苏州大学附属第一医院 215006
【摘 要】目的 研究组织因子（TF）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的作用，探讨其在NSCLC 中的表达及其临床意义。方法 收集2009年1月至2011年3月73例NSCLC患者手术标本，其中男 59例，女 14例；腺癌38例，鳞癌35例。14例肺良性病变患者的标本做对照，其中男 9例，女 5例；炎性假瘤8例，结核瘤3例，错构瘤、平滑肌瘤和硬化血管瘤各1例。采用蛋白印迹法（Western blotting）和免疫组织化学法检测其中组织因子的表达。结果 NSCLC癌组织染色阳性率明显高于肺良性肿瘤组阳性率[100%（n=73）vs .35.7%（n=5）]，肺腺癌组织标本中高表达率明显高于肺鳞癌组织标本高表达率[63.2 %（n=24）vs .37.1%（n=13）]，差异有统计学意义（P<0.01）。 组织因子在NSCLC中的表达高于肺良性病变组织（P<0.01），癌组织高于癌旁正常组织（P<0.05），肺腺癌高于肺鳞癌（x2 =4.930，P=0.026），分化程度越低表达越高（x2 = 6.060，P=0.094），晚期（Ⅲ期和Ⅳ期）肺癌中的表达高于早期（Ⅰ期和Ⅱ期）肺癌组织（x2 =4.930，P=0.026）。 结论 组织因子不仅在NSCLC中过表达，而且与其临床病理特征密切相关，可能提示组织因子参与肺癌的形成和发展。
【关键词】组织因子；非小细胞肺癌；肺腺癌；免疫组织化学
The Expression and Clinical Signification of Tissue Factor in Non-Small Cell Lung Cancer
XU Cheng-cheng，MAO Guo-cai，LI Zhong-cheng，MA Hai-tao，GUI Qi
Cardiothoracic Surgery，The First Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou 215006，P.R.China
Corresponding author：GUI Qi
Abstract： Objective This study is to investigate the expression of tissue factor in non-small cell lung cancer（NSCLC）and discuss the relationship between tissue factor and the clinical signification of NSCLC for revealing the role of tissue factor in NSCLC. Methods 73 NSCLC specimens（38 cases are lung adenocarcinoma，35 cases are squamous cell lung carcinoma; 59 cases of them are male patients and there are 14 female patients）and 14 lung benign lesions（8 cases are inflammatory pseudotumor，3 cases are tuberculoma and leiomyoma，hamartoma，sclerosing hemangioma is one case，respectively; 9 cases of them are male patients and there are 5 female patients）were collected，and the expression of tissue factor in the specimens was detected by Western blot and Immunohistochemistry. Results The level of tissue factor expression in NSCLC，lung carcinoma tissues，lung adenocarcinoma and advanced stage was higher than that in benign lesions（P<0.01），adjacent normal tissues（P<0.05 or P<0.01），squamous cell lung carcinoma（P<0.01）and early stage（P<0.05），respectively; and higher expression was correlated with lower tumor differentiation（P<0.01）. Conclusion Tissue factor is not only over-expression in NSCLC but also closely related to clinicopathological features，and it may play a role in the development of NSCLC.
Key words：Tissue factor; Non-small cell lung cancer; Lung adenocarcinoma; Immunohistochemistry
全世界每年大约有160万新增肺癌患者，同时接近有140万肺癌患者死亡，肺癌已是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]。非小细胞肺癌（NSCLC）主要包括腺癌和鳞癌，占肺癌总数的85%左右，是目前研究治疗的重点。肺癌的分子生物学治疗在近十年中取得了巨大的成绩，如作用表皮生长因子受体（EGFR）途径的药物[1-2]，因此寻找肺癌分子作用靶点是当前的热点。大量的研究认为机体凝血系统参与肿瘤的发生和发展，并在肿瘤患者的循环血中检测到组织因子微粒且远高于正常人，怀疑与肿瘤有关[3]，目前组织因子在肺癌中的表达情况以及与其临床病理特征关系的研究报道甚少[4]。我们的研究采用蛋白印迹法（Western blotting）和免疫组织化学法（免疫组化）检测73例NSCLC和14肺良性肿瘤标本组织因子的表达，初步探讨组织因子与NSCLC的关系，为进一步研究提供基础。
1 材料与方法
1.1 标本和临床资料
收集73例NSCLC患者的癌组织和癌旁组织（距离癌组织2 cm）手术标本，其中男 59例，女 14例；年龄60~79岁；腺癌38例，鳞癌35例。以14例肺良性肿瘤患者标本为对照，其中男 9例，女 5例；年龄60~68岁；炎性假瘤8例，结核瘤3例，错构瘤、平滑肌瘤和硬化血管瘤各1例。每组每例标本取材后分成2份，1份置于液氮速冻后-80 ℃超低温冰箱保存，1份置于4%的中性甲醛固定后石蜡包埋，做HE染色和免疫组织化学（免疫组化）染色。
1.2方法
1.2.1 Western blotting 采用放射免疫沉淀分析法（RIPA）组织裂解液提取冰冻标本组织的总蛋白，用BCA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）测定蛋白浓度。各组取20 ug蛋白加样于10%聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳，之后稳流将蛋白转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，常温5％脱脂牛奶封闭2 h，一抗组织因子（免疫源性鼠抗人，浓度1：2000，购至美国SantaCruz公司）或一抗内参beta-actin（免疫源性鼠抗人，浓度1：2000，购至美国SantaCruz公司）4℃孵育过夜，Tris缓冲盐溶液液漂洗膜15 min×4次，加入含有辣根过氧化物酶的二抗（羊抗鼠IgG，浓度1：3 000，购至KLP公司）常温孵育2 h，再用TBS-T缓冲液漂洗膜15 min×4次，最后使用发光液（ECL）显影液（武汉博士德生物工程有限公司），曝光，显影。利用灰度分析法检测蛋白条带的灰度值，计算相对蛋白含量（相对蛋白含量 =目的蛋白条带灰度值/内参beta-actin灰度值）。
1.2.2 免疫组化染色 采用链霉素亲和生物素-过氧化物酶免疫组化染色方法（SP-9000免疫组化试剂盒购至中衫金桥公司）。将石蜡标本组织切片脱蜡入水，3%H2O2溶液封闭内源性过氧化物酶10 min，之后置于0.01 mol/L，pH值 6.0的柠檬酸缓冲液内用微波抗原热修复2 min，羊血清封闭30 min，加入一抗组织因子（浓度1：100），4 ℃过夜，1×磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗5 min×3次，加入生物素化羊抗鼠二抗（浓度1：200）37 ℃孵育2 h，1×PBS漂洗5 min×3次，加辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育30 min，1×PBS漂洗5 min×3次，DAB显色1-2 min，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封固，光学显微镜观察。上述步骤中1×PBS液代替一抗作为阴性对照。
1.2.3免疫组化染色结果评价 参照文献报道[5]，免疫组化每张切片随机选取5个高倍视野（×200），胞浆呈棕黄色为阳性细胞，细胞浆无棕色或与背景色一致为阴性细胞，并根据组织染色程度分为0~3 级，0级阴性：胞浆无着棕色；1级弱阳性：着色细胞数＜5%；2级阳性：着色细胞数在5%~50%；3级强阳性：着色细胞数>50%。高表达组织为定义为2~3级，低表达组织为0~1级。
1.3 统计学分析
采用SPSS12.0统计软件进行统计处理，对计数资料采用卡方检验，对计量数据采用单因素t检验，所有统计检验都为双侧检验，P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 组织因子的表达
2.1.1免疫组化染色检测结果 NSCLC癌组织染色阳性率明显高于肺良性肿瘤组阳性率[100%（n=73）vs .35.7%（n=5）]；肺腺癌组织标本中高表达率明显高于肺鳞癌组织标本高表达率[63.2 %（n=24）vs .37.1%（n=13）]，差异有统计学意义（P<0.01）;腺癌组织中癌细胞可见强阳性表达组织因子，而周围正常的成纤维细胞弱阳性或阴性 。肺腺癌和鳞癌中组织因子的表达情况见图1~3。
3 讨 论
组织因子（TF）是一个47kD的跨膜糖蛋白，各种组织器官中都有表达[6-7]，正常情况下在不与血液接触的基质细胞、上皮细胞和平滑肌细胞中高度表达[8]，当机体器官受到炎症、外伤出血等刺激下，血管内的细胞如内皮细胞、血小板和粒细胞等暴露释放组织因子，与FVIIa形成复合物起始激活机体外源性的凝血系统[9]。近年来，发现组织因子在某些肿瘤中高度表达，如结肠癌、恶性黑素瘤和胰腺癌等[10-12]，且可能和这些肿瘤的恶性程度、临床病理分期甚至生存期相关。通过体内外的研究表明组织因子过度表达可以促进肿瘤新生血管的形成，增强肿瘤的转移和侵袭能力[13-14]，其作用机制主要是TF-FⅦa复合物结合肿瘤细胞表面的蛋白酶活化受体（PARs），继而激活下游促肿瘤生长增殖的信号通路[8]，表达促肿瘤生长因子如：血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮生长因子受体（VEGFR）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和金属基质蛋白酶（MMPs）等[15]。
我们的研究发现在NSCLC的癌组织中组织因子的表达明显高于癌旁正常组织和肺良性肿瘤组织，这一结论与Callander等[5]关于组织因子免疫组化染色在肺癌组织表达中的个案报道（8例NSCLC癌组织）结果一致。进一步结果分析发现在肺腺癌中的表达明显高于肺鳞癌组织，NSCLC分化程度越低，组织因子表达越强，且在晚期（Ⅲ期和Ⅳ期）肺癌中表达高于早期（Ⅰ期和Ⅱ期）肺癌。因此，我们初步认为NSCLC中组织因子的表达与肺癌的临床病理特征有关，这与在其他肿瘤中的研究结论相一致[10，12]。同时体外的一些肺癌细胞株的研究也认为恶性程度高的肺癌细胞中组织因子的表达活性远高于低度恶性的细胞[16-17]。这提示组织因子可能参与NSCLC的形成和发展，如果我们在下一步的随访中发现组织因子表达强弱和生存率呈负相关，那么组织因子可能成为判断NSCLC患者预后的一个指标。
近年来，在结肠癌和恶性黑色素瘤的体外研究中，将组织因子作为作用靶点，采用RNAi干扰技术特异性的沉默组织因子的表达可以有效的抑制相关肿瘤的转移和侵袭能力，增强化疗药物促肿瘤细胞的凋亡作用[13-14，18]，这也是我们下一步研究的方向。我们的研究还发现，NSCLC癌组织中的血管内皮细胞表达的组织因子异常高于正常组织血管内皮细胞的表达，因此根据其定位，设计可以特异性结合组织因子的抗肿瘤药物，提高药物治疗的靶向性，减少对正常组织的损伤，为肿瘤治疗提供了一条新思路。
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注：课题项目：苏州市“科教兴卫”青年科技项目（kjxw2014003）
论文作者:徐澄澄1,毛国才1,桂琦通讯作者
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2016年9月第18期
论文发表时间:2017/1/6
标签：组织论文; 因子论文; 肺癌论文; 细胞论文; 肿瘤论文; 免疫论文; 高于论文; 《中国医学人文》(学术版)2016年9月第18期论文;