吴勇，邹霞，罗辉，屈波*
（湖南中医药大学，湖南 长沙 410007）
[摘要] 目的 探讨高脂饮食下建立ApoE小鼠动脉粥样硬化模型后主动脉组织中β-catenin蛋白含量变化的影响及高脂饮食引起动脉粥样硬化的可能机制。方法 将24只ApoE小鼠随机分为两组，即正常对照组、粥样硬化组，喂养12周后，检测血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量，HE染色显微镜下观察主动脉病理形态改变，用免疫组化法检测主动脉组织中β-catenin蛋白含量的表达。结果 正常对照组主动脉三层结构清晰，内膜光滑完整，平滑肌细胞排列整齐；粥样硬化组内膜明显增厚，可见大小不等、形态不规则的泡沫细胞聚集，弹力板处及细胞间隙可见大量脂质沉积，平滑肌细胞排列不规则；粥样硬化组中TC、TG、LDL-C含量明显高于正常对照组，HDL-C则明显低于正常对照组（P<0.05）；粥样硬化组主动脉组织中β-catenin蛋白含量明显高于正常对照组（P<0.05）。结论 高脂饮食可导致动脉粥样硬化，并引起主动脉组织中β-catenin蛋白含量的增加，可能与激活wnt/β-catenin信号通路有关。
[关键词] ApoE小鼠；高脂血症；动脉粥样硬化；β-catenin蛋白
动脉粥样硬化是一组称为动脉硬化的血管病中最常见、最重要的一种。本病多见于40岁以上的中、老年人，研究发现本病有越来越年轻化趋势[1]。近年来研究表明wnt信号通路与心血管疾病有一定的相关性[2]。Lee等研究表明wnt/β-catenin信号通路激活之后，内皮细胞功能紊乱，单核细胞对血管内皮的粘附性增强，最终导致AS的发生。本实验通过高脂饮食复制ApoE小鼠动脉粥样硬化模型，检测wnt/β-catenin信号通路中重要因子β-catenin蛋白水平，探讨高脂饮食对β-catenin蛋白的影响及其导致动脉粥样硬化的可能机制。
1 材料和仪器
ApoE小鼠24只，体重17-19g，SPF级，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号: SCXK(京) 2012-0001，实验单位使用许可证号: SYXK(湘) 2013-0005。抗鼠β-catenin单克隆抗体及SABC免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自购自武汉博士德公司。CIAS-1000细胞图像分析系统产自北京大恒图像视觉有限公司。全自动生化分析仪产自日本东芝公司。GENE GENIUS凝胶成像系统产自美国sygene公司。
2实验方法
2.1造模与分组 24只ApoE小鼠适应性饲养2周后随机分为正常对照组、粥样硬化组各12只（雌雄各半），正常对照组予普通饲料喂养，粥样硬化组予高脂饲料喂养造模，按文献方法进行[3]，每日每只予以高脂饲料（含胆固醇0.15％,21％猪油，78.85％普通饲料）喂养12周。
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2.2血脂检测及病理标本制作与染色 动物喂养12周后，在空腹禁食12h（不禁水）后，1%戊巴比妥0.5-1.0 ml经腹腔麻醉小鼠, 眼球摘除法取血置于室温静置2h后离心（3000转/min，15min），得到上层血清，-70℃冰箱储存，按照试剂说明书步骤测定小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平；颈椎脱臼法处死所有动物，迅速开胸剥离心脏，分离主动脉，选取胸主动脉弓部血管组织按说明制成病理切片标本。对标本HE染色，观察标本病理变化。
2.3统计方法 数据均以均数±标准差（±s）表示，两组间差异分析采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。所有数据经SPSS17.0统计学软件分析处理。
3.结果
3.1 光镜下主动脉病理形态学改变比较 正常对照组主动脉三层结构清晰，内膜光滑完整，平滑肌细胞排列整齐；粥样硬化组内膜明显增厚，可见大小不等、形态不规则的泡沫细胞聚集，弹力板处及细胞间隙可见大量脂质沉积，平滑肌细胞排列不规则。见图1。
3.2两组血脂结果 与正常对照组比较粥样硬化组血脂中TC、TG、LDL-C含量均明显升高（P<0.05），HDL-C明显降低（P<0.05）。见表1。
3.3β-catenin蛋白表达情况 与正常对照组比较，粥样硬化组主动脉组织中β-catenin蛋白表达显著升高（P<0.05）。各组主动脉组织中β-catenin蛋白表达的免疫组化结果及Western blot检测结果见表2。电泳图见图2。
4.讨论
作为公认的致AS最危险因素，众所周知，高脂血症会导致血管内皮细胞损伤、脂质沉积、单核细胞黏附以及血管壁平滑肌细胞增殖，最终导致AS的发生，关于其机制的研究近年来越来越多，比如有研究发现高脂血症中的ox-LDL能促进VSMC的增值，而促进VSMC增值是通过转录因子Id3来实现，并且VSMC 在增值过程中也会表达更多的胆固醇摄入性受体,从而促进脂质摄入，共同导致AS的发展。还有研究表明，脂质代谢异常会刺激VSMCs、IL-6、TNF-α、iNOS的产生，刺激巨噬细胞IL-6、TNF-α、MCP-1等的表达，促进单核细胞黏附，激活炎症反应，影响动脉粥样硬化斑块的稳定。
在wnt经典信号通路被激活的情况下，wnt配体与Fzd受体及低密度脂蛋白受体LRP5/6结合，从而抑制糖原合成激酶3β（GSK3-β）的活性，而GSK3-β通过使β-catenin蛋白进入细胞内的蛋白酶体途径降解，因此β-catenin蛋白水平在wnt经典信号通路激活时会显著升高，积聚在细胞质中，进入细胞核与T细胞因子/淋巴细胞增强因子（TCF/LEF）结合而激活下游的靶基因，从而参与包括AS在内的细胞增殖与分化。
本实验结果表明在高脂饮食下可以导致ApoE小鼠动脉粥样硬化模型，并且β-catenin蛋白表达水平明显增加，由此表明高脂饮食激活wnt/β-catenin信号通路，促进VSMC增值导致AS的形成。进一步的研究将有助于为AS的发病机制提供新思路，进而为AS的有效防治提供更加针对性措施。
参考文献
1.葛均波，徐永健.内科学[M].第八版：北京：人民卫生出版社，2013.220
2.施新猷.现代医学实验动物学[M].人民军医出版社，2000．9：470．
论文作者:吴勇 邹霞 罗辉 屈波
论文发表刊物:《中国医学人文》2016年2月第2期
论文发表时间:2016/5/18
标签：主动脉论文; 粥样论文; 小鼠论文; 细胞论文; 蛋白论文; 动脉论文; 对照组论文; 《中国医学人文》2016年2月第2期论文;