王娜１ 佟凤芝１ 曾常茜２ 王佳瑞１ 佟静１ 侯艺１
１．大连市第五人民医院 辽宁 大连 １１６０２１;２．大连大学医学院,辽宁省生物有机重点实验室 大连 辽宁 １１６６２２ 基金项目:大连市科学技术基金计划项目(２００８J２１JH００５)
【摘要】 目的 观察姜黄素对海人酸活化的BV－２小胶质细胞增殖和ERK１/２表达的影响,探讨其可能的分子机制.方法 将BV－２细胞分为对照组、海人酸组和姜黄素组,免疫组化法检测各组BV－２细胞PCNA,免疫组化法检测各组BV－２细胞ERK１/２蛋白表达,RT－PCR 方法检测各组BV－２细胞ERK１/２ mRNA 的表达.结果 对照组BV２细胞PCNA 阳性率为(１５．６８±１．０３)％,海人酸组BV２细胞PCNA 阳性率为(６０．２４±１．２５)％,明显高于对照组(P＜０．０５),姜黄素组BV－２细胞PCNA 阳性率为(２０．３５±１．４６)％,明显低于海人酸组(P＜０．０５);海人酸组BV－２细胞ERK１/２蛋白表达与对照组比较显著增高(P＜０．０５),姜黄素组与海人酸组相比,ERK１/２蛋白表达显著降低(P＜０．０５);海人酸组BV－２细胞ERK１/２ mRNA 表达水平与对照组相比显著增高(P＜０．０５),姜黄素组BV－２ 细胞ERK１/２mRNA 表达水平与海人酸组相比显著降低(P＜０．０５).结论 姜黄素对海人酸活化的BV２小胶质细胞具有增殖抑制作用,其机制可能与下调BV－２细胞ERK蛋白和mRNA 表达有关. 【关键词】 姜黄素;BV－２细胞;增殖;ERK 【中图分类号】R２８５．５【文献标识码】B 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０３７３－０２
姜黄素(curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取出来的一种黄色小分子植物多酚[１].姜黄素是祖国医学中抗炎的常用药物, 具有抗炎、抗肿瘤、抗HIV、抗菌、抗氧化等多种药理作用,且毒性低,具有良好的临床应用潜力,受到国内外广泛的关注[２].本文通过检测增殖细胞核抗原(PCNA)观察姜黄素对海人酸活化的BV－２小胶质细胞增殖的影响,并检测姜黄素对海人酸活化的BV－２细胞ERK 蛋白和mRNA 表达的影响,旨在探讨姜黄素抑制海人酸活化的BV－２细胞增殖的分子机制. １ 材料
１．１ 细胞株BV－２小胶质细胞由中国医科大学免疫学研究室提供. １．２ 试剂 海人酸购自Sigma公司;姜黄素(纯度９９％)购自Sigma公司;兔抗小鼠PCNA 抗体、ERK１/２抗体购自CellSignalingTechnology公司;羊抗兔IgG－HRP 购自CellSignaling公司;DAB 显色剂购自北京中杉金桥公司.HibernateA/B２７medium(HABG)、胎牛血清购自Fermentas公司;RT－PCR 反应试剂盒、Trizol、DEPC购自大连宝生物公司. 引物由大连宝生物公司合成:ERK１/２引物:Forward:５’－ACCTCCTGCTGAACACCACTT－３’Reverse:５’－GTCGTCCAACTCCATGTCAAACT－３’β－actin引物:Forward:５’－GAGGGAAATCGTGCGTGAC－３’Reverse:５’－CTGGAAGGTGGACAGTGAG－３’ ２ 方法２．１ BV－２细胞培养及传代 将BV－２细胞接种于含１０％胎牛血清、１００IU/ml青霉素、１００μg/ml链霉素的DMEM 培养基中,置于３７℃５％ CO２培养箱培养.每隔２－３d用０．２５％胰蛋白酶消化BV－２细胞并进行传代.
２．２ 免疫组化法检测BV－２细胞PCNA 和ERK１/２ 表达 取对数生长期的BV－２细胞接种于内置有盖玻片的６孔细胞培养板,置于３７ ℃ ５％ CO２培养箱培养２４h,吸弃培养基.按上述２．１方法将BV－２细胞随机分为三组,继续培养２４h.吸弃培养基,用PBS 缓冲液洗涤２ 次.用７５％ 乙醇４℃ 固定１５min,干燥１０min,PBS洗３次.与３％ H２O２孵育１５min,PBS洗３次.正常羊血清室温封闭２０min.与兔抗小鼠PCNA、兔抗小鼠ERK１/２４℃孵育过夜,PBS洗３次.分别与羊抗兔IgG－HRP抗体室温孵育３０min,PBS洗３次.DAB染色,自来水冲洗,苏木素复染３０s,自来水冲洗,中性树胶封片,显微镜下观察各组BV－２细胞PCNA. ２．３ RT－PCR法检测BV－２细胞ERK１/２mRNA 表达水平 在各组细胞中加入０．１２５％胰蛋白酶消化,１０００r/min离心５min,弃上清,PBS洗涤２次,弃去上层液,加入０．５mlTrizol,室温下静置５min,加入０．２ml氯仿,用涡旋混匀１５s,１２０００r/min×１５min４℃离心.吸取上清,加入等体积异丙醇,充分混匀,－２０℃静置３０min,１０００r/min×１０min４℃离心.弃去上清,加入１ml７５％乙醇,６０００r/min×５min４℃离心.弃去上清,室温干燥５－１０min.用适量无RNA 酶水溶解沉淀,５５－６０ ℃水浴５min,测定RNA 的OD 比值,将RNA 稀释至１μg/μl,在总体积为２５μl的反应体系中加入RNA１μl,上下游引物各１μl,在PCR仪上按预设条件进行反转录.在PCR管中加入PCR反应液,９４℃预变性２min,９４℃３０s后５５℃３０s,７２℃１min３０个循环,最后降至４℃.用１％琼脂糖凝胶,加样后１００V 电泳２０min.经凝胶成像系统将图像扫描入计算机并保存,用QuantityOne软件进行灰度分析.以β－actin为内参,将各条带灰度值与β－actin 进行比值,以确定BV－２ 细胞ERK１/２ mRNA 表达水平.
２．４ 统计学分析 实验数据采用SPSS１１．５统计软件,计量资料以(mean±SD,n＝５)表示,以单因素方差分析进行组间比较.P＜０．０５ 为差异具有显著性. ３ 结果３．１ 姜黄素对海人酸活化的BV－２细胞PCNA 的影响免疫组化方法检测三组BV－２细胞PCNA 结果见表１.对照组中BV－２细胞胞核PCNA 阳性率为(１５．６８±１．０３)％,海人酸组BV－２细胞胞核PCNA 阳性率为(６０．２４±１．２５)％,海人酸组与对照组比较,统计学处理差异显著(P＜０．０５);姜黄素组BV－２细胞胞核PCNA 阳性率为(２０．３５±１．４６)％,与海人酸组比较,经统计学处理差异显著(P＜０．０５).
表１ 姜黄素对海人酸活化的BV－２细胞PCNA 的影响(mean±SD,n＝５)
注:海人酸组与对照组比较:★P＜０．０５;姜黄素组与海人酸组比较:★★P＜０．０５ ３ 讨论癫痫是一种难治性神经退行性疾病,其发病机制与小胶质细胞的增殖活化有很大的联系.小胶质细胞可以对神经系统中微小的病理变化做出反应, 在各种神经损伤中起重要作用.小胶质细胞活化后,除了已知的清除垃圾作用外,还有可能主动参与了众多神经病变的病理过程.由激活的小胶质细胞产生的NO,其作为活性氧的一种,同时还参与调节小胶质细胞的吞噬功能变化,可导致细胞毒性,在癫痫的发生、发展中起到了重要作用.在离体实验中, 海人酸诱导小胶质细胞活化后,其释放的TNF－α、IL１等会产生神经毒性作用,而癫痫的反复发作又可导致神经元受损或凋亡,它们都是导致癫痫反复发作的重要原因之一[３].ChoiJ[４]等通过手术发现,在患者的脑组织中存在着大量被活化的神经胶质细胞.脑内星形胶质细胞的增生以及小胶质细胞的活化会加剧癫痫的发作范围和程度.RiddleDR[５]等研究表明,NO 还可激活N－ 甲基－D－天门冬氨酸(NMDA)受体,使神经细胞的兴奋性增高,从而参与癫痫的发生.因此,过量NO 的产生可能是癫痫发生的另一个重要机制.炎症是癫痫发作和持续发作的重要原因,在癫痫患者的手术治疗中也可发现炎性因子,活化的小胶质细胞,而这些炎症标志物在正常人海马中并没有被发现.
本实验用免疫组化方法研究发现,对照组中BV－２细胞胞PCNA 阳性率为(１５．６８±１．０３)％,海人酸组PCNA 阳性率为(６０．２４±１．２５)％,海人酸组PCNA 阳性率显著高于对照组(P＞０．０５),表明海人酸可显著诱导BV－２细胞增殖. 文献报道,姜黄素通过抑制主要的炎性介质,如 TNF－α、核转录因子κB (NF－κB)等而发挥抗炎作用[６].姜黄素能调节大量的NF－κB基因,从而抑制其活化.因此,可利用这一点治疗受NF－κB基因调控的各种疾病[７].TNF－α产生的促炎效应主要是通过它对NF－κB的活化而来的,姜黄素抑制了NF－κB的活化,则相当于抑制了TNF－α,从而达到抗炎的目的.SumanontY[８]发现姜黄素可以抑制海人酸诱导的癫痫发作以及减少NO 的生成,其机制可能是通过姜黄素的抗氧化能力和清除NO 活性而发挥神经保护作用.姜黄素是含有许多功能基团的抗氧化剂,PriyadarsiniKI[９]指出酚基团对于姜黄素清除氧自由基是必要的.PanMH[１０]等发现姜黄素能明显降低脂多糖激活的巨噬细胞产生诱导型NOS(iNOS),抑制NO 的大量生成.ShinHJ[１１]用姜黄素预处理小鼠,１８ 小时后注入海人酸诱导癫痫发作,４８ 小时后处死小鼠,Tunel染色及组织学评估发现姜黄素预处理能显著减少海人酸诱导的神经元凋亡.本实验用免疫组化研究发现,姜黄素组BV－２细胞胞PCNA 阳性率为(２０．３５±１．４６)％,显著低于海人酸组(P＜０．０５),
表明姜黄素能显著抑制海人酸活化的BV－１小胶质细胞增殖. 细胞外信号调节蛋白激酶(Extracellularsignal－regulated kinases,ERK１/２)信号通路是细胞内重要的增殖相关通路.癫痫发作时,小胶质细胞内ERK１/２蛋白含量升高,ERK１/２可磷酸化下游核转录因子激活蛋白－１(activatorprotein－１,AP－１),活化的AP－１可与cyclinD１基因启动子区结合,转录表达cyclinD１,促进细胞末期G１向S期转化,从而促进小胶质细胞增殖.同时小胶质细胞异常增生活化、分泌炎症因子[１２].文献报道,应用ERK 特异性抑制剂PD９８０５９能够显著抑制小胶质细胞中AP－１与DNA 结合活性,可减弱小胶质细胞活化增殖,减少炎症因子分泌.提示ERK１/２蛋白与小胶质细胞活化增殖关系密切. 本实验发现,海人酸活化的BV－２细胞ERK１/２
表达增高,与KakiashviliE 等研究结果一致[１３].进一步应用姜黄素处理,发现开会时能下调海人酸活化的BV－２细胞ERK１/２蛋白和mRNA 表达及活性,表明姜黄素可能通过下调ERK１/２蛋白和mRNA 表达抑制BV－２细胞增殖. 由此可见,姜黄素对海人酸活化的BV２小胶质细胞增殖具有抑制作用,其机制可能与下调BV－２细胞ERK蛋白和mRNA 表达有关.研究结果为姜黄素抑制小胶质细胞增殖的机制提供了新认识,对防治癫痫的进行性发展及研发癫痫有效的治疗手段具有重要意义.
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论文作者:王娜１ 佟凤芝１ 曾常茜２ 王佳瑞１ 佟静１ 侯艺１
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年12月供稿
论文发表时间:2016/3/2
标签：姜黄论文; 细胞论文; 胶质论文; 癫痫论文; 抑制论文; 阳性论文; 蛋白论文; 《中国综合临床》2015年12月供稿论文;