刘壮[1]2002年在《癌基因MDM2和抑癌基因P53的表达与儿童非何杰金淋巴瘤关系的研究》文中指出目的：探讨儿童非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)患者癌基因MDM2和抑癌基因p53的表达与NHL的恶性程度和预后的关系，为临床评估儿童NHL患者MDM2、p53的表达提供参考资料。方法：31例儿童NHL患者作为病例组，8例儿童淋巴结炎患者作为对照组。(1)用免疫组织化学超敏S-P染色法，检测病例组NHL患者、对照组淋巴结炎患者病理组织的MDM2蛋白和p53蛋白的表达情况，阳性细胞为胞核染成黄色～棕黄色，阳性细胞数≥10％为MDM2免疫组织化学阳性(MDM2蛋白过度表达)；阳性细胞数＞5％为p53免疫组织化学阳性(p53突变)。(2) 用逆转录-多聚酶链反应 (reverse transcription-polymerase chain rcaction，RT-PCR)法检测病例组和对照组病例的病理组织和外周血单个核细胞的MDM2 mRNA过度表达的情况，以MDM2／β-actin比值＞16％为MDM2mRNA过度表达(阳性)。结果：(1)病例组MDM2蛋白过度表达率为64.5％，MDM2RNA过度表达率为61.3％，与对照组比较均有非常显着差 异中＜0刀1入…3蛋白阳性率为16．1％，与对照组比较无显着差 异中 刀5人u）在病例组内进行相关分析，结果显示：①＊＊＊2 蛋白过度表达率与病理工作分类、细胞源性的免疫分类、性别、 临床分期、淋巴结外侵犯部位之间都没有显着关系巾＞0刀5人与 患者的B状态、血清LDH增高、IPI（国际NHL预后指标）高危 分类之间均有显着关系…＜0刀引。②＊＊＊Zm＊＊A过度表达率 与病理工作分类、免疫分类、性别、淋巴结外侵犯位点之间无显 着关系巾叩刀5）；与临床分期晚、B状态之间有显着关系中功刀5）； 与血清＊＊H增高＊N高危分类之间有非常显着的关系中＜0刀1人 ③ps 3蛋白阳性与病理工作分类、免疫分类＼临床分期、结外侵 犯部位多少、B状态、血清＊＊H、IN分类之间都没有显着关系 一叩刀5人④＊＊＊2蛋白过度表达率与＊＊＊Zm＊＊A过度表达 率之间 有非常显着的相关卜 （＜0刀互。即53蛋白阳性与＊＊MZ 蛋白过度表达及与 ＊＊＊Z ＊＊＊A 过度表达之间没有相关性 （p幻．05人结论：门）儿童 NHL患者 MDMZ基因的过度表达率 较高。【）免疫组织化学法检测儿童 NHL病理组织 MDMZ蛋白 的过度表达率与RTPCR法检测其病理组织、血液单个核细胞 mRNA过度表达率的结果基本一致，都可作为儿童NHL患者 MDMZ过度表达的检测方法。门）MDMZ过度表达与儿童NHL 患者的不良状况、不良预后有关。u）儿童 NHL患者 ps 3突变率 ，。
孙迎娟[2]2003年在《EBV相关胃癌与mdm2、p53及p21基因异常的研究》文中研究表明目的 探讨EBV相关胃癌(EBV associated gastric carcinoma，EBVaGC)、与之匹配的EBV阴性胃癌(EBV netative gastric carcinoma，EBVnGC)以及相应癌旁组织中p53基因突变以及mdm2、p53和p21蛋白表达，结合病人临床病理指标综合分析EBV感染、mdm2、p53和p21基因异常在胃癌发生发展中的作用。 方法 应用免疫组化技术检测13例EBVaGCs、45例临床指标与之匹配的EBVnGCs以及相应58例癌旁组织中mdm2、p53和p21蛋白的表达；PCR-SS-CP银染技术检测p53基因exon 5-8突变情况。 结果 ①EBVnGC p53蛋白阳性率为86.67％(39／45)，过表达率为57.28％(26／45)；EBVaGC p53蛋白阳性率为84.62％(11／13)，过表达率为15.38％(2／13)；两组间p53蛋白的阳性检出率无明显差异(P＝0.7912)，但EBVaGC组p53蛋白过表达率明显低于EBVnGC组，两组间有显着性差异(P＝0.0085)。②胃癌组p21蛋白阳性率为62.07％(36／58)，癌旁组织组p21蛋白阳性率为89.66％(52／58)，胃癌组p21蛋白阳性率明显低于癌旁组织组，两组间有极显着性差异(x~2＝12.5，P＝0.0004)。EBVnGC p21蛋白阳性率为57.78％(26／45)，EBVaGC p21蛋白阳性率为76.92％(10／13)，两组间p21蛋白的阳性检出率无明显差异(x~2＝0.8624，P＝0.3531)。③胃癌组mdm2蛋白阳性率为29.31％(17／58)，癌旁组织组mdm2蛋白均为阴性，胃癌组mdm2蛋白阳性率明显高于癌旁组织组，两组间有极显着性差异(x~2＝15.059，P＝0.0001)。EBVnGC mdm2蛋白阳性率为31.11％(14／45)，EBVaGC mdm2蛋白阳性率为23.08％(3／13)，两组间mdm2蛋白的阳性检出率无明显差异(x~2＝0.04609，P＝0.8300)。④mdm2蛋白阳性表达与p53蛋白过表达呈显着正相关(x~2＝11.1839，P＝0.0008，r＝0.4391)；p21与p53蛋白共同表达率较高，但经计数资料相关性统计学分析表明两者无显着相关性(x~2＝1.3228，P=0.2501，r＝0.2025)。⑤2例EBVnGCs检测到p53基因突变，突变均位于exon5，13例EBVaGCs和58例相应癌旁组织均未检测到p53基因突变。 结论 ①胃癌组织中mdm2和p53蛋白阳性表达率明显高于癌旁组织，而 中文摘要胃癌组织中p21蛋白的阳性表达率明显低于相应癌旁组织，提示mdmZ、p53和p21蛋白表达异常与胃痛发生有关。②胃癌组织中p53基因突变率较低，提示p53基因突变可能并非胃癌组织中p53蛋白异常累积的主要原因，还存在其他原因导致的p53蛋白的异常表达。③EBVaGC和EBVnGC组织中mdmZ及p21蛋白表达无明显差异，提示胃癌组织中EBV感染与mdmZ和pZI蛋白的异常表达无显着相关性。④p21与p53蛋白共同表达率较高，但统计学分析表明两者无显着相关性，提示胃癌组织中p53蛋白阳性表达为野生型和突变型p53蛋白的混合检测结果，p21蛋白表达存在p53依赖性和p53非依赖性两条途径。⑤与EBVnGC组织相比，EBVaGC组织中p53蛋白过表达率显着降低，pZI蛋白阳性率有增高趋势，但无显着性统计学意义，推测EBVaGC组织中主要表现为与EBV结合而稳定的野生型p53蛋白，可能EBV编码蛋白对p53转录等功能的影响导致p21蛋白表达异常。⑥mdmZ蛋白阳性表达与p53蛋白过表达呈显着正相关，提示mdmZ蛋白至少部分通过抑制野生型p53蛋白的抑癌功能而产生致癌作用，同时还存在p53非依赖性途径的mdmZ蛋白表达增高。
梁晶[3]2009年在《P73及P15在大肠癌组织中的表达及其意义》文中指出目的:研究p73、p15在大肠正常粘膜-腺瘤-癌序列中的表达规律及其与大肠癌发生、发展的关系;探讨p73、p15在大肠粘膜癌变发生、发展中的作用机制,为大肠肿瘤的早期临床诊断、治疗等方面提供参考依据。方法:随机收集四川省泸州医学院附属医院病理科2006年12月～2008年1月存档蜡块50例。其中大肠腺瘤组10例,大肠癌组30例;同时在大肠腺瘤组或大肠癌组中随机取距病变组织5cm以上的正常大肠粘膜组织共10例。采用免疫组化SP法,检测p73、p15在不同大肠粘膜组织中的表达情况。采用SPSS13.0 for windows软件统计分析,计数资料样本率之间的比较采用x2检验及精确概率法;相关性分析采用Spearman相关分析。结果:(1)p73在正常大肠粘膜-癌序列中的表达率呈逐步递增趋势,大肠正常粘膜阳性表达率10﹪(1?10),大肠腺瘤阳性表达率60﹪(6?10),大肠癌阳性表达率73.3﹪(22?30)。p73蛋白在大肠癌组中的表达率显着高于正常粘膜组(精确概率法,P=0.001),与大肠腺瘤组相比,无显着性差异(X2=0.635,P=0.426)。p73在大肠腺瘤组中的表达率与正常粘膜组相比,差异有显着性(X2 =5.495,P=0.01)。p73在大肠癌中的阳性表达率与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、组织学类型无明显关系(P >0.05);与不同侵袭深度,有、无淋巴结转移及分化程度有关(P <0.05)。其中高分化组与中分化组阳性表达率的比较(P <0.05),差异有统计学意义;高分化组与低分化组阳性表达率的比较(P <0.05),差异有统计学意义。(2)P15在正常大肠粘膜-癌序列中的表达率呈逐步递减趋势,阳性率分别为90﹪(9?10)、70﹪(7?10)、33.3﹪(10?30)。p15在大肠癌组中的表达率明显低于其他各组(p<0.05); p15在大肠腺瘤组中的表达率与正常粘膜组相比差异无显着性(精确概率法,P =0.582)。p15在大肠癌中的阳性表达率与大肠癌的组织分化程度有关(P<0.05),与其他临床病理因素无明显关系(P >0.05)。其中高分化组与中分化组阳性表达率的比较(P <0.05),差异有显着性;高分化组与低分化组阳性表达率的比较(P >0.05),差异无显着性;中分化组与低分化组阳性表达率的比较(P >0.05),差异无显着性。(3)p73与p15在大肠癌中表达的相关性分析显示:在30例结直肠癌中,p73、p15在结直肠癌组织中的表达同为阳性的有6例,占20.0﹪;p73、p15表达共同阴性的有4例,占13.3﹪;p73阴性而p15阳性的有4例,占13.3﹪;p73阳性而p15阴性的有16例,占53.3﹪。统计结果表明,p73、p15在结直肠癌组织中的表达无显着相关性(r=-0.253, P >0.01)。结论:(1)p73在大肠正常粘膜-腺瘤-癌组织中阳性率逐渐降低,p73蛋白在大肠癌组中的表达率显着高于其他各组,p73在大肠癌中的阳性表达率与不同侵袭深度,有、无淋巴结转移及分化程度有关。检测p73的表达可作为大肠癌早期诊断和治疗中的新的靶点,可作为大肠癌侵袭性判别和预后判断的生物学指标。(2)p15在正常大肠粘膜-腺瘤-癌序列中的表达率呈逐步递减趋势,p15在大肠癌组中的表达率明显低于其他各组,p15在大肠癌中的阳性表达率与大肠癌的组织分化程度有关,所以可以认为p15失表达为结直肠肿瘤发生的中晚期事件,提示p15基因的失活在结肠癌的发生、发展中具有重要意义。(3)p73、p15在结直肠癌组织中的表达无显着相关性,说明p73不像p15是抑癌基因的“完全卫士”,二者在结直肠肿瘤形成中的作用并不相同。P15具有抑制肿瘤生长的作用;结肠癌中p73基因及其产物具有促进肿瘤生长,而不是抑制肿瘤的作用,该基因的确切作用还有待进一步研究。
蒋力[4]2009年在《DNp73α及恩度~(?)介导特异性杀伤肿瘤内皮细胞效应的研究》文中研究指明背景和目的:肿瘤是极大危害人类健康的疾病之一,肿瘤的发生是多因素、多阶段、多步骤的复杂过程。分子生物学研究表明,肿瘤的发生与癌基因激活、抑癌基因失活密切相关,这些基因改变的结果最终导致肿瘤细胞生长的无限制性,所以单独针对某个基因的作用对于抑制肿瘤的发生和发展并无明显的治疗意义。肿瘤血管是肿瘤形成、生长及转移的基础,破坏少量的肿瘤血管即可导致大片区域的肿瘤细胞缺血坏死,因此特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞已成为肿瘤治疗的重要策略之一【1】。目前,肿瘤血管内皮靶向性杀伤的主要方法有两种:1.通过特异性作用于肿瘤血管内皮细胞的化学药物抑制肿瘤血管形成及生长;2.通过T细胞特异性杀伤来实现,这也是机体对肿瘤免疫的主要途经。内皮抑素(Endostatin,ES)是1997年Reilly等【2】从小鼠血管内皮瘤( EOMA)细胞培养液中提取的一种内源性血管生成抑制剂,为胶原ⅩⅧC末端水解片段,在小鼠体内对肿瘤诱导的血管生成具有几乎完全的抑制作用,并显示很强的抗肿瘤活性。研究表明,内皮抑素能特异性抑制血管内皮细胞增殖【3】,抑制内皮细胞的迁移,诱导内皮细胞凋亡和细胞周期阻滞【4-5】。反复使用内皮抑素不会使癌细胞产生抗药性,并且没有明显的毒副作用。美国食品药品管理局(FDA)于1999年底批准了由毕赤酵母表达的重组人内皮抑素作为肿瘤治疗药物进行I期临床试验;2001年又进行II期临床试验。然而,人重组内皮抑素半衰期短、复性及大量生产较为困难的特点限制了内皮抑素的临床应用。2005年,中国科学家在ES的基础上改变了其氨基酸序列,在ES母体上创造性的添加了9个氨基酸(MGGSHHHHH)使该蛋白的药用性能和疗效得到显着提高,该药即为恩度(Endostar)。恩度是一种新型的抗血管生成药物,相对于ES,不仅使稳定性提高、纯度明显增加、半衰期延长,而且生物活性增加【6】。但恩度对于肿瘤血管内皮细胞的作用效果及具体机制尚不十分清楚,恩度对肿瘤血管内皮细胞是否具有特异性的抑制作用,这一作用是如何发挥,都需要进一步深入细致的工作来研究探讨。在人体的免疫反应过程中,外来的抗原物质需经过处理并呈递给具有分泌细胞激素功能之辅助性T细胞,才能进一步活化以B细胞和T细胞为中心的体液免疫及细胞免疫反应。故有效激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL),是实现肿瘤主动免疫治疗的关键。人树突状细胞(Dendritic cell,DC)起源于造血干细胞(hemopoieticstemcell)。是机体功能最强的专职抗原呈递细胞(Antigen presenting cells, APC),它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原,能高水平的表达与抗原提呈有关的MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子,并可高水平的表达多种共刺激分子及某些粘附分子,所以,DC细胞可摄取肿瘤内皮特异性相关抗原,吞噬处理凋亡或坏死肿瘤细胞等颗粒性抗原,并具有“交叉提呈(cross-presentation)”外源性抗原的能力。通过DC对肿瘤内皮抗原的高效提呈作用,激发机体的特异性抗肿瘤免疫反应成为肿瘤免疫治疗的一个热门课题,而为DC疫苗寻找特异性的肿瘤抗原、探索最佳的加载途径成为目前研究的一大方向。DNp73α由p53家族的成员p73基因经位于第3内含子的启动子启动,经过不同于p73的方式剪切,所生成N’端缺失的蛋白。DNp73α在正常组织细胞及血管内皮中不表达,但在肺癌、乳腺癌、肾母细胞癌、宫颈癌以及成肝癌等肿瘤内皮细胞中高表达。并对野生型P53和P73产生竞争性抑制其作用,促进肿瘤血管内皮增生和毛细血管的形成。是肿瘤生物治疗潜在的分子靶点。但目前鲜有针对DNp73α靶点抗血管生物治疗的研究报道。在本研究中我们通过设计含有DNp73α全长cDNA的重组腺病毒,并将其转染修饰DC,进而诱导针对高表达DNp73α的肿瘤源性血管内皮细胞的特异CTL反应,同时探讨恩度对肿瘤血管内皮细胞是否具有特异性的抑制作用及相关的抗血管形成机制。为后续的动物及临床实验研究提供依据。研究方法:1.采用AdEasy系统构建携带HA标记含人全长DNp73αcDNA的复制缺陷型重组腺病毒Adv-DNp73α,即:从pcDNA3.0-DNp73α-HA中酶切出DNp73α基因,并定向克隆插入pDC315-EGFP Vector中构建成腺病毒穿梭质粒;pDC315-EGFP Vector-DNp73α经PmeI线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的E. coli BJ5183菌株内同源重组。筛选正确的重组质粒,PacI线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒;并在293T细胞中反复扩增。携带绿色荧光标记的Adv-EGFP作为实验对照。2.采用胰酶消化柱状离心法分离人脐静脉内皮获得HUVEC,并通过与A549上清共培养诱导生成TDEC细胞,通过MTT法、细胞迁徙实验、流式细胞仪等检测TDEC细胞生物学特性的改变。3.人脐带血经梯度离心法和细胞因子IL-4、GM-CSF诱导培养的树突状细胞。通过增强离心法使DNP73α重组腺病毒有效转染DC,并通过追踪绿色荧光蛋白的表达,检测不同感染复数(M.O.I.)的转染效率以及腺病毒转染对细胞的毒性,来确定合适的感染复数;3.用RT-PCR和Western Blot检测Adv-DNp73α转染48小时后DC胞内DNp73α的mRNA和蛋白表达;4.采用尼龙毛柱法分离纯化同源T细胞。纯化的T细胞在96孔板中与经丝裂霉素C预处理的各种DC共培养5天。结束培养前8小时加入1μCi/孔的3H胸腺嘧啶脱氧核苷。5.RT-PCR对比分析TDEC/DNp73α细胞、TDEC细胞和HUVEC细胞中DNp73αmRNA的表达水平;并检测不同效应细胞(细胞毒性T淋巴细胞CTL、普通T细胞以及淋巴因子活化的杀伤细胞LAK)针对不同DNp73α靶细胞(TDEC/DNp73α细胞、TDEC细胞和HUVEC细胞)的杀伤效应。6.采用人肺腺癌细胞A549培养上清作为条件培养基诱导培养人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC),并鉴定条件培养基诱导培养后的细胞(Tumor-derived Endothelial Cells,TDEC)是否具有肿瘤血管内皮细胞的特性。7.利用TDEC作为研究模型,检测恩度对HUVEC和TDEC细胞生物学特性影响的差异;建立裸鼠移植瘤模型,观察恩度的治疗效应并分析其机制。8.统计分析:数据采用x±SD表示;对于正态分布数据,组间比较采用t检验。非正态分布数据采用秩和检验分析。p<0.05认为有显着统计学差异,p<0.01认为差异非常显着。所有数据采用统计学软件SPSS10.0分析。结果:1.采用定向克隆以及同源重组在293T细胞内产生了具有转染能力的腺病毒颗粒;通过反复感染,获得较高滴度腺病毒液;2.分离人脐静脉内皮获得HUVEC,并通过与A549上清共培养诱导生成TDEC细胞,证实TdEC有较强的细胞迁徙能力,增殖活跃,S期、G2-M细胞比例远大于HUVEC细胞,并特异性的表达肿瘤内皮相关抗原TEM1/TEM8。3.人肺腺癌细胞A549培养上清作为条件培养基能诱导HUVEC衍生为具有肿瘤血管内皮细胞特性的TDEC。4.较低浓度的恩度对HUVEC没有明显的抑制作用,而对TDEC则具有显着的生长抑制作用,该抑制作用具有时间和浓度依赖性。同时,较低浓度的恩度能显着降低TDEC细胞迁徙活性,诱导细胞凋亡及阻滞TDEC细胞于G0/S期,但对于HUVEC的作用并不显着。在体研究中,瘤内注射一定浓度的恩度能抑制移植瘤生长,其机制可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡,升高肿瘤内Ca2+浓度,抑制肿瘤内新生血管的形成。5.从人脐静脉血中培养出DC,采用M.O.I 200的病毒液转染48小时后,DC的转染效率达到80%以上,并且细胞具有较高活力。6.DNp73α特异性CTL能有效裂解TDEC/DNp73α细胞、少量裂解TDEC细胞;而HUVEC细胞几乎不裂解。同时这种特异性CTL杀伤TDEC/DNp73α细胞的水平高于TDEC及HUVEC细胞。而对比研究DNp73α特异的CTL、LAK和正常T细胞分别针对TDEC/DNp73α细胞、TDEC细胞和HUVEC细胞的杀伤作用,发现DNp73α特异性的CTL针对TDEC/DNp73α细胞杀伤效应接近高于LAK的能力;LAK同样可以有效的杀伤TDEC细胞。结论:HUVEC可以通过与A549细胞上清共培养诱导生成TDEC,生成的TDEC具有肿瘤源性血管内皮细胞相关特性,其迁徙增殖能力显着强于HUVEC,可以作为体外抗肿瘤血管内皮效应研究的模型。恩度可以抑制肿瘤血管内皮细胞的生长和肿瘤血管的形成而不损伤正常的血管内皮细胞,因此这种抑制作用是具有肿瘤特异性的,在肿瘤的临床治疗中具有疗效好、副作用小的特点,有着理想的临床应用前景。。DNp73α2.2修饰的DC,可以诱导生成DNp73α特异性CTL,有效裂解DNp73α高表达的TDEC/DNp73α细胞。
参考文献：
[1]. 癌基因MDM2和抑癌基因P53的表达与儿童非何杰金淋巴瘤关系的研究[D]. 刘壮. 广西医科大学. 2002
[2]. EBV相关胃癌与mdm2、p53及p21基因异常的研究[D]. 孙迎娟. 青岛大学. 2003
[3]. P73及P15在大肠癌组织中的表达及其意义[D]. 梁晶. 泸州医学院. 2009
[4]. DNp73α及恩度~(?)介导特异性杀伤肿瘤内皮细胞效应的研究[D]. 蒋力. 第叁军医大学. 2009
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