肿瘤级别的增高而增多、增强。
梁超[9]2014年在《电针对脑缺血再灌注大鼠脑皮质局部血流量和血管新生的影响研究》文中研究指明目的缺血性脑血管病（Ischemic cerebrovascular disease,ICVD）以高发病率、高死亡率、高致残率和高复发率为特点，现已成为威胁人类健康的叁大杀手之一。目前对ICVD研究最多的就是缺血后血流再灌和脑组织血管新生之间的联系。虽然缺血后血流的再灌注可挽救濒临梗死的神经细胞，但也会加重神经细胞损伤而导致其死亡。脑缺血后神经细胞的修复不仅和细胞因子、血氧供应有关，更取决于缺血区血管新生的程度。因为血管新生能影响脑缺血再灌注后侧枝循环的建立，进而为神经细胞的修复和神经功能的重塑创造良好的微环境。微血管内皮细胞是组成血管的基本单位，血管新生的主要表现是微血管内皮细胞的变化，包括形态的改变和数量的增多。血管内皮细胞的增殖直接引发了新生血管密度的增加，也为缺血脑组织血流的再灌提供了基础，而缺血局部脑组织血流再灌量的多少又是评价新生血管的成熟度最直观的指标。基于针灸对缺血性脑损伤的多水平、多靶点的保护作用，观察针灸对脑缺血后脑组织血流复灌和血管新生两者之间关系的影响可以更好地研究针灸防治脑缺血的作用机理，更确切地把握针灸治疗脑缺血的介入时机。促红细胞生成素（EPO,erythro-poietin）是目前有关促血管新生最热门的细胞因子，它能迅速透过血脑屏障而不增加其通透性、抑制炎症反应、保护神经元，还能通过激活其下游JAK2/STAT5分子信号通路有效作用神经血管单元保护受损脑组织。但脑缺血后随着缺血再灌注时间的延长，脑组织自身表达的EPO基因和蛋白都会有所变化，电针对不同时间段、不同缺血区域的脑组织中EPO的表达有不同程度的影响。脑缺血后细胞因子的表达促进了JAK/STAT信号通路中JAK蛋白和STAT蛋白的磷酸化，电针通过对JAK1/STAT3分子信号通路的调控作用来抑制炎症反应、诱导细胞凋亡、减轻脑损伤。而JAK2/STAT5分子信号通路是目前研究出与血管新生有关的一条分子信号通路，在脑缺血再灌注后予以电针干预而出现的血管新生现象是否与激活JAK2/STST5信号通路有一定的关系也是本研究的目的之一。因此本研究以局灶性脑缺血再灌注大鼠为研究对象，通过观察电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血脑皮质局部脑血流量变化和微血管内皮细胞的影响，及脑皮质中EPO及其下游相关分子信号通路P-JAK2、P-STAT5在此过程中表达的变化。从而探讨电针治疗缺血性脑血管病可能的作用时机、作用靶点和作用机制。方法将SD大鼠100只随机分为正常对照组10只、假手术组10只，模型组和电针组又分别按缺血再灌注12h、24h、48h和72h分为四个亚组，每个亚组10只。除正常对照组外，假手术组仅分离血管而不插线栓，模型组、电针组两组大鼠参照Longa报道的线栓法，加以改进，制备MCAO脑缺血再灌注模型。根据Zea-Longa的5级评分标准对实验动物神经障碍进行评分，只有神经功能障碍在1级以上的大鼠才能保留下来算作造模成功。电针组造模后采用电针双侧“曲池”、“足叁里”穴进行干预，其余组不予以任何干预。采用HE染色以光镜下观察各组大鼠缺血局部脑皮质病理形态的变化；同时用激光多谱勒血流仪检测各组大鼠实验前、缺血再灌注12h、24h、48h和72h后局部脑组织血流量的变化；免疫荧光染色法检测缺血局部脑皮质微血管内皮细胞数目变化情况，并将各组大鼠试验后缺血局部皮质血流值与微血管内皮细胞增殖数目进行Pearson相关性统计分析；免疫组化S-ABC法检测不同时间点大鼠脑缺血皮质中EPO蛋白表达变化；RT-PCR法观察不同时间点大鼠脑皮质中EPOmRNA表达情况；WesternBlotting法检测大鼠脑皮质中P-JAK2、P-STAT5蛋白含量的变化情况。结果（1）光镜下观察发现：正常组和假手术组的大鼠脑皮质形态正常、染色均匀，组织形态结构清晰致密，假手术组的大鼠脑皮质仅见极少量炎性细胞。模型组和电针组的大鼠脑皮质均出现不同程度的损伤，可见组织结构紊乱，间质水肿，微血管周围间隙增宽、微血管管腔变形，部分微血管扩张；神经元变形、坏死，炎性细胞和胶质细胞渗出。但电针组大鼠缺血脑皮质的损伤较模型组的明显减轻，电针能有效减轻脑缺血再灌注后大鼠缺血脑皮质损伤，改善受损脑组织结构紊乱及水肿程度，减小缺血面积，减少坏死细胞数量及减轻细胞变性程度，对受损区域微血管有保护作用。经激光多普勒血流仪检测发现：正常对照组和假手术组的大鼠缺血脑皮质局部rCBF在实验前后几乎没有变化，模型组和电针组两组大鼠缺血脑皮质局部rCBF在实验前后均有不同程度降低，但随着缺血再灌注时间的变化，两组大鼠缺血脑皮质局部rCBF又有升高的趋势。电针能明显增加缺血再灌注后大鼠脑皮质局部血流量，除再灌注24h外，电针组比模型组在各时间点的rCBF均高，且呈显着性差异（P<0.05），特别是在再灌注72h最为明显（P<0.01）。（2）荧光显微镜下观察发现：实验前后，正常对照组缺血局部脑皮质微血管内皮细胞数目无变化，假手术组大鼠缺血局部脑皮质可见极少量微血管内皮细胞增殖，与正常对照组的比较无统计学差异（P>0.05）。脑缺血再灌注后，模型组和电针组两组大鼠局部脑皮质微血管内皮细胞会出现一定程度的增殖，随着缺血再灌注时间的延长，其在脑缺血再灌注12h开始增加，24h持续上升，48h到达峰值，且一直持续到再灌注72h;除再灌注12h外（P>0.05），电针组再灌注24h、48h和72h的微血管内皮细胞增殖数目均多于模型组（P<0.05，P<0.01）；将各组大鼠试验后缺血局部皮质血流值与微血管内皮细胞增殖数目进行Pearson相关性统计分析得出：模型组和电针组两组大鼠局部脑血流量与微血管内皮细胞增殖数目呈正相关,说明随着缺血时间的延长和局部脑血流量的增加，微血管内皮细胞数目也增加。（3）光镜下观察可见：实验前后，正常对照组缺血局部脑皮质EPO蛋白的表达无变化，假手术组仅见极少量EPO蛋白的表达，与正常对照组的比较无统计学差异（P>0.05）。脑缺血再灌注后模型组和电针组两组大鼠局部脑皮质中EPO蛋白有不同程度的表达，其在再灌注12h开始增加，24h到峰值，48h开始下降，一直持续到再灌注72h。电针组与模型组比较，除再灌注12h外（P>0.05），其余各时间点EPO蛋白含量均多于模型组（P<0.05）。通过RT-PCR检测方法可以看出：实验前后，正常对照组缺血局部脑皮质EPO蛋白的表达无变化，假手术组仅见极少量EPOmRNA的表达，与正常对照组比较无统计学差异（P>0.05）。脑缺血再灌注后模型组和电针组两组大鼠局部脑皮质中EPOmRNA的水平出现不同程度的变化，其在再灌注12h开始增加，24h到峰值，48h开始下降，一直持续到再灌注72h。电针组与模型组比较，各时间点EPOmRNA表达均多于模型组（P<0.05、P<0.01）。（4）通过Western Bloting蛋白印迹结果显示：实验前后，正常对照组和假手术组大鼠脑皮质中P-JAK2和P-STAT5蛋白含量在实验前后变化不大，两组之间比较无统计学差异（P>0.05）。脑缺血再灌注后各组大鼠局部脑组织中P-JAK2和P-STAT5蛋白含量均有不同程度的变化，都在脑缺血再灌注12h开始增加，24h持续增加，48h到达高峰，72h开始下降；再灌注12h和72h电针组大鼠脑皮质P-JAK2蛋白含量较模型组的多，其差异有统计学意义（P<0.05），而再灌注24h和48h电针组大鼠脑皮质P-JAK2蛋白含量与同时间点模型组的比较，两组间无明显差异（P>0.05）；同时电针组比模型组各时间点的P-STAT5蛋白含量表达多，且有统计学意义（P<0.01）。结论电针能有效提高脑缺血再灌注大鼠局部脑组织血流量，增加缺血再灌注后局部脑皮质微血管内皮细胞的数量以促进微血管新生；同时又能有助于脑缺血再灌注后大鼠缺血脑皮质中EPO蛋白和EPO基因的表达；促进脑缺血再灌注后大鼠缺血脑皮质JAK2/STAT5信号通路中JAK2和STAT5的磷酸化，明显增加P-JAK2和P-STAT5蛋白含量。电针的这些作用明显改善了脑缺血再灌注后缺血局部脑皮质病理形态变化，减轻了缺血局部脑皮质的损伤。
檀艳丽, 方川, 孙贺英, 高伟敏, 王佳良[10]2008年在《脑胶质瘤缺氧诱导因子-1α、血管内皮生长因子的表达及意义》文中认为目的探讨脑胶质瘤缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达变化及其与微血管密度(MVD)的关系,以及HIF-1α、VEGF与人脑胶质瘤病理分级、血管生成的关系。方法采用免疫组化SP法检测54例脑胶质瘤组织中HIF-1、VEGF的表达情况及MVD。结果54例脑胶质瘤组织HIF-1α的表达阳性率为61.1%(33/54),VEGF为70.4%(38/54),其表达强度与脑胶质瘤的病理分级呈正相关(P<0.05)。HIF-1α的表达与VEGF的表达及MVD均呈正相关(P均<0.05)。结论HIF-1α、VEGF与脑胶质瘤组织中血管生成与病理分级密切相关,可作为有意义的预后判断指标。
参考文献：
[1]. Nogo-B在人胶质瘤组织和微血管内皮细胞中差异表达的研究[D]. 吴小军. 第二军医大学. 2008
[2]. 人脑肿瘤血管内皮生长因子的表达和微血管检测及意义[D]. 郭伟. 暨南大学. 2001
[3]. 瘦素与CD105在胶质瘤组织中的表达及其相关性研究[D]. 孙登彬. 济南大学. 2013
[4]. 人脑胶质细胞瘤中MACC1基因的表达及其RNAi对生物学特性的影响[D]. 贺亚龙. 第四军医大学. 2012
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[6]. EGFL7基因在人脑胶质瘤中的表达、作用及机制研究[D]. 黄纯海. 中南大学. 2008
[7]. 星形细胞瘤组织中TGF-β1、Smad7、VEGF和MVD的表达及其相互关系[D]. 谢云鹏. 承德医学院. 2011
[8]. 人脑星形细胞肿瘤IL-8、SDF-1和CXCR4的表达及其与血管生成的关系[D]. 吴娜. 第叁军医大学. 2007
[9]. 电针对脑缺血再灌注大鼠脑皮质局部血流量和血管新生的影响研究[D]. 梁超. 湖北中医药大学. 2014
[10]. 脑胶质瘤缺氧诱导因子-1α、血管内皮生长因子的表达及意义[J]. 檀艳丽, 方川, 孙贺英, 高伟敏, 王佳良. 山东医药. 2008
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