（1.湖南省药品检验研究院 长沙市 410001；2.湖南省药品认证与不良反应监测中心 长沙市 410205）
摘要：目的 建立2种金属盐类药物的微生物限度检查方法。方法 采用《中国药典》微生物限度检查方法进行验证试验，计算并比较各方法5种试验菌株的回收率。结果 试验样品甘草锌胶囊和碳酸锂片均具有一定的抑菌性。采用培养基稀释法可有效去除其抑菌性。结论 建立的2种金属盐类药物的微生物限度检查方法符合《中国药典》基本要求，可用于常规的药品质量控制检验工作。
关键词：金属盐类药物；微生物限度；培养基稀释法
金属离子与人体的生命活动密不可分，金属盐类药物有许多独特的药理活性，临床上广泛应用于矿物质缺乏、精神疾病、抗菌杀虫、消炎、抗病毒、抗肿瘤和疾病诊断等方面。且人们仍致力于发掘其新的药用潜力。本研究按照《中国药典》2010年版二部附录要求进行微生物限度检查方法验证试验，选择并建立正确的检查方法，方能真实反映金属盐类药物制剂的微生物污染程度[1]。本文经对甘草锌胶囊和碳酸锂片两种金属盐类药物的微生物限度检查进行方法学研究，确定了合适的供试液制备方法、测定方法及试验条件，为保证临床用药的安全性提供依据[2]。
1 仪器与材料
1.1 仪器
HTY-2000B集菌仪（杭州泰林生物），BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜（苏州净化设备有限公司），MLS-3780全自动高压蒸汽灭菌器（日本SANYO），Heraeus Multifuge X1 离心机（美国Thermo），Binder 240恒温培养箱（德国BINDER），SPX-380生化培养箱（宁波东南仪器），PL602-L电子天平（瑞士METTLER TOLEDO），NS01-75D1一次性薄膜过滤器（批号：20130524，北京牛牛基因技术有限公司）。
1.2 样品
甘草锌胶囊[规格：0.25g·粒-1]，碳酸锂片[规格：0.25g·片-1]，湖南某制药公司提供。
１.３ 培养基
营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基（批号：130516、120503、121022、130118、120113，北京三药科技开发有限公司）。
１.４ 菌种
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]（中国医学细菌保藏管理中心）。
1.5 稀释液及冲洗液
pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：130614，北京三药科技开发有限公司）。
2 试验方法
2.1 菌液制备
照《中国药典》2010年版二部附录，制备金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉的菌悬液，每1ml含菌数为50～100cfu。
2.2 供试液制备
称取样品10g，加45℃的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，混匀，500转/分钟离心3分钟，取全部上清液混合，制成1：10供试液。再用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成1：100供试液。
2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数检查验证试验[3]
2.3.1 常规法
取1：10供试液1ml，菌液适量，置平皿中，加入营养琼脂或玫瑰红钠琼脂培养基，按平皿法测定其菌数。
2.3.2 培养基稀释法
分别取1：10供试液0.2ml和0.1ml及菌液适量入皿，余下操作同2.3.1。甘草锌胶囊另取1：100供试液0.2ml和0.1ml入皿，同法试验。
2.3.3 薄膜过滤法
A组：取1：10供试液1ml，加至50ml稀释剂中，混匀，全部抽入滤器中。用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300ml冲洗滤膜，冲洗3次，每次100ml，在最后100ml冲洗液中加入菌液适量。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养。
B组：增大冲洗液用量。采用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml冲洗滤膜，冲洗5次，每次100ml。其余操作同A组。
C组：降低供试液起始浓度。取供试液（1：10）1ml，加至500ml稀释剂中，混匀，全部抽入滤器中。其余操作同A组。
2.4 控制菌检查验证试验
中国药典化学药口服制剂控制菌为大肠埃希菌，按照《中国药典》2010年版二部附录规定，进行胆盐乳糖培养基增菌验证试验，验证菌株为大肠埃希菌。
3 结果与讨论
3.1 供试液制备方法
由于两种供试品均不溶或微溶于稀释液，同时又具有一定的抑菌性，这也是金属盐类药物的通常属性。鉴于此，采用45℃的稀释剂制备供试液，有助于供试品的溶解；采用低速离心的方式（500转/分钟离心3分钟），取离心后的上层液进行试验，以尽可能地降低供试品对限度检查结果的影响。经试验验证，上述实验操作有利于供试品中微生物的检出[4]。
3.2 甘草锌胶囊微生物限度检查验证试验结果
3.2.1 细菌数验证试验结果
不同方法测定甘草锌胶囊3种试验细菌的回收率验证试验结果见表1。
3.3.3 控制菌验证试验结果
按2.4的方法，碳酸锂片采用常规方法进行大肠埃希菌检查验证试验，试验结果表明方法可行。
3.4 上述甘草锌胶囊和碳酸锂片微生物限度检查验证试验结果表明，在建立金属盐类药物微生物限度检查方法或进行微生物限度常规检验时，应仔细分析制剂的处方工艺，该类制剂很可能对细菌或真菌具有抑制作用，不应笼统地用平皿常规法进行检测，否则将无法保证检测结果的准确性。
3.5 对于抑菌活性较强的供试品，应根据供试品的性质和验证试验结果，采用回收情况最佳的测定方法进行药品微生物限度检查[6]。
3.6 在新版药典正式实施以后，在建立金属盐类药物微生物计数方法时，建议多考虑增大稀释液体积的方法。对抑菌性较强的药物，可根据供试品性质采用中和法，同时应考察中和剂毒性。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].中国医药科技出版社，2010年版二部.2010
[2]曹晓云，郭艳娟. 药品微生物限度检查方法学验证试验及其相关的技术问题[J].天津药学，2006（6）∶49-51
[3]许华玉，杜芸，钱文静等. 药品微生物限度检查法中细菌和真菌计数方法的验证试验[J].中国中药杂志，2005，30（24）∶1918-1920
[4]吴鑫，陈希，鄢雷娜.盐酸特比萘酚乳膏微生物限度检查法的方法学研究[J].中国药事，2013，27（1）∶48-50
[5]汤茜.二天油及活络酒微生物限度检查方法验证[J].中国药业，2010，19（24）∶34-35
[6]黄依玲. 医院制剂微生物限度检查方法的重新验证[J].中国现代药物应用，2013，7（9）∶3-4
注：基金项目：湖南省自然科学基金（2015JJ6053）
第一作者简介：汤茜，硕士，高级实验师，从事微生物检测研究。
通信作者简介：林海，研究员，从事食品药品检测研究。
论文作者:汤茜1,袁农2,林海1
论文发表刊物:《航空军医》2017年第18期
论文发表时间:2017/11/17
标签：微生物论文; 培养基论文; 限度论文; 盐类论文; 方法论文; 药典论文; 琼脂论文; 《航空军医》2017年第18期论文;