[关键词] 右美托咪定 线粒体分裂
缺血再灌注损伤（Ischemia reperfusion,I/R）在临床中非常常见，有研究显示右美托咪定（dexmedetomidine, DEX）可以减轻心、脑、肾、肠、肝等重要脏器的缺血再灌注损伤（1-3）。但是，右美托咪定脑保护的机制中，线粒体机制研究比较少，而线粒体在细胞中是能量车间，对于维持细胞的稳定状态至关重要，因此，本实验通过体外大鼠海马神经元氧糖剥夺和复氧（OGD/R）处理来模拟脑的缺血再灌注损伤模型（4-5），目的就是为了探讨右美托咪定脑保护的线粒体机制，为研究药物减轻脑的I/R损伤提供新的思路。
材料与方法
实验方法与分组 元代神经细胞分离与培养取出生24小时之内的雄性SD大鼠（青岛大学中心实验室提供），按照既往文献方法（6）用碘伏浸泡乳鼠2分钟，酒精浸泡3分钟，然后断头处死，取大脑海马组织，尽量剪切干净其他组织，然后将海马组织放入5ml含10%血清的DMEM-F12培养基。移除培养基，加入3ml0.25%的胰酶，剪碎海马组织之后，将含有胰酶的剪碎的海马组织放入25cm2细胞培养瓶中，待胰酶消化20-25min后，用吸管轻轻吹打至基本组织消失，加入培养基终止消化。收集用200目的细胞网筛过滤后的悬液，离心1000rpm 5min的细胞滤液弃去上清，加入DMEM-F12种植液（10%血清）于细胞沉淀中，将吹打细胞最终变成悬液。将细胞以7×105/ml的密度接种于提前一天用多聚赖氨酸包被的细胞培养瓶及培养板中，放入37℃，95%O2,5%CO2，相对湿度100%的细胞培养箱中进行培养。12h之后用含2%B27、1%谷氨酰胺、1%丙酮酸钠的Neurabasal-A培养液替换细胞种植液，以后每3天换液1次，每次换液一半，当培养到第8天时，神经元基本上发育成熟。将原代培养的海马神经元，随机分为3组：（1）正常对照组（C组）：细胞没有经过其他的处理。（2）缺氧复氧组（OGD/R组）：将无糖Earle’S平衡盐溶液换成Neurabasal-A培养液，于三气培养箱中进行氧糖剥夺2h，随后换成正常条件下复氧继续培养20h。（3）右美托咪定组（DEX组）：细胞于氧糖剥夺2h及复氧20h中加入1μmol/l的右美。
建立细胞缺氧－复氧模型 当神经元细胞孵育至第８天，模拟缺氧状态调节培养箱的温度和气体条件， 然后除去Neurabasal-A培养液， 用0.01mol/l的PBS冲洗两遍后添加无糖Earle’S液，2h后恢复有氧状态，继续培养20h，完成OGD/R模型。
检测Ca２＋荧光强度 分组处理完毕后，吸除Neurabasal-A培养液，并将细胞用Hank’s液冲洗３遍；每个孔中间加入Fluo3-AM(5μmol/l)与Pluronic F127(0.05%W/V)工作液100μl，避光37℃孵育45min；将Fluo3-AM工作液移除，并用Hank’s液再次冲洗细胞３次之后，于每孔中加入Hank’s液100μl继续避光，37℃孵育30min。孵育完毕之后，移除Hank’s液，4%多聚甲醛固定之后，将细胞爬片盖到滴有100μl甘油的载玻片，并用指甲油封片。在激发波长为488nm，发射波长为525nm下，用激光共聚焦显微镜的油镜，观察Ca２＋荧光强度。结果图片用Image J软件进行分析，取各组Ca２＋荧光的平均值进行分析。
测定Drp1、Fis1蛋白含量 根据蛋白质分子量，分别配制8%及15%的分离胶及浓缩胶，加入彩色预染蛋白质marker 3μl，并根据所测蛋白质浓度，每组加入20μg蛋白质样品，80v电泳30min左右，将电压调为120v继续电泳90min。PVDF膜甲醇浸泡之后，覆盖蛋白质条带进行转膜90min，结束后将PVDF膜标记正反面，加入用5%脱脂奶粉配制的兔抗鼠单克隆一抗Drp1(1:400)、小鼠抗大鼠单克隆一抗Fis1(1:1000)，PVDF膜蛋白质面朝上，放于４℃冰箱孵育过夜。回收一抗之后,TBST洗膜３次，每次10min，分别加入山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗(1:5000)于摇床之上孵育1.5h回收二抗，TBST洗膜４次，每次5min，最后上机显影。使用Image Pro软件分析结果。
统计分析 采用SPSS18.0软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（X±S）表示，组间比较采用单因素方差分析,P<0.05代表差异具有统计学意义。
结果
Ca２＋荧光强度 OGD/R组Ca２＋荧光强度明显强于C组（P<0.05）. D组Ca２＋荧光强度明显强于C组并弱于HR组（P<0.05）（表1）。
线粒体分裂相关蛋白Drp1、Fis1含量 OGD/R组Fis1蛋白含量明显高于Ｃ组（P<0.05）。D组Fis1蛋白含量明显高于Ｃ组、低于OGD/R组（P<0.05）（表2）。
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讨论
在临床中，急性脑中风，脑创伤以及脑部手术过程中都可以引起缺血再灌注损伤，缺血再灌注损伤被认为是继发性脑损伤的重要因素，当脑组织缺血时，神经细胞氧和营养的供应都会缺乏，继而会引起无氧酵解，酸性物质产生，氧自由基的蓄积，炎性因子的大量释放，细胞中钙离子的超载，这些都对神经元造成打击，当恢复氧灌注之后，损伤的脑组织中血管通透性增加，脑组织充血，局部血管发生窃血现象等加重了缺血脑组织的损伤，细胞发生了凋亡，甚至死亡。凋亡细胞的转化会有两个方面，一是逐渐好转，细胞逐渐恢复至本来状态，二是逐渐恶化，发生细胞死亡凋亡细胞恶化的比例进一步决定了缺氧复氧损伤的严重程度。
线粒体是细胞内非常重要的、活跃的细胞器，是细胞中主要供应能量的结构，是细胞中的“动力车间”，线粒体的稳定与否决定了细胞的稳态。线粒体在细胞中不停的高速运动着，不停的进行着分裂和融合， 线粒体分裂的多少与细胞凋亡的程度有着密切的联系，抑制线粒体分裂能够减轻脑皮质部分的缺氧复氧损伤。有研究证实缺血再灌注损伤与细胞内的钙超载密切相关，如果细胞内钙超载，脑缺血再灌注损伤导致的神经细胞凋亡可能与钙离子依赖性蛋白酶活性有关，因此，细胞内钙离子的超载、凋亡、线粒体分裂可能相互作用，共同促进缺血再灌注损伤的发生。线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1在线粒体的分裂和融合当中起到重要作用（7）。Drp1在线粒体表面组装和寡聚化以诱导分裂，而Fis1的作用是通过结合并募集Ｄｒｐ１到线粒体表面促进线粒体的分裂，它可以调节线粒体的数量和位置、细胞能量的变化和及时处置受损的线粒体。有研究表明线粒体的分裂过程中，钙信号可以对线粒体分裂相关蛋白Drp1的磷酸化与去磷酸化产生影响（8,9）。因此，如果减少线粒体摄取钙离子的量，就可以降低线粒体的分裂能力，减少线粒体的分裂次数。
我们通过实验发现右美托咪定能够降低细胞质Ca２＋浓度，减少线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1的表达，其机制可能是右美托咪定能降低钙超载从而抑制钙调神经磷酸酶的活性，减少其对Drp1-ser637的磷酸化，进而抑制Drp1的转位，减少与线粒体外膜蛋白Fis1的结合有关系；此外，右美托咪定还可以抑制Drp1-ser637与Fis1的表达，减少它们在线粒体外膜的共定位结合，从而抑制线粒体分裂。综上所述，右美托咪定可以减轻大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中的线粒体分裂，发挥神经保护作用。
参考文献
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论文作者:唐莹 李红梅 陈华永 王雪 张思彦
论文发表刊物:《中国医学人文》2020年4期
论文发表时间:2020/4/10
标签：线粒体论文; 细胞论文; 神经元论文; 损伤论文; 荧光论文; 蛋白论文; 组织论文; 《中国医学人文》2020年4期论文;