陈然[1]2007年在《趋化因子和IL-6家族细胞因子调节神经干细胞迁移和分化的交互作用》文中认为神经干细胞(neural stem cells，NSCs)是存在于中枢神经系统内能够分化成为神经元和神经胶质细胞的特定类型细胞。对于神经干细胞的研究能加深人们关于神经系统生成及发育等方面的认识，并能对神经系统的疾病治疗和损伤修复作出一定的指导，具有重要的意义。在本研究中，我们首先在含碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)的无血清培养基培养了大鼠前脑神经干细胞。神经干细胞以多细胞聚集体的神经球形式存在。将神经球打散成单细胞后培养，能重新增殖形成神经球；利用神经干细胞特异性的标记Nestin鉴定原代及传代神经球，显示出Nestin阳性。用细胞因子H-IL-6处理贴壁分化的神经干细胞发现，H-IL-6能显着地抑制大鼠神经干细胞的体外迁移和分化，且抑制作用呈浓度依赖性。细胞贴壁后，趋化因子SDF1、趋化因子受体CXCR4及CX3CR1的mRNA含量明显上升。但经H-IL-6作用后，CXCR4和少突胶质细胞标志物PLP表达水平显着下调。与此同时，JAK／STAT通路的主要抑制因子SOCS家族蛋白mRNA表达水平显着上调。实验结果表明，H-IL-6是调控神经干细胞迁移和分化的因素之一，可能通过两种途径抑制了神经干细胞的迁移：一、H-IL-6降低了CXCR4的表达水平；二、H-IL-6的刺激引起JAK／STAT通路的激活，继而引起负反馈调控因子SOCS3的大量表达。SOCS3与CXCR4结合，抑制其活性。H-IL-6还能够抑制神经干细胞向少突胶质细胞分化。这说明趋化因子和IL-6等细胞因子在调控神经干细胞迁移和分化方面存在着交互作用。更深入的研究将描绘出清晰而具体的信号转导与调控的网络结构，并为神经生物学的研究带来新的方向。
黄斐[2]2017年在《控释细胞因子的胶原凝胶生物支架对神经干细胞生物学的影响》文中研究表明中枢神经损伤后神经元无法再生,损伤平面以下运动,感觉及括约肌功能丧失。现有的治疗措施只能延缓脊髓损伤,无法逆转已损伤的神经组织。神经干细胞的发现为其治疗提供了一个全新的方向。神经干细胞具有增殖、自我更新和分化成神经细胞的能力,从而替代死亡的神经元,重建神经通路。但目前单纯神经干细胞移植由于缺乏细胞外基质的支持,其存活率和分化特性严重受到影响。而神经组织工程技术治疗脊髓损伤是现在研究的一个热点,本课题组拟通过神经球方法原代培养大鼠胚胎神经干细胞,并研究神经干细胞体外分化特性,利用培养的神经干细胞作为种子细胞和胶原凝胶生物支架一起构建神经干细胞叁维培养模型,并检测胶原凝胶生物支架与神经干细胞的生物相容性,最后构建控释细胞因子的胶原凝胶生物支架,并观察其对神经干细胞的生物学影响。本研究共分为叁个部分:在第一部分中,我们利用无血清悬浮培养的方法分离培养大鼠胚胎皮质来源的神经干细胞,用免疫荧光的方法检测神经干细胞及其分化细胞的标志物。结果显示体外无血清培养胎鼠皮质神经干细胞,可得到悬浮生长的神经球,但悬浮生长的神经球可以发生融合,免疫细胞化学显示神经球表达神经干细胞标志物巢蛋白,经过胎牛血清诱导后,神经干细胞可以分化为神经元,神经胶质细胞和少突胶质细胞,其中神经胶质细胞的分化比例最高。在第二部分中我们将神经干细胞与胶原凝胶进行叁维培养构建神经干细胞叁维培养模型,结果显示神经干细胞与胶原凝胶具有良好的生物相容性,胶原凝胶叁维支架中的神经干细胞可以快速增殖并形成神经克隆球,这些神经克隆球可以被传代并且重新在悬浮培养体系中形成传统的神经球。胶原凝胶中的神经克隆球表达神经干细胞的特异性标志物巢蛋白,并且可以分化形成神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞。与悬浮培养的神经球相比,早期叁维培养中形成的神经克隆球其分化为神经元的潜能更高,且叁维培养中神经球突起长度明显长于贴壁分化组中神经球的长度。在第叁部分中我们首先构建控释细胞因子的胶原凝胶支架,利用ELISA方法检测生物支架中细胞因子的释放曲线,结果显示胶原凝胶是良好的细胞因子控释载体支架,细胞因子在体外释放可达10天,控释细胞因子的胶原凝胶支架与神经干细胞共培养后,并分为共分为四组:A:复合BDNF-NT-3胶原凝胶组(实验组);B:复合BDNF胶原凝胶组(对照组);C:复合NT-3胶原凝胶组(实验组)D:胶原凝胶组(对照组)。利用CCK-8检测各培养组中的细胞活性,结果显示复合BDNF-NT-3胶原凝胶组中细胞活力要高于其他实验组,其中胶原凝胶组的细胞活力最低。随机选取各组20个神经球,同时利用DP71图像处理软件计算各组神经轴突的长度,结果显示复合BDNF-NT-3胶原凝胶组中神经突起的长度要长于其他各组。各组神经干细胞培养一周后,用1%的FBS诱导分化,结果显示各组神经干细胞均可分化为神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞,复合BDNF-NT-3胶原凝胶组分化的神经元比例最高,其中在复合BDNF-NT-3胶原凝胶组和复合BDNF胶原凝胶组中神经干细胞分化比例的顺序为神经元>神经胶质细胞>少突胶质细胞,在复合NT-3胶原凝胶组和胶原凝胶组中神经干细胞分化比例的顺序为神经胶质细胞>神经元>少突胶质细胞。综上所述,在无血清含有生长因子的培养条件下,利用神经球方法可以分离培养出胎鼠皮质神经干细胞,神经干细胞具有增殖和多向分化的能力。胶原凝胶与神经干细胞具有良好的生物相容性,可以提供神经干细胞生长所需要的叁维环境,作为细胞因子控释的载体,不仅可以保护细胞因子的生物活性,还可以促进神经干细胞轴突生长和向神经元方向分化,多个细胞因子联合应用,其作用更为有效。
万凤[3]2017年在《基于干细胞巢调控的人参皂苷对缺血/再灌注神经干细胞增殖、分化的作用及其机制》文中研究表明目的研究人参皂苷通过作用于神经干细胞巢(NSCs niche)内的神经干细胞(NSCs)、星形胶质细胞(AC)和脑微血管内皮细胞(EC),对缺血/再灌注(OGD/R)后的NSCs增殖、分化的影响以及HIF-1α-VEGF信号通路的调节机制。方法1孕15-17d的SD大鼠,体外分离培养胎鼠海马NSCs,采用免疫荧光染色法对NSCs特异性标志物Nestin进行鉴定,NSCs增殖标记物BrdU进行增殖鉴定,神经元祖细胞特异性标记物Tuj-1及星形胶质细胞的祖细胞特异性标记物Vimentin对NSCs进行分化鉴定。新生1-3d SD大鼠,体外分离培养星形胶质细胞,采用免疫荧光染色法对星形胶质细胞的特异性标志物GFAP进行鉴定。新生1-3d SD大鼠,体外分离培养脑微血管内皮细胞,采用免疫荧光染色法对脑微血管内皮细胞的特异性标志物Factor Ⅷ进行鉴定。2 MTS法测定人参皂苷促进NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量及最佳给药时间点。3携带GFP基因的慢病毒转染NSCs,观察GPF的阳性表达率来确定NSCs的转染率,筛选出慢病毒转染NSCs的最佳转染指数MOI值及最佳转染时间。按照课题组先前的造模方法,采用氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型模拟脑缺血/再灌注损伤,以缺氧缺糖4h为NSCs损伤的最高时间点。Western Blot检测慢病毒转染后NSCs核内HIF-1α蛋白表达,观察转染后HIF-1α蛋白表达情况,并计算出HIF-1α蛋白沉默率;免疫荧光及细胞核染色检测HIF-1α基因在NSCs的表达位置情况;免疫荧光染色法对转染后NSCs进行鉴定,并且检测转染后NSCs的增殖、分化情况。4实验分为6组,设立NSCs正常组、NSCs模型组、NSCs人参皂苷组(1.OOμg/ml)、慢病毒转染的NSCs(LV-NSCs)正常组、LV-NSCs模型组、LV-NSCs人参皂苷组(1.OOμg/mL),OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h叁个时间点,分别收集处理NSCs和培养液,免疫荧光染色技术分析NSCs的增殖、分化情况,Western Blot分析NSCs核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测培养液VEGF含量。5采用Transwell共培养装置,将NSCs、LV-NSCs分别与星形胶质细胞共培养,实验分为6组,设立NSCs/AC正常组、NSCs/AC模型组、NSCs/AC人参皂苷组(12.50μg/mL)、LV-NSCs/AC 正常组、LV-NSCs/AC 模型组、LV-NSCs/AC 人参皂苷组(12.50μg/mL),采用OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h叁个时间点,分别收集处理NSCs、星形胶质细胞和共培养液,MTS检测各组NSCs存活率,免疫荧光双标染色分析NSCs的增殖和分化情况,Western Blot分析星形胶质细胞核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测共培养液VEGF含量。6采用Transwell共培养装置,将NSCs、LV-NSCs分别与脑微血管内皮细胞共培养,实验分为6组,设立NSCs/EC正常组、NSCs/EC模型组、NSCs/EC人参皂苷组(12.50μg/mL)、LV-NSCs/EC 正常组、LV-NSCs/EC 模型组、LV-NSCs/EC 人参皂苷组(12.50μg/mL),采用OGD/R模型模拟脑缺血/再灌注损伤,于OGD模型4h后分别复氧2h、4h和6h叁个时间点,分别收集处理NSCs、脑微血管内皮细胞和共培养液,MTS检测各组NSCs存活率,免疫荧光双标染色分析NSCs的增殖和分化情况,Western Blot分析脑微血管内皮细胞核内HIF-1α蛋白表达情况,ELISA检测共培养液VEGF含量。结果1 胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞的分离培养和鉴定体外成功分离培养胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞,经鉴定,其纯度达95%以上。2人参皂苷促进NSCs、胎鼠海马NSCs、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量和最佳给药时间点①人参皂苷促进NSCs增殖的最佳剂量为1.00μg/mL,促进NSCs增殖的最佳给药时间点为24h。②人参皂苷促进星形胶质细胞增殖的最佳剂量为12.50μg/mL,促进星形胶质细胞增殖的最佳给药时间点为72h。③人参皂苷促进脑微血管内皮细胞增殖的最佳剂量为12.50μg/mL,促进脑微血管内皮细胞增殖的最佳给药时间点为24h。3慢病毒转染NSCs筛选最佳MOI值及最佳转染时间成功采用慢病毒转染NSCs,慢病毒转染NSCs的最佳MOI值为10,最佳转染时间为144h。与对照组相比,NSCs转染率为90.47%(P<0.01)。4 Western Blot检测OGD后慢病毒转染NSCs核内HIF-1α蛋白表达情况与NSCs正常组和转染阴性对照组相比,NSCs转染组HIF-1α蛋白表达显著降低(P<0.01)。经计算,HIF-1α 沉默率为 88.5%。5免疫荧光及细胞核染色检测OGD后HIF-1α在NSCs内的表达情况在缺氧条件下,NSCs正常组显示HIF-1α能够在NSCs核内表达;NSCs转染组显示GFP绿色荧光能够在细胞核内表达,并且HIF-1α不表达,表明慢病毒能够成功转染NSCs,并使HIF-1α表达沉默。6免疫荧光染色鉴定慢病毒转染NSCs后的Nestin及NSCs增殖、分化情况慢病毒转染后的NSCs均表达Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin阳性,慢病毒转染后的NSCs仍能够增殖,并且分化为神经元的祖细胞和星形胶质细胞的祖细胞,但其增殖、分化能力明显降低。7免疫荧光染色技术检测OGD后NSCs增殖和分化情况①NSCs各组:NSCs正常组、NSCs模型组和NSCs人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1及Vimentin阳性表达;复氧2h、4h和6h,与NSCs正常组相比,NSCs模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs模型组比较,NSCs人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组、LV-NSCs模型组和LV-NSCs人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1及Vimentin阳性表达;复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs模型组比较,LV-NSCs人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数少量增加,差异无统计学意义。8 Western Blot检测OGD后各组NSCs核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs各组:NSCs正常组细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs正常组相比,NSCs模型组HIF-1α蛋白含量增多(P<0.01);与NSCs模型组相比,NSCs人参皂苷组HIF-1α蛋白含量增多(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组细胞核中的HIF-1α蛋白少量表达或几乎不表达;与LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组HIF-1α蛋白表达少量增加或不增加,差异无统计学意义;与LV-NSCs模型组相比,LV-NSCs人参皂苷组HIF-1α蛋白表达少量增加或不增加,差异无统计学意义。③与NSCs人参皂苷组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞核中的HIF-1α蛋白表达明显减少(P<0.01)。9 ELISA检测OGD后各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs各组:NSCs正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs正常组相比,NSCs模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.01);与NSCs模型组相比,NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.01)。②LV-NSCs各组:LV-NSCs正常组细胞培养液中VEGF含量很低;与N LV-NSCs正常组相比,LV-NSCs模型组细胞培养液中VEGF含量少量增加或几乎不增加,差异无统计学意义;与LV-NSCs模型组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量少量增加或几乎不增加,差异无统计学意义。③与NSCs人参皂苷组相比,LV-NSCs人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显减少(P<0.01)。10 MTS检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组NSCs存活率①NSCs/AC各组:分别复氧2h、4h和6h,与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与NSCs/AC模型组比较,NSCs/AC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。②LV-NSCs/AC各组:分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与LV-NSCs/AC模型组比较,LV-NSCs/AC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。11免疫荧光双标染色检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的NSCs增殖、分化情况①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组、NSCs/AC模型组和NSCs/AC人参皂苷组均有 Nestin、BrdU、Tuj-1 及 Vimentin 阳性表达;复氧 2h、4h 和 6h,与 NSCs/AC 正常组相比,NSCs/AC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs/AC模型组比较,NSCs/AC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs/AC 各组:LV-NSCs/AC 正常组、LV-NSCs/AC 模型组和 LV-NSCs/AC 人参皂苷组均有 Nestin、BrdU、Tuj-1 及 Vimentin 阳性表达;复氧 2h、4h 和 6h,与 LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs/AC模型组比较,LV-NSCs/AC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。12 Western Blot检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组星形胶质细胞核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组星形胶质细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.01);与NSCs/AC模型组相比,NSCs/AC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.01)。②LV-NSCs/AC:LV-NSCs/AC正常组星形胶质细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.01);与LV-NSCs/AC模型组相比,LV-NSCs/AC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.01)。13 ELISA检测NSCs与星形胶质细胞共培养OGD后的各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs/AC各组:NSCs/AC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs/AC正常组相比,NSCs/AC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05);与NSCs/AC模型组相比,NSCs/AC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/AC各组:LV-NSCs/AC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与LV-NSCs/AC正常组相比,LV-NSCs/AC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05);与LV-NSCs/AC模型组相比,LV-NSCs/AC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。14 MTS检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组NSCs存活率①NSCs/EC各组:分别复氧2h、4h和6h,与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与NSCs/EC模型组比较,NSCs/EC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。②LV-NSCs/EC各组:分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组细胞存活率均减少(P<0.05);与LV-NSCs/EC模型组比较,LV-NSCs/EC人参皂苷组细胞存活率均增加(P<0.05)。15免疫荧光双标染色检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的NSCs增殖、分化情况①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组、NSCs/EC模型组和NSCs/EC人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin 阳性表达;分别复氧 2h、4h 和 6h,与 NSCs/EC 正常组相比,NSCs/EC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与NSCs/EC模型组比较,NSCs/EC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:正常组、模型组和人参皂苷组均有Nestin、BrdU、Tuj-1、Vimentin阳性表达;分别复氧2h、4h和6h,与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组的面密度、光密度、阳性细胞数均减少(P<0.01);与LV-NSCs/EC模型组比较,LV-NSCs/EC人参皂苷组的面密度、光密度、阳性细胞数均增加(P<0.01)。16 Western Blot检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组脑微血管内皮细胞核中HIF-1α蛋白的表达①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组脑微血管内皮细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.05,P<0.01);与NSCs/EC模型组相比,NSCs/EC人参皂苷组HIF-1α蛋白表达明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:LV-NSCs/EC正常组脑微血管内皮细胞核中的HIF-1α蛋白表达较少;与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组HIF-1α蛋白表达增多(P<0.05,P<0.01);与 LV-NSCs/EC 模型组相比,LV-NSCs/EC 人参皂苷组 HIF-1α 蛋白表达明显增多(P<0.05,P<0.01)。17 ELISA检测NSCs与脑微血管内皮细胞共培养OGD后的各组细胞培养上清液中VEGF的含量①NSCs/EC各组:NSCs/EC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与NSCs/EC正常组相比,NSCs/EC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05,P<0.01);与NSCs/EC模型组相比,NSCs/EC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。②LV-NSCs/EC各组:LV-NSCs/EC正常组细胞培养液中VEGF含量较少;与LV-NSCs/EC正常组相比,LV-NSCs/EC模型组细胞培养液中VEGF含量增多(P<0.05,P<0.01);与LV-NSCs/EC模型组相比,LV-NSCs/EC人参皂苷组细胞培养液中VEGF含量明显增多(P<0.05,P<0.01)。结论人参皂苷通过调节NSCs niche内的NSCs、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞,通过调控HIF-1α-VEGF信号通路,以自分泌和旁分泌的共同方式,促进缺血/再灌注后NSCs增殖,并且诱导NSCs分化为神经元和星形胶质细胞的祖细胞。
杨电明[4]2013年在《邻苯二甲酸酯对小鼠神经干细胞和骨髓干细胞的毒性研究》文中研究指明塑化剂又称增塑剂,是一种添加到高分子聚合物中用以增加材料柔软性或是使材料液化的一类添加剂,其中应用最为广泛的塑化剂是邻苯二甲酸酯类。邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters, PAEs)又称为酞酸酯,是一类结构相似且使用广泛的化学物质,在塑料制品中含量很高,因为它不与所添加进的物质形成的化学键不紧密,故容易释放到水、土壤、空气等环境中。PAEs的生物相容性较高,易污染环境,对生物造成毒害作用,研究发现塑化剂对人和动物的机体产生致癌、致畸、致突变作用,还会对动物的生殖系统产生毒害,影响动物的生殖发育。邻苯二甲酸二丁酯(di-butyl phthalate, DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate, DEP)和邻苯二甲酸二乙基己酯(diethylhexyl phthalate, DEHP)都属于邻苯二甲酸酯类中最常用的种类,有关其对人和动物在体外培养的细胞水平的影响研究非常少。本研究通过观察和检测不同浓度的邻苯二甲酸酯对昆明小白鼠神经干细胞和骨髓干细胞的影响,从细胞水平上揭示邻苯二甲酸酯对人和动物的影响,在干细胞水平上对邻苯二甲酸酯类增塑剂的毒性进行评估,为环境研究及医学研究提供参考。本研究取得的结果如下：1、以怀孕第15-16天的胎鼠脑细胞为实验材料,进行原代培养,两代以上细胞传代后即培养分离形成的神经干细胞用于实验。将用于传代的神经球,机械法分离形成单个细胞,按1×105/mL在48孔培养板中培养,其中一组按不同浓度的DEHP (10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L)进行处理作为实验组,另一组的培养液中不加塑化剂作为对照组。对实验组和对照组的细胞增殖,凋亡及神经球的再形成能力进行观察和统计。并对两个组的过氧化氢酶(CAT)的活性进行检测。发现DEHP处理神经干细胞后,对神经干细胞的生长产生抑制作用,随着DEHP浓度升高和作用时间的延长,神经干细胞的增值和神经球的在形成能力与对照组相比差异很显着。主要表现在增值现象明显减少,神经球的形成不明显或形成后有明显的细胞死亡和退化现象。特别是在高浓度DEHP的作用下,细胞数明显减少,很少形成像对照组那样的正常神经球,且细胞很快退化并大量死亡,到96h时只剩下很少的细胞存在,相比而言,10-6mol/L实验组对神经细胞的影响较小,可以像对照组那样再形成神经球,但出现不同程度的细胞退化和死亡,细胞的增值能力明显减弱,所形成的神经球的体积变小。Giemsa染色后发现在DEHP作用下,实验组细胞的细胞核浓缩变小且随时间的延长细胞染色逐渐变浅。死亡细胞和胞体较暗的细胞越来越多,活细胞数目变小；检测加药培养48h时各组细胞中CAT活力,与对照组相比,DEHP实验组中CAT的活力均明显下降并呈现明显浓度依赖性。这说明DEHP对神经干细胞有明显的毒性作用。2、用一月龄的小鼠骨髓为实验材料,进行原代培养,传代两次后即培养分离形成的骨髓干细胞用于实验。机械法分离形成单个细胞,按1×105/mL在48孔培养板中培养,加入不同浓度的DBP、DEHP和DEP(分别以10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L)对细胞进行培养处理,作为实验组。不加塑化剂的一组培养孔作为对照组。对对照组和实验组培养孔的细胞的增殖和凋亡等现象进行观察和统计。发现叁种PAEs处理骨髓干细胞后,对骨髓干细胞的生长产生明显的抑制作用,随着PAEs的浓度升高和作用时间的延长,骨髓干细胞的增值能力与对照组相比差异很显着。主要表现在增值现象明显减少,细胞集落形成不明显或形成后有明显的细胞死亡和退化现象。特别是在高浓度PAEs的作用下,细胞数明显减少,很少形成像对照组那样的正常细胞增殖,且细胞很快退化并大量死亡,到96h时只剩下很少的细胞存在,相比而言,10'6mol/L的PAEs实验组对骨髓细胞的影响较小,但也出现了不同程度的细胞退化和死亡,细胞的增值能力明显减弱,所形成的细胞集落的体积明显变小,数量明显变少。随着PAEs浓度的增加和作用时间的延长,这些细胞边界模糊,折光率较差,胞体很小,胞质固缩,凋亡小体很明显。高浓度组中,处理时间达到一定程度时,骨髓干细胞胞核出现破裂,细胞开始崩解死亡。通过比较观察发现叁种不同的PAEs处理,DBP的毒性最强,DEHP的毒性较强,而DEP的毒性相对较弱。叁种PAEs都对骨髓干细胞都产生明显的损伤,细胞增殖受到明显影响,细胞凋亡现象严重,证明塑化剂对骨髓干细胞也有很显着的毒性作用。3、本研究在细胞水平对邻苯二甲酸酯类塑化剂中的DBP(邻苯二甲酸二丁酯)、DEHP (邻苯二甲酸二乙基己酯)和DEP(邻苯二甲酸二乙酯)的毒性作用进行了较系统的研究,证明DBP、DEHP和DEP对神经干细胞及骨髓干细胞有很强的毒性作用,从细胞水平揭示了塑化剂的毒性作用表现,为环境研究和医学研究提供重要实验依据和理论参考,也为环保宣传及大众的环保意识的提高提供重要证据和警示,对人类健康及野生动物的保护具有重要的意义。
谭国鹤[5]2007年在《锰中毒对小鼠脑内神经发生的影响及神经干细胞移植对其治疗作用的研究》文中指出为了进一步探讨锰的神经毒理学机制,本研究着重探讨神经发生在锰中毒神经病变过程中的作用,首次发现了锰对脑内神经发生的影响,并用神经干细胞移植的方法来治疗锰中毒并取得了良好疗效,为临床服务提供了实验依据。实验分为以下两部分:第一部分:锰中毒对小鼠脑内神经发生的影响及与其神经行为障碍的关系研究目的:探讨锰中毒对小鼠神经行为和脑内神经发生的影响。材料与方法:2周龄雄性昆明小鼠28只,分4组,每组7只,分别以0、5、20、50mg/(kg·d)剂量强度的氯化锰进行腹腔注射造成对照、低、中、高剂量染锰组,时间为2周。从染毒第7天开始用Morris水迷宫对小鼠进行学习记忆测试,用自主活动箱和旷场试验测试其精神行为。小鼠脑内神经干细胞的分裂增殖以腹腔注射BrdU来标记,灌注处死后用免疫组化方法分别检测SGZ和SVZ的BrdU阳性细胞、Nestin阳性细胞的分布数量以及海马CA3区GFAP阳性细胞数量等情况。计量资料差异比较采用单因素方差分析。记忆成绩与BrdU阳性细胞数、染锰剂量之间分别进行线性相关分析。结果:1、与生理盐水对照组相比,从水迷宫测试第3天开始高剂量染锰组学习成绩出现显着性降低(F_(1,11)=12.404,P＜0.01)。至第5天各染锰组小鼠平均逃避潜伏期均延长,学习能力显着降低(F_(3,21)=3.105,P＜0.05),其中以高剂量组最为明显(F_(1,11)=3.832,P＜0.01)。在空间探索试验中,与对照组相比,中、高剂量染锰组穿环次数均呈明显减少(P＜0.01)。在自主活动箱实验中各组小鼠未见显着性差异(P＞0.05);旷场试验只见高剂量组小鼠与对照组相比兴奋性提高(P＜0.01)。2、染锰各组小鼠SGZ和SVZ的BrdU阳性细胞数量均比对照组明显降低(P＜0.01),且随剂量加大而减少,细胞数量均与染毒剂量呈负相关。3、相比对照组,中等剂量染锰组鼠脑SGZ和SVZ外侧角的Nestin阳性细胞数目显着性减少(P＜0.001)。4、与对照组相比,高剂量组的GFAP阳性细胞数目显着性减少(p＜0.05),其他组未见异常;各组小鼠海马、隔区、杏仁核神经元未见显着性变化。5、记忆能力与染锰剂量呈负相关(r_s=-0.598,P＜0.01),空间记忆能力的减退和SGZ的BrdU阳性细胞数量的减少之间呈正相关(r_s=0.734,P＜0.01)。小结:锰中毒对小鼠脑内的神经发生具有毒性作用,能减少神经干细胞的数量和增殖程度,同时对认知功能产生了不良影响并随剂量增高而加重。神经发生与小鼠的学习记忆能力之间具有正相关性,说明抑制脑内的神经发生能力是引起锰致脑功能障碍的重要因素,这可能是锰中毒神经系统发病的机理之一。第二部分:神经干细胞脑内移植对锰中毒的治疗作用研究目的:观察海马内、侧脑室内移植神经干细胞对锰中毒模型小鼠神经行为障碍的改善作用和NSCs在脑内的存活、迁移、分化情况。材料与方法:选用新生昆明小鼠20只,分离海马NSCs,采用悬浮培养法,用含有b27、bFGF、EGF的DMEM/F12无血清培养液进行体外培养,7天后传代,进行免疫组化鉴定,进行BrdU标记后以PBS代替培养基制作单细胞悬液供移植。48只2周龄小鼠分为6组,即生理盐水对照组、锰中毒组、锰中毒后侧脑室/海马移植NSCs组、锰中毒后侧脑室/海马假移植组,锰中毒小鼠以20mg/(kg·d)剂量染锰14天进行造模,然后分别行海马内和侧脑室内双侧对称移植NSCs,假移植组只注入等量PBS,正常组和锰中毒组不施以移植术。休息1周后用Morris水迷宫测试小鼠的学习记忆能力,然后运用BrdU+Nestin双标、BrdU+GFAP双标、BrdU+NF双标、BrdU+NSE双标等免疫组化技术检测移植的NSCs在宿主脑内的存活、迁移、分化情况。结果:1、原代和传代培养后的NSCs均能形成典型的克隆球,并经免疫细胞化学鉴定证实表达Nestin、BrdU阳性,具有干细胞的表达特性。2、锰中毒小鼠的学习、记忆能力与正常组小鼠相比明显降低(P＜0.05)。3、在侧脑室内移植NSCs治疗锰中毒的实验中:1)在水迷宫训练的第5天,侧脑室内移植NSCs组小鼠的平均逃避潜伏期缩短,与假移植组相比均具有显着性差异(P＜0.05)。在空间探索试验中,侧脑室内移植NSCs组的穿环次数与移植盐水组、锰中毒组相比均有显着升高(P＜0.05),而与正常组无显着性差异(P＞0.05)。2)BrdU免疫组化单标显示,移植入的NSCs沿着针道大量分布、存活,并迁移到侧脑室室管膜下层、海马、嗅球等部位存活,其中以侧脑室外侧角最为明显。部分迁移到外侧角和齿状回的NSCs显示Nestin阳性;而另一部分迁移到室管膜下层的NSCs则同时表现出GFAP特性。4、在海马内移植NSCs治疗锰中毒的实验中:1)海马移植NSCs组小鼠的平均逃避潜伏期从第2天开始与假移植组比较已缩短,其学习能力出现显着性增强(P＜0.05),至第5天差异更明显(P＜0.01);从第4天开始,移植NSCs组小鼠学习成绩相对锰中毒组明显增强(P＜0.05);而5天中与正常组小鼠的学习成绩无统计学差异(P＞0.05)。在空间探索试验中,海马移植NSCs组的记忆力相对假移植组显着增强(P＜0.01),与锰中毒组相比也有增强(P＜0.05),与正常组无显着性差异(P＞0.05)。2)BidU免疫组化单标显示,移植入的NSCs沿着针道大量分布、存活,在针道末端沿着齿状回颗粒下层在海马内迁移,还可迁移至嗅球僧帽层存活。存活于海马的部分NSCs显示Nestin阳性,其它的NSCs则表现出GFAP或NF阳性。小结:神经干细胞脑内移植可以提高锰中毒小鼠的学习记忆能力,并且以海马内移植效果更为明显。植入锰中毒模型小鼠侧脑室和海马内的新生小鼠海马NSCs,均能存活、迁移、分化,参与了锰中毒小鼠脑结构和功能的修复,说明神经发生能力的提高对锰中毒起到了重要的治疗作用。总结:锰中毒对脑内神经发生产生抑制作用并伴有神经功能障碍,神经发生与学习记忆能力也呈明显的正相关性,二者都与锰中毒存在着明显的剂量一效应相关性,而用神经干细胞移植来促进脑内神经发生,进行相关治疗,能有效改善神经行为症状,表明脑内神经发生能力的受损在锰中毒的神经病变过程中起到了重要作用,并提示干细胞替代治疗锰中毒具有较好的临床应用价值。
何频, 郭富强[6]2018年在《miR-124抑制Notch通路促进神经干细胞增殖与分化》文中研究指明背景:如何在体外快速而高效的获得大量高纯度神经细胞是目前国内外细胞移植治疗领域所面临的一个巨大挑战和难题。目的:探讨miR-124是否通过调控Notch通路对神经干细胞增殖与分化产生影响。方法:分离胎鼠神经干细胞,利用免疫荧光法进行鉴定,采用RT-qP CR法检测神经干细胞分化1,2,4,7d后miR-124表达情况,利用瞬时转染法分别过表达和干扰miR-124后,采用MTT法和免疫印迹法检测ki-67蛋白表达水平观察细胞增殖情况,采用RT-qPCR法和免疫印迹法检测β-tubulinⅢ表达水平观察细胞分化情况,采用RT-qPCR法检测Notch通路相关蛋白HES1,HEY2和CCND1的mR NA表达。结果与结论:(1)神经干细胞在向神经细胞分化过程中,miR-124的表达水平显着升高;(2)过表达miR-124不仅能够促进细胞增殖与分化,同时对Notch通路相关蛋白起到了抑制作用;(3)抑制miR-124表达起到了与上述相反的作用;(4)以上结果提示miR-124可能通过抑制Notch通路促进神经干细胞的增殖与分化。
龙海波[7]2013年在《大鼠损伤脊髓提取液对胚胎大鼠神经干细胞增殖能力及Notch1、Hes1表达的影响》文中指出目的：探讨损伤脊髓提取液对胚胎大鼠神经干细胞（Neural Stem Cell，NSC)增殖能力及Notch1、Hes1mRNA表达的影响。方法：分离15天胚胎SD大鼠大脑，在含生长因子的无血清培养基中进行原代培养后传代。取传至第五代的细胞，用免疫荧光染色法鉴定其BrdU、Nestin及被5%胎牛血清诱导分化后NF200、GFAP的表达。将15只健康成年SD雌性大鼠随机分为叁组，每组5只。瘫痪组按WD法制作SD大鼠T9平面完全性截瘫的脊髓损伤动物模型。假手术组在相同节段只行椎板开窗。正常组不行手术处理。制模后5天提取各组脊髓提取液。将经鉴定后的神经干细胞随机分为四组：A组空白对照组（NSC+PBS液），B组正常组（NSC+正常脊髓提取液），C组假手术组（NSC+假手术脊髓提取液）及D组瘫痪组（NSC+瘫痪脊髓提取液）。共同培养后1、2、3、4、5天，用MTT法检测各组NSC的增殖能力。共同培养后24、48小时后提取各组NSC的总RNA，用RT-PCR法检测NSC内Notch信号途径的关键基因Notch1与Hes1的表达水平。各项指标用x±s表示，采用SPSS11.5统计软件行单因素方差分析，P<0.05为有统计学意义。结果：胚胎大鼠大脑源性细胞在含生长因子的无血清培养基中能够大量增殖并形成悬浮的球状聚集物，并且能够连续传代。传至第5代的细胞的BrdU及Nestin免疫荧光染色均表现为阳性。5%胎牛血清诱导分化5d后表现为NF200、GFAP免疫荧光染色阳性。各组MTT值（OD）：共同培养1天：A组0.1317±0.0250，B组0.1424±0.0331，C组0.1487±0.0303，D组0.1939±0.1613；共同培养2天：A组0.1860±0.0187，B组0.1813±0.0324，C组0.1855±0.0311，D组0.2384±0.0353；共同培养3天：A组0.2378±0.0288，B组0.2452±0.0310，C组0.2276±0.0273，D组0.2911±0.3306；共同培养4天：A组0.2865±0.0238，B组0.2806±0.0337，C组0.2970±0.0197，D组0.3533±0.0274；共同培养5天：A组0.3224±0.0175，B组0.3094±0.0273，C组0.3149±0.0173，D组0.3831±0.0166。在各个时间点，D组的MTT值均显着高于A、B、C组（P<0.05），而A、B、C组之间均无明显差异（P>0.05）。各组Notch1、Hes1mRNA相对拷贝数：共同培养24h：A组0.994±0.024、0.923±0.036，B组0.988±0.032、0.976±0.034，C组0.934±0.053、0.916±0.062，D组1.150±0.036、1.235±0.103；共同培养48h：A组0.914±0.002、0.876±0.015，B组0.905±0.023、0.874±0.012，C组0.878±0.176、0.900±0.031，D组1.226±0.035、1.347±0.054。在各个时间点，D组的Notch1、Hes1mRNA的表达均显着高于A、B、C组（P<0.05），而A、B、C组之间均无明显差异（P>0.05）。D组48小时与24小时的Notch1、Hes1mRNA的表达无明显差异（P>0.05）。结论：（1）胚胎大鼠大脑源性细胞具有分裂、增殖更新及分化为多种类型神经细胞的潜能，同时还表达未分化的原始神经细胞表面标志物（Nestin阳性），符合神经干细胞的鉴定标准；（2）损伤脊髓提取液在体外能够促进神经干细胞增殖；（3）损伤脊髓提取液在体外能够上调神经干细胞Notch1和Hes1mRNA的表达水平；损伤脊髓提取液可能通过激活Notch信号通路参与对NSC的增殖的调控，主要是通过上调Notch1和Hes1的表达来实现的。
李苏[8]2007年在《新生大鼠神经干细胞定向分化为胆碱能神经元的实验研究》文中研究表明第一部分新生大鼠神经干细胞的分离、培养研究背景与目的神经干细胞(neural stem cell, NSC)是近年来神经科学领域的研究热点。NSC是具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,可分化为神经系统的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,在胚胎及成年哺乳类动物中广泛存在。NSC的分离培养是其基础和应用研究的前提,本部分目的在于获得新生大鼠NSCs,为深入研究其增殖分化奠定基础。方法从新生24h内大鼠端脑及中脑部位分离NSC,采用体外无血清悬浮培养,以获得能在体外长期生存的NSC;通过免疫细胞化学检测NSC标记物nestin表达及分化为神经元和胶质细胞的能力。结果获得的NSC能在体外长期生存,具有很强的增殖能力、自我更新能力,表达nestin,具有多向分化能力,能分化为神经元和胶质细胞。结论成功地从新生大鼠端脑和中脑中分离得到了能在体外长期培养的NSC,培养的NSC表达nestin,有自我更新、多向分化的特点,通过培养细胞大量扩增。第二部分ATRA、NGF诱导新生大鼠神经干细胞定向分化为胆碱能神经元的实验研究研究背景及目的神经干细胞为神经系统疾病细胞替代治疗提供了细胞来源,疾病的治疗需要大量特定表型和功能的神经细胞,因此,对NSC分化为某种特定表型的研究成为神经科学研究的焦点。阿尔茨海默病(AD)是一种以基底前脑胆碱能神经元的退变为主要病理特征的神经系统变性疾病,补充胆碱能神经元是治疗该疾病的一种策略。本部分的目的在于在体外环境下使NSC定向分化为胆碱能神经元,为深入研究NSC体外分化条件,探讨诱导分化机制,提高胆碱能神经元分化效能奠定细胞学基础。方法在第3代NSCs无血清培养体系中加入ATRA和/或NGF,分别对NSC克隆进行ATRA、NGF、ATRA联合NGF诱导分化,通过免疫细胞学方法检测胆碱能神经元标志物CHAT的表达,比较不同诱导因素对NSC定向分化为胆碱能神经元的作用。结果ATRA、NGF单独诱导均提高CHAT阳性细胞表达,与血清对照组比较有显着性差异(P<0.05),而ATRA联合NGF诱导组与单独应用NGF组比较不能显着提高CHAT阳性细胞率,二者无显着性差异(P>0.05)。结论ATRA和NGF均有诱导NSC向胆碱能神经元分化的作用,但两者并不存在协同诱导作用。
唐少锋[9]2003年在《胎鼠和人胚神经干细胞分离培养及鉴定的实验研究》文中研究指明脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）所致的完全性截瘫，至今尚无有效的治疗办法。SCI的修复和治疗研究，已经进行了半个多世纪，目前仍然是一个难以解决的世界性难题。研究表明：SCI后的功能恢复关键在于中枢神经再生。而中枢神经再生依赖于两个条件，即有存活的、具有生长潜能的神经元和能促进神经纤维再生的适宜微环境。神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的发现为SCI的修复和治疗研究带来了新的希望。与其它干细胞一样，NSCs具有分裂增殖和自我更新能力，在适宜条件下或给予适当的信号能够分化为各种神经细胞。NSCs的自身特点决定了它可以作为神经移植材料的理想来源和基因治疗的理想载体。与较早使用的成纤维细胞、雪旺氏细胞以及目前的另一研究热点--嗅球鞘细胞等其它替代材料相比，移植到损伤局部的NSCs不仅可以起到支架作用，还可以分化为神经元参与补充丢失的神经细胞，分化为少突胶质细胞使再生或脱髓鞘的轴突重新髓鞘化。必要时可进行移植前预分化或调整宿主微环境。如果与基因疗法相结合，把NSCs作为基因治疗的载体细胞，替代的同时表达和分泌特定的目的基因产物，如神经营养因子或轴突生长抑制因子抗体等，就可以提供一种合适的微环境，刺激轴突生长。NSCs的研究为SCI修复和治疗带来诱人的应用前景，而进行这些研究的前提和基础是NSCs的培养。为此本实验第一部分进行了胎鼠NSCs的分离培养，在证实其自我更新能力和多分化潜能的同时检测NSCs特异的Nestin表达以证明本实验分离得到了胎鼠NSCs。由于人和啮齿动物之间存在较大的种属差异，不可能将啮齿动物NSCs最终用于临床实验研究，因此借鉴培养胎鼠NSCs的经验，本实验第二部分进行了人胚NSCs的分离培养，并证实其具有自我更新能力和多分化潜能，依据干细胞的定性标准证明本实验从人胚神经组织分离的细胞群为NSCs。以期为NSCs的体内实验以及移植修复SCI的实验研究奠定基础。第一部分 胎鼠神经干细胞分离培养及鉴定的实验研究本实验从孕14～16天的胎鼠脑皮质分离细胞，接种于含有bFGF的无血清培养基培养并连续传代，通过倒置显微镜观察细胞形态和一般生长状态；利用透射电镜了解NSCs的超微结构和神经细胞球（neurosphere）的内部结构；采用免疫荧光细胞化学技术、RT-PCR和基因测序法共同检测NSCs标志物Nestin的表达；综合应用单细胞克隆实验、BrdU标记法、流式细胞仪和MTT比色法检测细胞的增殖情况及bFGF对其增殖能力的影<WP=9>响，推测bFGF的作用机制；诱导NSCs分化以证实其多向潜能性，同时设置对照组观察血清对分化表型的影响。实验结果显示：培养细胞以悬浮细胞球的形式生长，单个细胞的超微结构呈现典型的低分化特点，可见不对称分裂细胞，在细胞球内部，除少量凋亡样细胞外，相互间的细胞结构无显着区别；免疫荧光染色观察到细胞球内大量Nestin抗原阳性细胞，RT-PCR检测和基因测序更加确凿无疑地证明这些细胞表达Nestin；细胞克隆分析明确证实单个细胞可分裂增殖形成克隆细胞球；BrdU标记观测到细胞球中含有很多S期细胞及分裂增殖产生的新生细胞；流式细胞仪测定结果显示细胞传代后S期细胞比例及增殖指数（PI）增高；MTT比色法检测结果表明培养细胞具有很强的分裂增殖能力，添加bFGF的实验组干细胞增殖能力显着增强，与对照组相比具有显着差异（P<0.01）；这些细胞经诱导分化可生成中枢神经系统（central nervous svstem，CNS）中所有叁种主要的神经细胞：神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞；血清诱导分化产生的GFAP阳性细胞以类原浆性星形胶质细胞为主，而无血清诱导分化则以类纤维性星形胶质细胞为主。培养细胞经多次传代仍保持多潜能性。实验结果表明：本实验培养得到的细胞能够自我更新，具有多向分化潜能，并表达Nestin产物，证明就是NSCs；这些细胞具有很强的分裂增殖能力，单独使用bFGF即可在体外培养扩增，单个细胞具有形成克隆细胞球的能力；bFGF能够通过改变细胞周期促进NSCs分裂增殖；与对照组相比，血清可促进NSCs分化并影响分化细胞的表型，其机理还有待进一步研究。第二部分 人胚神经干细胞分离培养及鉴定的实验研究本实验从流产的12周龄新鲜人胚胎脑皮质取材，机械分离制成单细胞悬液，采用无血清培养技术，添加B27，首次协同应用bFGF、EGF和LIF培养原代细胞，然后由N2添加剂取代B27，结合bFGF和LIF维持细胞的生长增殖及传代培养。通过倒置显微镜观察细胞形态和一般生长状况；利用BrdU标记法检测细胞的增殖能力；胎牛血清诱导分化检测细胞的多分化潜能。实验结果显示：原代细胞接种2-3天后，开始形成球形细胞团，并逐渐增多、增大，培养一周余即得到许多悬浮生长的细胞球；这些细胞具有一定的分裂增殖能力，传代后可继续生长形成新的细胞球；与胎鼠脑皮质NSCs相比，这些细胞增殖速度较慢；BrdU标记结果显示，部分细胞呈BrdU抗原阳性；血清诱导分化可生成CNS中所有叁种主要的神经细胞：神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。实验结果表明：12周龄人胚脑皮质含有多潜能的NSCs；本实验协同应用bFGF、EGF和LIF原代培养得到的细胞在bFGF和LIF的协同作用下可连续传代，仍保持其多潜能性；这些
刘罡[10]2009年在《运动训练对脑缺血大鼠神经干细胞移植治疗的影响》文中认为第一部分神经干细胞的培养和鉴定目的:掌握神经干细胞培养技术,为进一步实验提供可供移植的神经干细胞。方法:孕12-14天SD大鼠胚胎数只,分离获得大脑皮层和海马区脑组织,机械吹打制成单细胞悬液;离心后用神经干细胞培养液重悬细胞,按照1×10~6个细胞/ml密度接种于培养瓶中;定期观察,每2-3天半定量换液一次,7-10天传代一次。取培养的细胞行神经干细胞特异性抗原Nestin鉴定、增殖活性鉴定及分化能力鉴定。结果:培养的神经干细胞聚集成细胞球以悬浮的方式生长,培养7-10天后细胞球形态致密,大小较均一,传代后仍然可得到大量的次代细胞球。培养细胞的Nestin及BrdU检测呈阳性,贴壁分化后可分化为β-Tublin或GFAP阳性细胞。结论:此部分实验培养的细胞具有自我复制更新的能力和多向分化的潜能,是符合移植实验要求的神经干细胞。第二部分神经干细胞体外分化抗原表达时程的研究目的:研究体外神经干细胞向神经元分化过程中标志性抗原的表达情况,为进一步研究神经干细胞体外增殖分化影响因素以及进行体内移植的研究奠定基础。方法:取12～14天胎鼠大脑皮层,体外培养神经干细胞;于第1次传代后第3天将培养的神经干细胞置于含有分化培养液的培养皿中进行分化;于不同的分化时间点(1、4、7、10和14天)采用免疫细胞化学方法检测Nestin、SOX2、DCX、TuJ1、NeuN各抗原的表达情况。结果:Nestin和SOX2在开始时表达量非常近似,几乎在所有的细胞两者都同时表达,随时间的推移,两者的表达量都逐渐减少,但SOX2的表达时间相对Nestin而言持续更长;DCX表达量在分化1周内较高且变化不大,随后开始下降,至分化14天时仅有少数细胞呈DCX阳性;TuJ1在分化7天时就已经有少部分表达,随后其表达量逐渐增多;分化14天时有38.27%的细胞表达TuJ1;在贴壁分化的一周内未见NeuN阳性细胞出现,但至分化14天时,已有NeuN阳性细胞占21.11%;在贴壁分化第1天时就有大量的GFAP阳性细胞,其表达量随分化时间延长而逐渐减少,但下降趋势较Nestin缓和,至分化14天时仍有大量的GFAP阳性细胞。结论:神经干细胞体外分化过程中抗原的表达是一个相互交错的过程,未分化状态标志性抗原表达的减少与分化状态标志性抗原表达的增加互相对应。第叁部分运动训练在缺血性脑梗死大鼠神经干细胞移植治疗中的作用目的:探讨运动训练对缺血性脑梗死大鼠神经干细胞移植后神经功能和缺血脑区超微结构改变的影响。方法:建立Sprague-Dawley大鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型为实验对象,随机分为脑缺血对照组(对照组)、电动跑台训练组(运动组)、神经干细胞移植组(移植组)、神经干细胞移植联合运动训练组(联合组),每组6或10只。术后第5天时将超顺磁氧化铁(super paramagnetic iron oxide,SPIO)标记的神经干细胞移植到缺血侧纹状体区。术后第6天开始,运动组和联合组大鼠给予定量的电动跑台运动训练,4周运动训练期间所有4组大鼠均进行定期的神经功能评估。运动4周后处死大鼠,透射电镜观察SPIO标记的神经干细胞在宿主脑内存活迁徙以及宿主脑区超微结构变化情况。结果:与对照组比较,运动组和联合组的神经功能评分在运动训练2周后,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);移植组差异无统计学意义(P＞0.05)。联合组可见SPIO标记的神经干细胞密度较大,迁徙也相对广泛,宿主缺血脑区超微结构优于其他各组。结论:运动训练可以促进神经干细胞移植对脑梗死大鼠的治疗作用,但其具体的机制还有待进一步研究。
参考文献：
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[5]. 锰中毒对小鼠脑内神经发生的影响及神经干细胞移植对其治疗作用的研究[D]. 谭国鹤. 广西医科大学. 2007
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[7]. 大鼠损伤脊髓提取液对胚胎大鼠神经干细胞增殖能力及Notch1、Hes1表达的影响[D]. 龙海波. 泸州医学院. 2013
[8]. 新生大鼠神经干细胞定向分化为胆碱能神经元的实验研究[D]. 李苏. 重庆医科大学. 2007
[9]. 胎鼠和人胚神经干细胞分离培养及鉴定的实验研究[D]. 唐少锋. 第叁军医大学. 2003
[10]. 运动训练对脑缺血大鼠神经干细胞移植治疗的影响[D]. 刘罡. 复旦大学. 2009
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