韩庆典[1]2008年在《水稻细菌性条斑病抗性QTL qBlsr5a的精细定位及候选基因的表达分析》文中指出水稻细菌性条斑病(Xanthomonas campestris pv.Oryzicola),简称水稻细条病,是水稻上一种重要的检疫性细菌病害。该病主要危害水稻叶片,水稻受侵染后,叶片变黄甚至枯死,空秕粒增多,千粒重降低,一般可减产10%～20%,严重时达40%。目前,细条病已成为南方稻区的主要病害,成为影响水稻产量及品质的重要限制因子。相对于水稻另两大病害(白叶枯病和稻瘟病),水稻对细条病的抗性属于典型的数量性状,不存在主基因抗性,现有种质资源中也未发现对该病表现免疫的品种。因此,深入挖掘现有资源中的数量抗性基因座(Quantitative resistance locus,QRL),不仅具有重要的实践应用价值,而且可以对数量抗病性的机制研究提供帮助。目前,在水稻中已报道13个细条病抗性QTL,其中Tang等以高抗细条病品种Acc8558和高感细条病品种H359为亲本构建的重组自交系群体,定位了11个细条病抗性QTL,其中位于5号染色体短臂上的QTL qBlsr5a(其抗病等位基因来自抗病亲本Acc8558)对表型变异贡献率最大,并在后续研究中得到了证实。这说明qBlsr5a在水稻细条病抗性的遗传改良上具有较大的应用前景。本研究在前人工作的基础上,对qBlsr5a进行更深入的研究。分别以Acc8558和H359为供体亲本和受体亲本,通过回交和分子标记辅助选择,育成了只渗入供体5号染色体短臂含抗性QTL qBlsr5a的区段的近等基因系H359-BLSR5a。进一步将该近等基因系与H359杂交,建立了一个大的F2群体(2,265单株)。采用选择极端表型个体并验证其后代(F_(2:3))株系的方法,在F_2群体中鉴定出目标QTL为抗病纯合基因型的个体。通过对这些个体进行分子标记基因型检测和连锁分析,将qBlsr5a定位在SSR标记RMl53和RM159之间,大约2.4 cM或290 kb的范围内。利用Affymetrix的基因芯片对抗病品种Acc8558和感病品种H359中受细条病菌侵染调控的基因进行高通量的检测。在两品种中共检测到956个差异表达基因,其中12个基因在两品种中一致上调,54个基因在两品种中一致下调,20个基因在两品种中表达变化方向相反。对差异表达基因的基因本性(GO)、代谢路径和启动子进行了分析。比较所有差异基因与已报道的13个抗性QTL的位置关系,发现有30个差异表达基因的位置与这些抗性QTL吻合,但在qBlsr5a的定位区间(290 kb)内只检测到一个差异表达基因(LOC Os05g01330),且功能未知。在水稻Gramene(http://www.gramene.org/Oryza_sativa_japonica/contigview)及TIGR(http://www.tigr.org/tdb/e2kl/osal/GO.retrieval.shtml)数据库中查询,发现qBlsr5a的精细定位区间(290 kb)内共有51个预测基因,其中33个(64.7%)有功能注释。根据这些功能注释,我们选择了19个预测基因(包括那个基因芯片检测到的差异表达基因)进行表达分析,其中3个预测编码多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白前体(PGIP);1个编码锚蛋白1(ankyrin-1);1个编码转录因子ⅡAγ基(TFⅡAγ);1个编码与K蛋白1互作的锌指蛋白(ZIK1);还有2个含锌指结构。以H359和H359-BLSR5a为材料,在病原菌接种后的不同时期对这19个基因进行半定量RT-PCR分析。结果表明,有4个预测基因在两品系中都没有表达,7个预测基因在两品系中在病菌侵染前后表达都没有变化,其余8个预测基因对病原菌侵染有反应。其中6个基因的表达趋势在两品种中基本一致(5个表达上调,1个表达下调)。1个基因(LOC_Os05g01380)在H359中接种前后没有变化,但在近等基因系H359-BLSR5a中接种6h时表达量开始增强,到24h时表达量达最到高。最令人感兴趣的是预测基因LOC_Os05g01444,它在H359中没有表达,而在H359-BLSR5a中被诱导表达,且在接种6h时表达量达到最高。该基因编码区长度为1,206 bp,无内含子,预测编码多聚半乳糖醛酸酶抑制前体蛋白(PGIP),已知PGIP参与植物的多种抗病反应。因此看来,该基因是qBlsr5a的一个重要的候选基因。
曾建敏[2]2003年在《水稻对细菌性条斑病菌侵染反应的分子机理研究》文中研究表明水稻细菌性条斑病，简称细条病(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)，是我国南方稻区的主要病害之一。轻发田一般减产15％～25％，严重的可达40％～60％。因而明确水稻细条病病原菌致病性和水稻抗性遗传机理及其相互作用的分子基础，从本质上阐明由病原菌诱导的抗性基因表达与调控的分子生态学机理，对于有效控制水稻细条病的发生与发展、减少经济损失具有重要的理论和现实意义。 本研究以高抗细条病的水稻品种佳辐占成熟胚的愈伤组织为材料，用南方稻区强毒力细条病菌菌株进行人工接种，通过DDRT-PCR技术，共找到60个大小在179bp-700bp之间受Xooc侵染诱导或抑制表达的cDNA差异片段。其中50个差异片段为接种Xooc的水稻愈伤组织所特有的，另外10个为未接种Xooc的水稻愈伤组织所特有的。回收这些cDNA差异片段后进行二次扩增，并采用RDB(reverse dot-blotting)杂交进行阳性鉴定，结果得到4个阳性克隆。通过BLAST软件将这4个阳性克隆同基因文库中的序列进行同源性比对，发现24-21克隆位于水稻第10号染色体的nbeb0039C14克隆(GenBank Acc:AC087549)上；39-34克隆位于水稻第5染色体的BAC克隆OSJNBb0086G17(GenBank Acc:AC144455)上；45-11克隆位于水稻第1染色体的PAC克隆P0410E03(GenBank Acc:AP002844)上；55-34克隆位于水稻第10染色体的OSJNBa0060A14克隆(GenBank Acc:AC021893)上。 通过与表达库(EST)中的序列同源性比对结果表明，24-21克隆与NaCl胁迫的水稻根系cDNA克隆ID1561(GenBank Acc:BE607423)同源性达97％，且E期望值达3e-82，还与野蚕(Bombyx mandarina)的cDNA克隆H109(GenBank Acc:AT001109)具9％的同源性。39-34克隆包含一个小粒稻(Oryza minuta)HybriZAP-2.1 XR库的cDNA克隆OML00455(GenBank Acc:CB210175)，并与稻瘟病菌(M.grisea)诱导的水稻cDNA克隆OSJNEb09A05(GenBank Acc:CB646488)和OSJNEb09B24(GenBank Acc:CB646568)、水稻花期穗的cDNA克隆E2428(GenBank Acc:AU094102)、短日照条件下水稻幼叶的cDNA克隆E60992(GenBank Acc:AU095268)以及NaCl胁迫水稻根系的cDNA克隆BR030002000＿PLATE＿E11＿85＿086.abl(GenBank Acc:CA754595)部分同源。45-11克隆与浸水胁迫大麦根的cDNA克隆EBro03＿SQ005＿D03(GenBank 福建农林大学硕士学位论文^ec:BQ763644)、大麦授粉ld后幼胚的eDNA克隆so00020003oA08FI(GenBankAee:月434386)‘、稻瘟病菌诱导获得的水稻eDNA克隆VoolA03(GenBankAee:BM42 1 151)和水稻细条病菌(BLS222)诱导的玉米叶片的eDNA克隆Rxo一2_Bos (GenBank Aee:eA452438)以及九eeinia 50烤儿1 isolate州l诱导的玉米叶片eDN^克隆RP3A一2少03(GenBank Aee:CA452784)等具有42一420bp大小不等的同源性。55一34克隆与浸水大麦根的。DNA克隆EBroo3_sQoo妇17(GenBank Aee:BQ765947)、高粱胚(EMI)的eDNA克隆EMI_52一05.91_AooZ(GenBank Aee:BG464036)、禾谷镰抱菌(尸脚minearum)诱导的小麦 eDNA克隆Tao屯13908(GenBank Aee:BQgol614)、白粉病菌(丑脚min心￡sP沉tici)诱导的小麦eDNA克隆wlmo，pk041.o7(GenBankAcc:cA658271)等具有较高的同源性，且与一个水稻花期穗的cDNA克隆Eos 16(GenBank Ae。:^ul72440)具有417bP大小的同源。 从推定的氨基酸序列的同源性比对分析发现，24一21克隆的氨基酸序列是一个新的序列;39一34克隆的氨基酸序列除了与ATI基因(h。。k一coniaining protein ATI)(GenBank Acc:557459)有34个氨基酸的同源外，还与金黄色葡萄球菌(及叩勺lococ二auras)的转移复合蛋白(transfer eomPlex nrotein TrsE)(GenBank Aee:F36891)、NADH脱氢酶亚基(dehydrogenase sub画t)4[Che之rogaleus oedius](GenBank Aee:AAK705 14)等有一定的同源性;而45一11克隆的氨基酸序列则仅与PDR一like ABC transPorter团。夕之口sarivaC即onica eultivar一gro即)」(GenBank Aee:CAD59568)具有同源。55一34克隆的氨基酸序列与推定的水稻果胶甲基醋酶(Putative pectin methylesterase)(GenBank Acc:AAK98683)具有73个氨基酸的同源性，且同源性(Identities)和正确性(Positives)均为98%，还与拟南芥假定的蛋白(GenBank Acc:H 86187)和推定的花粉特异果胶酷酶(pollen一speeifle peetinesterase，putative)(GenBank Aee:Np_191776)等具有较高的同源性。文中还就如何应用现有分离得到的相关基因进一步开展抗性生理与分子生态学研究作了探讨。
宋志伟[3]2015年在《水稻细菌性条斑病菌中hshB基因及其所在基因簇功能的研究》文中研究表明水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)属于原核生物界,黄单胞菌科黄单胞菌属的一种稻黄单胞菌(X.oryzae),在水稻上引起细菌性条斑病,该病主要危害水稻的叶片,严重威胁热带及亚热带地区水稻的种植。稻黄单胞菌包括两个致病变种,分别是稻致病变种(X.oryzae pv.oryzae,Xoo)和稻生致病变种(X.oryzae pv.oryzicola,Xoc)。虽然Xoo与Xoc均属于稻黄单胞菌,但两种菌感染水稻叶片的机制却不同。相比我们对于Xoo的了解,对于Xoc的致病分子机制所知的却较少。群体感应(quorum sensing,QS),是细菌通过分泌信号分子来监测群体的密度,使细菌群体能够依靠群体密度或者生长阶段来调控菌体的基因表达,进而调控细菌生物学功能的一种细胞间信号交流机制。黄单胞属细菌中的群体感应系统主要依赖于可扩散性信号分子(DSF),且该系统在黄单胞属细菌中高度保守。在前期的研究工作中,证实水稻细菌性条斑病菌具有DSF依赖性群体感应系统,且DSF信号分子由rpfF基因负责合成,缺失rpfF基因后菌体彻底丧失合成DSF信号分子的能力,以及在水稻上的致病性。为了更好地解析水稻细菌性条斑病菌中DSF依赖性群体感应系统是如何调控菌体致病能力的,在前期的工作中,利用蛋白双向电泳技术,比较分析了条斑病菌野生型菌株Rs105与基因rpfF缺失突变体的胞内蛋白质组表达谱,并最终鉴定到18个蛋白,利用生物信息学技术对这18个蛋白进行功能预测,发现它们涉及鞭毛形成、活性氧抗性及氮源转换等生物学功能,其中鉴定发现了一个由hshB基因编码的蛋白为菌体致病所必须。进一步研究发现并证实,基因hshB(相较水稻白叶枯菌PX099~A而言)为水稻细菌性条斑病菌特有,与此同时,基因hshB不仅受细菌群体感应信号DSF及全局性调控因子clp调控,缺失该基因后,还会严重的削弱菌体的致病性、胞外蛋白酶的分泌、胞外多糖的产生以及对过氧化氢的耐受性,并且该基因的转录受到营养贫瘠条件诱导,但对于基因hshB具体的作用机制并不清楚。本研究中,首先通过生物信息学分析了hshB基因编码蛋白可能具有的结构域及生物学功能,进一步通过生物学性状测定,发现了基因hshB突变体的游动能力相较野生型菌株显着降低,同时转录组测序发现,基因hshB缺失后影响条斑菌中305个基因显着差异表达,且这些差异表达基因不仅涉及菌体致病性、蛋白酶分泌、碳源代谢、氮源代谢、抗氧化压力、运动能力、趋化性及生物膜形成等多方面内容,差异基因的富集分析还显示,hshB调控的基因主要集中在菌体运动能力和信号转导两方面,转录组测序的发现不仅证明了生物学性状测定的准确性,同时也为下一步研究提供了方向。深入分析转录组数据发现,hshB还调控参与菌体生物膜形成相关的基因,通过多种方法测定后,证实hshB突变后确会增强菌体的生物膜形成,同时,结合相关文献报道,综合基因hshB突变增强菌体的生物膜形成,降低菌体运动能力的作用,初步揭示出基因hshB与细胞环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)受体YajQ的关系,推测出基因hshB可能是通过调节菌体内的c-di-GMP浓度来发挥作用的。本研究不仅揭示出基因hshB在调控菌体运动能力方面的新功能,同时深入发掘转录组数据后,初步揭示了基因hshB调控菌体致病性、胞外蛋白酶及过氧化氢的耐受性等方面的机制,同时发掘并验证了基因hshB在调控菌体生物膜形成方面也具有重要作用,并且hshB作用机制与菌体内的c-di-GMP密切相关,这些发现为进一步深入解析hshB基因的致病机制提供了研究方向。在深入研究分析hshB基因本身的同时,我们对于hshB基因所在的nodB-rghB基因簇也进行了探究。在nodB-rghB基因簇中鉴定出两个功能与hshB基因相似但又有诸多不同,为Xoc所特有(相较Xoo而言)同时受DSF信号调控的毒性相关基因hshA与hshC。该研究发现,这两个基因的缺失突变在低密度接种时致病力相较野生型有显着下降,同时相较毒性基因hshB,这两个基因对菌体的体外生长能力、胞外多糖的产生、过氧化氢的耐受能力以及蛋白酶的分泌能力均没有显着影响,进一步的研究发现,hshA与hshC缺失突变后导致菌体在水稻上的定殖能力以及附生定殖水平都显着下降,初步揭示出hshA与hshC影响菌体致病性的机制。通过本研究中鉴定出的两个新型受DSF信号调控的毒性相关基因(hshA与hshC),不仅增进了我们对条斑病菌hshB基因所在的nodB-rghB基因簇的了解,同时也有助于对黄单胞菌中DSF信号系统调控毒性基因机制的认识。综上,本文不仅揭示了hshB基因在调控菌体运动能力及生物膜形成方面的新功能,更通过分析转录组数据揭示出hshB基因调控菌体诸多性状的可能的作用机制,同时对hshB基因所在的nodB-rghB基因簇深入挖掘,鉴定出两个新型受DSF信号调控的毒性相关基因(hshA与hshC),所有这些发现为进一步解析hshB基因作用机制开辟了方向,为更好的了解和防控水稻细菌性条斑病打下了坚实的基础。
李玉蓉[4]2010年在《水稻条斑病菌hrp基因簇功能分析及hcm1转基因水稻的研究》文中指出水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)是水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)种下的两个致病变种之一,引起的水稻细菌性条斑病(条斑病)(Bacterial Leaf Streak, BLS),近年来成为水稻上的重要病害。水稻条斑病菌同其他革兰氏阴性植物病原细菌一样拥有hrp基因簇,决定着病原细菌在非寄主植物上的过敏反应(hypersensitive response, HR)和在感病寄主上致病性(pathogenicity)。与水稻互作时,水稻条斑病菌的hrp基因簇编码形成Ⅲ型分泌系统(T3SS),将T3SS效应蛋白注入植物细胞中从而导致非寄主产生HR和在水稻上产生细菌性条斑病症状。水稻条斑病菌约27kb的hrp基因簇包括10个hrp,9个hrc (hrp-conserved)和8个hpa (hrp-associated)基因,也称hrp-hrc-hpa基因簇,并由调节因子HrpG和HrpX调控。虽然水稻条斑病菌的hrp-hrc-hpa基因与其它植物病原黄单胞菌中的hrp-hrc-hpa基因有较高的同源性,但每个基因对病原菌的致病性和毒性的贡献并不清楚。本研究以野生菌株RS105为出发菌,利用自杀性载体pKMSl获得了上述29个hrp基因的无标记缺失突变体。植物上接种结果显示,hrc基因突变体全部丧失在非寄主上的HR和在水稻上的致病性(Hrp表型)；hpa基因对Hrp表型没有显着影响,仅hpaB和hpa1基因突变体分别丧失和减弱了在水稻上的致病性；hrp基因中,除hrpF表现为毒性显着减弱和仍能激发烟草HR以及hrpE3对Hrp表型没有改变外,其他hrp基因突变后,病原菌均丧失Hrp表型。这些结果为进一步揭示hrp-hrc-hpa基因的具体功能奠定了基础。为了揭示可能的调控因子对hrp-hrc-hpa基因调控关系,本研究根据其他植物病原黄单胞菌的研究结果,分别对全局性调控因子Trh、LrpX、ColR、ColS和Zur在水稻条斑病菌中的基因进行了敲除。水稻上的致病性和烟草上的HR测定结果显示,trh、lrpX、colR、colS和zur突变体降低了水稻条斑病菌在水稻上的毒性,但不影响在烟草上的HR激发能力。水稻条斑病菌的hrp基因主要由调节因子HrpG和HrpX进行调控,但至今并不清楚是否HrpG和HrpX调控所有的hpa-hrp-hrc基因转录表达。RT-PCR结果显示,hrcC、hrpD5、hrpE和hpa3基因的转录表达不完全依赖HrpG和HrpX的调控；hrcT受HrpX调控不受HrpG调控,hpa2受HrpG调控不受HrpX调控。另外发现,hrpD6基因突变后,hpa2、hpa1和hpaB基因不转录表达,hrcC和hrcT基因的转录表达水平下降。这说明,HrpG和HrpX通过调控hrpD6的表达而影响了hpa2、hpa1、hrcC、hrcT和hpaB基因的表达。为了了解其他全局性调控因子以及HrpG和HrpX对上述基因表达的调控作用,本研究将hrpA、hrpB、hrpC、hrpD和hpa3转录单元的启动子以及hrp基因簇中的启动子进行了分析,认为它们的启动子分别为phrcC、phrcT1、phrpD51和phpa3。通过软件分析后还发现,hrpB转录单元中的hrcN和hrpD转录单元的hpaP基因内存在可能的启动子,分别为phrcT2和phrpD52。将上述启动子分别与gusA基因进行融合,导入野生菌中,在水稻细胞、hrp诱导培养基XOM3和NB中进行GUS活性测定。结果发现,phrcC、hrcT1、prhD51和phpa3启动子可以驱动gusA基因在水稻细胞和XOM3中诱导表达,而不能有效在NB中表达。相应的,phrcT2和phrpD52在叁种条件下都能驱动gusA基因表达。为了排除全局性调控因子对上述基因表达差异的调控作用,本研究将上述hrp-gusA构建以及hrpG和hrpX基因的启动子分别导入hrpG、hrpX、trh、lrpX、colR、colS和zur突变体中,结果发现,hrpA转录单元受HrpG、Zur、ColR和Trh的正调控,不受HrpX、LrpX和ColS的调控；hrpB转录单元受HrpX正调控,不受其他因子的调控；hrpD转录单元同时受HrpG和HrpX调控,不受其他五个全局性调控因子的调控；hrpG基因受Trh正调控,不受其他调控因子的影响；hrpX基因受HrpG的正调控影响最大,其次受Zur和Co1R的正调控,但还受LrpX的负调控作用。这表明,这些调控因子通过对hrpG或hrpX基因的转录调控作用而间接的影响hrp基因的转录表达。而五个全局性调控因子以及HrpG和HrpX对phrpD52和phpa3没有调控作用。这也提示,hrpD5、hrpE和hpa3的调控受到未知调控因子的作用。为了揭示这些因子在转录后水平上对hrcC、hrpD5、hrpE、hrcT和hpa3的调控作用,本研究利用Northern杂交对上述调控因子突变体中的hrcC、hrpD5、hrpE、hrcT和hpa3基因表达进行了分析。结果发现,hrpE基因在hrpX突变体中仍然有低水平的转录,而在lrpX突变体中表达水平超过野生型。这提示,hrpE基因的表达并不受HrpG、Trh、ColR、ColS和Zur的调控,但受到HrpX的显着正调控作用,并且LrpX对HrpX的负调控,导致hrpE转录水平升高。遗憾的是,hrcC、hrpD5和hpa3的mRNA水平太低,没有杂交信号出现。由于hrpD5、hrpE和hpa3不完全依赖hrpG和HrpX调控,这促使本研究进一步对其所在的转录单元构成进行分析。对phrpD51和phrpD52进行突变,经诱导通过RT-PCR分析后发现,hrpD转录单元的启动子phrpD51突变后,除hrpD5和hrpE基因外,hrcQ、hrcR、hrcS、hpaP、hrpD6、hrpE和hpaB基因不转录表达,而可能的启动子对上述基因(hpaP除外)的转录没有影响。这说明hrcQ到hpaB基因同处一个转录单元中,而hrpD5基因的转录可能受到另外调控因子的作用。为了证实这个结果,本为从hrpC转录单元的hpaP基因开始,以hrpE3基因为终点,以两两基因为对象,通过RT-PCR扩增发现,hrcQ、hrcR、hrcS、hpaA、hrpD5、hrpD6、hrpE和hpaB基因处于同一转录单元中。这一结果不同于其它植物病原细菌黄单胞菌的转录单元构成,但与水稻白叶枯病菌的相应的转录单元相同。为了进一步说明HrpD6对hpa2、hpa1、hrcC、hrcT和hpaB基因的调控作用以及对hrpG和hrpX的转录表达有影响作用,本研究将细hpa2和hpa1的启动子phpa2和phpa1以及phrcC、phrcT和phrpD51与gusA的融合构建,分别置于hrpD6突变体和野生型中,经XOM3诱导表达后GUS活性检测发现,HrpD6对hpa2、hpal和hrcC基因以及hrpB转录单元有正调控作用,对hrpG、hrpX基因和hrpD转录单元转录表达没有影响。为了蛋白质水平上检测hrpD6突变后,影响了Hpa2和Hpa1的产生,本研究将hpa1和hpa2基因与c-Myc标签进行融合,分别置于野生菌株、T3S突变体hrcV突变体和hpaB突变体中。蛋白免疫杂交结果显示,hrpD6突变体和hpaB突变体中无Hpa2和Hpa1蛋白的分泌。这说明,hpa2、hpal和hpaB基因在转录水平上就受到了HrpD6的调控。为了进一步分析HrpD6对hpaB基因的调控作用,本研究以HpaB依赖而分泌的效应分子AvrXa27和不依赖HpaB而分泌的转位元HrpF为报道基因,分别与FLAG和c-Myc进行融合,导入野生菌、T3S突变体hrcV、hrpD6和hpaB突变体中,经过相同的诱导,蛋白质免疫杂交结果显示,hrpD6突变后,与同hpaB突变体一样,AvrXa27不分泌,HrpF仍能进行分泌。这表明,hrpD6基因突变后,hpaB基因不转录表达,从而AvrXa27不能进行分泌,而不依赖HpaB的HrpF能够进行分泌。明确HrpD6是hrp-hrc-hpa基因的调控因子,在黄单胞菌的hrp基因调控中还属首次报道。X. oryzae pv. oryzicola的hpa2基因位于hrp基因簇最左端,启动子区域存在imperfect PIP-box,其基因产物属lytic transglycosylase家族,推测其可能溶解植物细胞壁从而使T3SS发挥作用。hrpF基因位于hrp基因簇的右端,在寄主细胞膜上形成转位装置将效应蛋白转运至寄主细胞中。Hpa2和HrpF是否互作,从而决定病原菌的致病性,还不清楚。本研究发现,hpa2和hrpF基因分别突变后,降低了在水稻上的毒性,细菌生长能力减弱,但不影响在非寄主烟草上的HR。hpa2和hrpF同时突变后,X. oryzae pv. oryzicola在水稻上丧失了water soaking症状和致病性,但在非寄主上仍有HR激发能力。转录水平研究发现,hpa2基因的表达受HrpG调控,不受HrpX调控。细胞定位结果显示,Hpa2作用于植物细胞膜上而非细胞壁。蛋白质互作和免疫杂交结果显示,Hpa2通过T3SS进行分泌,并与HrpF互作,控制T3S效应分子AvrXa27转位进入水稻细胞中,但在hrp诱导培养基上仍等检测到AvrXa27的分泌,推测Hpa2和HrpF互作形成复合体,控制效应分子转位进入植物细胞内,从而影响病原菌的致病性。水稻条斑病菌的HrpX能够调节hrp基因的表达,而在被调节的因子启动子区域一般含有PIP-box (plant-inducible promoter, TTCGC-N15-TTCGC).为了研究HrpX对hpa1的调控机制,通过in vivo策略,将启动子区域含有PIP-box的hpa1基因启动子分别与绿色荧光蛋白基因(green fluorescence protein, gfp)进行融合(phpa1：：gfp),两亲交配导入水稻条斑病菌野生型菌株和hrpX突变体中,借助水稻悬浮细胞诱导表达系统,观察启动子启动gfp的表达情况。结果发现,在hrpX基因突变体ARhrpX中,融合基因不转录表达,ΔRhrpX中菌体不显示荧光。同时RT-PCR结果揭示,ARhrpX中hpa1基因不能转录表达。以上结果表明,水稻条斑病菌中hpa1的转录表达受到HrpX的调控。水稻条斑病菌的hpa1是唯一已知的编码Harpin的基因,但是其在引起细胞死亡的生理生化机制尚不清楚。为此,基于对Hpal的氨基酸序列分析,本研究将Hpal缺失互补丧失HR的双突变体ARhpa1△hrpF观察HR,结果显示Hpa1 N端的α-helix决定其在非寄主烟草上产生HR,且第47位(C)和第53位(L)氨基酸是关键氨基酸。通过瞬时表达GFP,洋葱表皮定位显示Hpal主要定位于细胞膜上,暗示其可能通过破坏植物细胞膜起作用。根据X. oryzae pv. oryzae中的AvrXa10和Xa10的特异性互作关系,同时以avrXa10为报道基因,将RS105hpa1 N端60aa与缺失N端分泌信号(A28aa)的avrXalO融合后导入X. oryzae pv. oryzae PXO99A中,接种含有Xa10的水稻品种IRBB10观察褐色抗病反应,结果表明Hpa1能经细菌T3S进行分泌,Western Blot(?)必出性检测结果与此一致。这将为进一步揭示非寄主抗性提供更多的理论依据和有利线索。鉴于调控元件PIP-box序列保守性,可以将其作为一个有效的筛选标记从大量的基因组数据中获得HrpX调节子。基因组信息提示,X. oryzae pv. oryzicola的很多基因在启动子区域都含有完整或不完整的PIP-box。因此为了从X. oryzae pv. oryzicola中获得更多受HrpX调节的基因,本研究选取5个候选因子(hrpB1、avrBs2、ecpA、kgtP和Z1234)借助启动子-gfp(PIP-gfp)融合表达方法,导入X. oryzae pv. oryzicola hrpX基因突变体中,与水稻悬浮细胞互作后观察荧光有无或强弱,建立了筛选HrpX调节子的体系,同时也提示某些含有imperfect PIP-box的因子如kgtP和Z1234也是HrpX调节子,这为新的Ⅲ型效应分子的发掘提供依据。鉴于X. oryzae pv. oryzicola hpal基因编码产物Harpin具有在非寄主烟草上激发过敏反应的能力,其产物体外施用诱导植物产生多种有益表型,如抗病、抗虫及促生等,而转基因手段则可以实现其在植物体内的运用。为此,将水稻条斑病菌的hpa1放在组成型表达的CaMV35S启动子下获得重组质粒pBIhpa1。但Hpa1并没有直接的杀菌活性,为此将Hpa1和Cecropin A (CA)(?)勺α螺旋结构以及Meltin (ME)的α螺旋结构通过polylinker以及自由环进行连接,获得具有杀菌功能的融合基因hcm1。通过3种不同的构建策略将hcm1基因分别放在组成型表达的CaMV35S启动子、受病原菌诱导表达的hsr203J和PR1α启动子下获得重组质粒pBIhcml、pBIhshcml和pBIPRhcml。将上述转基因重组质粒转化根癌土壤杆菌EHA105菌株,通过农杆菌介导的方法,进行水稻武粳15的成熟胚愈伤组织的转化,获得hpa1和hcm1转基因水稻植株,能够激活水稻防卫反应,并能表现出对稻瘟病、水稻纹枯病的抗性。另外进行小麦扬麦158的幼胚愈伤组织的转化,对已有的转化体系进行优化,经抗性筛选和初步PCR检测获得hcm1转基因小麦植株。
冯雯杰[5]2014年在《水稻黄单胞杆菌的分子标记与致病相关因子的鉴定》文中指出水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病(简称水稻条斑病)是水稻上最重要的两个细菌性病害,在我国乃至东南亚的某些地区甚至成为主要病害,危害巨大。其病原菌分别是Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)和X. oryzae pv. oryzicola(Xoc),同属于稻黄单胞杆菌,具有非常近的亲缘关系,在形态特征以及生理生化性质上十分相似。在病害防治中如初始菌量的调查、病菌数量的统计以及日常的种子检验检疫中经常造成困难,因此需要方便、快捷及准确的鉴定方法。本研究利用生物信息学技术构建了比较基因组学算法,并且基于现有的全基因组序列对Xoo和Xoc进行分析,获得了一系列的用于区分水稻白叶枯病菌与条斑病菌病菌的电子分子标记917对,对其中叁种类型的多态性标记(Xoo特异性、Xoc特异性、Xoo和Xoc共显性等)随机选取了130对在40个已得到鉴定的菌株中进行了实验分析,分别获得30对Xoo特异性的分子标记,24对Xoc特异性分子标记,14对Xoo和Xoc共显性的分子标记。这些特异性分子标记可直接应用于检验检疫工作,并可发展多标记协同检测方法,提高了检测准确性。同时,本研究对水稻条斑病菌中特异的Ⅲ型分泌效应蛋白AvrRxo1进行了研究,开发出相关特异的分子标记。AvrRxo1是一类non-TAL类效应因子,其生物学功能未知。本研究利用烟草瞬时表达体系发现,表达AvrRxo1对非寄主烟草细胞具有毒性功能,同时来源于不同Xoc菌株的avrRxo1等位基因的毒性功能存在差异。通过分析五个菌株来源的AvrRxo1的氨基酸序列并结合定点突变验证,明确了AvrRxo1蛋白的第344位丝氨酸对其毒性功能具有重要作用。进一步对AvrRxo1蛋白分别从氨基端和羧基端进行截短实验以及预测的关键功能结构域位点进行突变实验,明确了AvrRxo1蛋白羧基端的完整性对其毒性功能的发挥是必需的。此外,前期研究暗示水稻白叶枯病菌可能代谢产生IAA并将其作为侵染水稻的致病因子。本研究利用同源重组的方法在PXO99A中获得了四个预测与IAA合成相关基因的突变菌株：P△pxo_04004、P△pxo_04823、P△pxo_00867和P△pxo_03584。利用高效液相色谱仪对野生型菌株PXO99A及其四个突变菌株的代谢产物进行了检测分析。结果显示,PXO99A可以代谢生成IAA,产量约为2.6μg/ml,而其突变体代谢IAA产量显着降低,证明了水稻黄单胞菌中存在多种IAA合成途径。与预期相反,致病力检测发现4个突变菌株相比于野生型PXO99A致病力显着提高。对突变菌株的生理生化进行检测,发现四个突变菌株的重要的致病因子之一胞外多糖(EPS)的产量得到提高。双向电泳技术的初步分析也显示了突变菌株在分泌蛋白分泌量和种类上与野生型相比也存在差异,有望揭示IAA负调控黄单胞杆菌致病因子合成的机制。综上所述,本研究开发了大量鉴别Xoo和Xoc的PCR标记,并对其中一个分子标记的靶标基因avrRxol的致病性功能进行了分析。同时鉴定了Xoo中存在IAA的合成途径,并证明其参与负调控黄单胞杆菌致病因子合成。相关研究结果有望在植物检疫、病害防控上发挥一定的作用。
常清乐[6]2013年在《非寄主抗病抑制子AvrRxo1的双功能结构域鉴定》文中指出由革兰氏阴性黄单胞杆菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)引起的水稻白叶枯病和X. oryzae pv. oryzicola (Xoc)引起的水稻细菌性条斑病（简称水稻条斑病）是目前水稻生产上最主要的两种细菌性病害。尽管水稻白叶枯菌和条斑病菌在基因组DNA水平上的同源性达到90%以上，但是两者的侵染方式有显着差异。水稻白叶枯菌是在植物维管束中繁殖增生，而条斑菌则是以植物叶肉细胞间隙繁殖并致病。目前在水稻体内已经鉴定了30多个白叶枯菌的主效抗病基因，但迄今为止尚未鉴定抗水稻条斑病菌的主效基因。Zhao等（2004）仅在非寄主玉米B73上克隆获得Rxo1基因，能与条斑病菌的特性保守基因avrRxo1相互识别并激发抗性反应，Rxo1在后期抗病水稻品种的培育中也得到了很好的利用。尽管如此，条斑病菌的抗性资源仍然十分有限。Makino等（2006）的研究证实水稻条斑病菌能抑制病原无毒蛋白AvrXa10与抗病蛋白Xa10的识别互作，说明在病原菌中可能存在某些效应因子来抑制寄主的抗性反应。本研究通过建立白叶枯菌PXO99a和本生烟的互作模式体系来筛选条斑病菌RS105的基因组文库，发现携带有avrRxo1基因片段的克隆能抑制PXO99a在烟草上的HR反应。继而从不同菌株中分离获得了五个avrRxo1等位基因，经序列比对分析，发现这五个等位基因在核苷酸水平上存在8-11个不等的碱基差异，进而造成氨基酸水平上的多态性。实验证明不同avrRxo1的等位基因产物均能抑制白叶枯菌PXO99a在烟草上产生的HR反应，也能被抗病蛋白Rxo1所识别。通过系列蛋白截短实验明确：效应子AvrRxo1羧基端的完整性对两种功能非常重要，即使去除1个氨基酸便影响其非寄主抗病的抑制能力，去除3个氨基酸就影响其被Rxo1的识别；氨基端的任意截短对两种功能都有影响；另外，编码预测的ATPase活性位点和核定位位点对拥有两种功能也是必需的。将携带羧基端和氨基端不同截短的功能肽段以及蛋白重要位点突变的AvrRxo1转化菌株PXO99a接种携带不同抗白叶枯病基因的水稻材料，出乎意料地发现完整AvrRxo1并不能抑制水稻对白叶枯菌的抗性，侵染病斑长度反而缩短；与野生型菌株相比，含有完整AvrRxo1的PXO99a转化菌株在抗感病水稻材料上细菌生长量均明显减少。巧合的是，所有水稻品种的接种结果显示，抑制PXO99a致病性的功能域与其识别Rxo1的关键功能域保持一致，暗示AvrRxo1可能会激发水稻的抗病反应，属于共进化上被打败的病原效应分子。另一直接的证据进一步通过avrRxo1的水稻转基因株系来证明：超量表达avrRxo1基因的阳性株系能够显着提高对水稻条斑病菌RS105和白叶枯病菌PXO99a的抗性水平。与野生对照植株相比，RS105接种转基因阳性株系的病斑长度要减短0.5-0.7cm不等；接种PXO99a的病斑长度缩短3cm左右。此外，荧光定量PCR检测显示avrRxo1转基因水稻中抗病相关基因PR1a和PR10的本底表达水平显着升高，说明AvrRxo1可激发水稻中非Rxo1介导的抗性反应。综上所述，我们鉴定了条斑病菌效应因子AvrRxo1的新的功能并发现多个结构域能影响相关的功能，发现AvrRxo1可以抑制白叶枯菌PXO99a在本生烟上产生HR反应，但不能抑制寄主水稻对该菌的抗性，相反AvrRxo1可能会激发水稻对病原菌的抗性，这一系列的发现有望在水稻抗病遗传改良上获得应用。
黄青云[7]2006年在《水稻细菌性条斑病侵染水稻明恢63诱导差异蛋白质组学研究》文中进行了进一步梳理水稻细菌性条斑病(简称细条病),广泛分布于华南、中南稻区。该病是细条病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Xooc)引起的一种细菌性病害,于20世纪50年代在我国广东省首先发现,后因感病的杂交水稻大面积推广,致使此病迅速蔓延,病区不断扩大,已成为我国水稻主要病害和重要的检疫对象。目前国内外对于水稻细条病的研究仅仅限于基因组学的研究以及抗性基因的转化,而对该病菌侵染水稻后诱导机体蛋白应答的系统性研究还未见报导。因此,运用差异蛋白质组学手段开展水稻对细条病菌侵染的应答相关蛋白研究,无论是在阐明水稻的抗性分子机理和基因表达调控方面,还是在高产、优质、高抗的水稻品种的分子育种方面具有重要意义。本试验以水稻品种“明恢63”和强毒力细条病菌株“89773-1-1”为供试材料,在水稻主茎六叶一心期时,提取叶片全蛋白运用双向凝胶电泳分离,研究了叶片在接菌处理和不接菌的对照条件下不同时期蛋白质组差异表达谱,质谱分析鉴定差异蛋白质,通过对差异表达蛋白质的分析,探讨水稻对细条病菌侵染的防卫应答系统。在细菌侵染后2 h、5 h、12 h、48 h 4个处理时间梯度进行取样,提取叶片全蛋白样品,通过双向电泳-质谱技术,比较其蛋白质表达情况。结果发现,共有33个蛋白质点在不同侵染时期发生了差异表达,其中表达量上升的有21个;表达量下降的有12个。经MALDI-TOF/MS检测及肽指纹图谱(PMF)分析,其中27个蛋白点在有关数据库中得到了归属鉴定。进一步对这27个蛋白及其特性进行综合分析,认为这些蛋白参与了水稻对细条病侵染的信号识别及防卫应答,其中包括信号转导类蛋白、防卫相关蛋白、代谢相关蛋白和参与蛋白质合成的蛋白等。结果表明,中感水稻品种“明恢63”对细条病病菌侵染后的生物应答受复杂的网络调控机制控制。这些功能蛋白的鉴定为探明水稻对细条病的抗性机理,明确细条病菌与寄主植物水稻相互作用的分子基础及其抗病信号转导途径及寻找与抗细条病菌密切相关的差异表达蛋白质和基因奠定了基础。
左丽萍[8]2018年在《OsbHLH81基因在水稻抗条斑病和白叶枯病中的功能鉴定》文中认为植物病害严重威胁着世界粮食安全。由稻黄单胞菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo引起的水稻白叶枯病和Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc引起的水稻细菌性条斑病是水稻生产中两种主要的细菌性病害。在我国华南、华中和华东地区以及东南亚稻区和非洲稻区均有发生,适宜条件下两大病害可同时大面积发生危害严重。目前鉴定到多个抗白叶枯病的基因,而水稻条斑病抗性属于数量性状,受多个基因控制。实践表明,发现抗病基因和培育具有广谱抗性的水稻品种对抵抗这两种细菌性病害具有重要意义。利用差异表达cDNA文库技术,研究高抗水稻材料Acc8558和易感水稻材料中花11在病原菌侵染过程中差异基因的表达,并分析其与已经鉴定的QTL的相关性,筛选到了具有优先研究价值并与细菌性条斑病抗性相关的基因AK066188(LOC_Os09g33580),该基因编码一个未知功能的转录因子bHLH81。该基因在辣椒中的同源基因UPA20被证明是辣椒斑点病(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)效应蛋白avr Bs3的靶基因,UPA20的表达促进细胞增大进而引起感病。其在拟南芥中的同源基因BPEp能调控花瓣的大小。OsbHLH81是水稻中UPA20的同源基因,序列相似性为63%。为研究OsbHLH81基因在水稻抵御细菌性病害中的生物学功能,本研究首先通过生物信息学分析、亚细胞定位和转录激活验证证实OsbHLH81具有转录因子典型特征。OsbHLH81能被条斑病菌和白叶枯病菌诱导表达,为进一步研究OsbHLH81在抗病反应中的作用,构建了OsbHLH81抑制和超量表达载体,通过水稻遗传转化得到了抑制表达和超量表达的转基因株系。对其接种条斑病菌和白叶枯病菌后发现:相比于野生型植株,抑制OsbHLH81基因表达显着增强了水稻对条斑病和白叶枯病的抗性,而超量表达该基因则削弱了水稻对两种病害的抗性。这一结果表明OsbHLH81负调控水稻对条斑病和白叶枯病的抗性。OsbHLH81基因抑制表达的转基因株系接种条斑病菌后能激活OsAOC、OsAOS、OsPOX的表达,而不能使PR基因上调表达。暗示OsbHLH81基因介导的对条斑病菌的抗性可能与茉莉酸信号路径有关,而不依赖于PR基因的表达。为充分证明RNAi转基因材料的抗病结果,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了OsbHLH81基因敲除突变体,接种实验证实OsbHLH81基因敲除突变体能增强对细菌性条斑病的抗性。
刘海峰[9]2015年在《AvrRxo1调控水稻维生素B6合成影响水稻对条斑病抗性》文中认为水稻细菌性条斑病(简称条斑病)是由条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola, Xoc)引起的,是水稻生产上危害严重的细菌病害之一。迄今尚未发现对条斑病菌免疫的水稻材料,也未从水稻中鉴定出控制条斑病的主效抗病基因。这一现象可能是由于条斑病菌中存在一个或多个依赖叁型分泌系统的抑制因子,能够抑制水稻防御基因产生的抗性。解析这些抑制因子的作用机理将有望破解水稻上缺失对条斑病主效抗性基因的谜题,对研发控制水稻条斑病危害的措施具有指导意义。为了克隆条斑病菌中的抑制因子,本研究构建了条斑病菌小种RS105的全基因组文库,并将文库质粒转化至白叶枯病菌PXO99A中,在水稻抗性材料IRBB21上筛选病斑变长的感病克隆。对筛选到的感病克隆进行测序发现,其中2个克隆的插入片段携带有一个共同的叁型效应分子——AvrRxo1。进一步研究发现,转有pHM1: avrRxo1的PXO99A在IRBB21上的致病性显着高于对照PXO99A (pHM1),说明效应分子AvrRxo1具有抑制因子的功能。与野生型条斑病菌RS105相比,avrRxol敲除突变体RS105△avrRxo1在成株期水稻上的致病力显着降低,而突变体回复菌株致病力得到恢复,表明效应分子AvrRxo1在条斑病菌侵染水稻的致病过程中发挥着毒性因子的作用,有利于条斑病的发生。为了明确效应分子AvrRxo1在条斑病菌致病过程中发挥毒性因子的作用机制,本研究采用酵母双杂交技术筛选到与AvrRxo1互作的水稻蛋白OsPDX1.2。OsPDX1.2为OsPDX1蛋白家族成员,该蛋白家族中的另两个成员——OsPDX1.1和OsPDX1.3,与OsPDXl.2在氨基酸序列上高度相似,经酵母双杂交验证发现,OsPDX1.1和OsPDX1.3也可以与AvrRxo1相互作用。采用双分子荧光互补实验和免疫共沉淀实验验证AvrRxo1与OsPDX1蛋白间互作的真实性。实验同时发现,AvrRxo1与OsPDXl蛋白各自的羧基端在该相互作用发挥着不可或缺的作用。另外,实验证明,OsPDX1家族蛋白成员自身和相互之间存在互作。此外,AvrRxo1也可以与拟南芥中AtPDX1蛋白家族成员及酵母中PDX1的同源蛋白SNZ1相互作用。这些结果表明,效应分子AvrRxo1可以与水稻(单子叶植物)、拟南芥(双子叶植物)、酵母(真菌)中的PDX1蛋白互作。与野生型对照相比,超量表达OsPDX1的转基因水稻对条斑病菌表现抗性,OsPDX1-RNAi转基因植株和敲除突变体对条斑病菌表现为更加感病,表明OsPDXl正向调控水稻对条斑病的抗性。研究发现,接种条斑病菌野生型菌株或突变体回复菌株能降低水稻中OsPDX1蛋白水平,而接种avrRxo1敲除突变体RS 105△avr Rxo1的水稻中OsPDX1蛋白水平与对照相比没有显着差异,暗示AvrRxo1可能具有蛋白酶活性。采用无细胞蛋白降解实验和原核表达纯化蛋白实验进一步证实AvrRxo1具有蛋白酶活性,能够降解OsPDX1蛋白。在拟南芥中诱导avrRxo1基因表达能够降低PDX1蛋白的水平。同时,研究发现AvrRxo1降解OsPDX1是依赖ATP的。PDX1在真菌和植物中的功能高度保守,参与维生素B6的从头合成。本研究发现,在本氏烟中瞬时表达avrRxo1基因能够降低本氏烟中维生素B6的水平。在水稻上接种条斑病菌野生型菌株或突变体回复菌株能够降低水稻叶片中维生素B6的水平,而接种avrRxo1敲除突变体RS 105△avrRxo1的水稻中维生素B6的水平与对照相比无显着差异。体外用维生素B6对水稻进行处理能够提高水稻对条斑病菌的抗性。综上,AvrRxo1可以通过降解PDX1蛋白影响植物中维生素B6的从头合成,从而利于条斑病的发生。AvrRxo1能够被非寄主抗性基因Rxol识别,并引起过敏性坏死反应。分析Rxol转基因水稻在接种条斑病菌后OsPDX1基因的表达情况发现,与野生型水稻材料相比,Rxol转基因水稻中OsPDX1.3转录水平显着提高。烟草瞬时表达实验结果证明,Rxol和avrRxo1共表达时能够诱导OsPDXl.3基因启动子驱动的绿色荧光蛋白的表达,而avrRxo1或Rxo1单独表达并没有此功能。酵母双杂交实验证实Rxo1蛋白可以直接与AvrRxo1蛋白互作,在烟草中共表达时Rxo1能够促进AvrRxo1蛋白进入细胞核。结合生物信息学预测结果,在OsPDx1.3基因的启动子上鉴定了一个顺式作用元件S000465,该顺式作用元件在AvrRxo1激活OsPDX1.3基因表达过程中发挥着重要作用。将S000465顺式作用元件与35Smini基础启动子融合来驱动GFP基因,同样可以被AvrRxo1诱导表达。酵母单杂交实验、凝胶阻滞实验证实了AvrRxo1蛋白与S000465元件间的相互作用。综上,在抗性基因Rxol存在的情况下,AvrRxo1蛋白的亚细胞定位发生变化,结合OsPDX1.3基因的启动子,激活OsPDX1.3基因表达,可能促进维生素B6的从头合成,对条斑病表现抗性。在利用酵母双杂交系统筛选互作蛋白时发现,AvrRxo1对酵母细胞具有毒性,而在培养基中添加维生素B6能够解除AvrRxo1的毒性。本研究分别在氨基端和羧基端对AvrRxo1蛋白进行荧光蛋白标记时也发现：当在氨基端标记荧光蛋白后,AvrRxo1对拟南芥细胞的毒性消失,而在羧基端进行荧光蛋白标记的AvrRxo1蛋白对拟南芥细胞仍具有毒性,转基因拟南芥根的伸长受到抑制。分析二者的亚细胞定位发现,YFP-AvrRxo1定位于细胞核中,而AvrRxo1-GFP定位于细胞膜上。在培养基中添加维生素B6可以解除AvrRxo1-GFP拟南芥受到的生长抑制,恢复AvrRxo1-GFP转基因植株根的伸长。这些研究结果表明,AvrRxo1发挥毒性功能可能与其降解PDX1影响维生素B6水平有关,毒性功能的发挥依赖其细胞膜定位。
张荣胜[10]2012年在《水稻细菌性条斑病菌遗传多样性研究与生防菌剂研发》文中研究指明水稻细菌性条斑病由Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Xooc)引起,是水稻生产中一种重要的检疫性病害,其发生具有流行性、暴发性和毁灭性等特点。该病是我国南方稻区生产的重要病害,当气候条件适宜时,在感病品种上能引起15%～25%产量损失,严重时达40%～60%,对水稻的高产稳产造成严重威胁。品种抗病性是寄主与病原物互作的结果,深入了解病原物群体遗传结构的变化,可作为抗性基因合理分布的依据。主要研究如下：本文通过rep-PCR指纹技术,分析了来源于江苏、云南、江西、湖南和安徽等省份69个水稻细菌性条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola)群体遗传多样性。用2对特异性引物BOX和ERIC对菌株基因组DNA进行了PCR扩增,以彼此间的带位相似率达80%为界,BOX扩增的谱型被分为10簇,ERIC的谱型被分为8簇。BOX的第3簇包含27个菌株,占总数的39.1%,ERIC的第5簇包含24个菌株,占总数的34.8%,均为优势簇。群体遗传多样性值BOX为0.9784,ERIC为0.9833。说明水稻细菌性条斑病菌群体的遗传分化明显,遗传多样性较高。全部69株菌株接种于含有不同抗病基因近等基因系及高感品种金刚30等6个鉴别品种上,被划分为13个致病型,其中C6致病型占26.1%,为优势致病型。69个菌株的BOX、ERIC的簇群分类与地理位置相关,与致病型不相关。其次对来源于江苏、云南、江西、湖南和安徽等省细菌性条斑病菌菌株,通过采用苗期注射接种和成株期针刺接种法,研究其在6个鉴别品种(金刚30、IRBB4、 IRBB5、IRBB14、IRBB21和IRBB24)上致病力分化及其对水稻幼苗和成株致病力差异,为品种布局和条斑病菌致病力快速鉴定提供理论依据。试验结果显示,71个条斑病菌菌株在苗期和成株期可分别区分为18个和13个致病型；苗期的优势致病型为C1,占供试菌株总数的17.0%；成株期的优势致病型为C10,占供试菌株总数的25.4%。研究还表明：大多数菌株与水稻品种之间表现为弱互作关系,只有一部分菌株表现为强互作关系。就单个菌株而言,在苗期和成株期的致病力分化是不一致的。整体而言,71个菌株在6个鉴别品种的苗期上可侵染241次,侵染率为56.6%；在成株期上有245次侵染,总侵染率为57.5%。病原菌在不同水稻品种的苗期和成株期上的侵染能力是基本相同的。同时采集江苏省南京、泰州、扬州和宿迁等地区水稻田水稻病叶、健叶、根围土等样品90份,分离纯化得到1173个细菌分离物,对其进行水稻细菌性条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola)皿内抑制试验,共获得12株拮抗能力较强的细菌,其中4株拮抗细菌抑菌圈直径大于27mm。盆栽试验结果表明,12株拮抗能力较强的细菌中有4株对水稻细菌性条斑病防效大于50%。其中菌株Lx-11盆栽防效达62.5%,大田示范试验防效达60.2%,显着高于化学药剂20%叶枯唑的防效(51.2%和45.8%)。通过形态特征、理化特性和分子鉴定结果确定菌株Lx-11为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens.对前期筛选获得和在田间试验中防治水稻细菌性条斑病效果较好的解淀粉芽孢杆菌Lx-11,通过Plackett-Burman单因素筛选及Box-Behnken响应曲面法(response surface methodology, RSM)对影响生防菌株Lx-11生物发酵工艺进行了优化。试验结果表明,培养温度、通气量和接种量是影响发酵活菌数和抑菌活性的主要因子,由所得响应曲面方程预测出这3个主要因子分别为30.84℃、59.68mL/250mL和1.52%时,发酵活菌数和抑菌活性的最大值为3.75×109cm·mL-1和8.2mm。经摇瓶发酵试验和抑菌活性验证该理论预测值与实际值无显着差异。Lx-11菌株分泌的脂肽类抗生素物质包括surfactin, bacillomycin D和fengycin叁大类,通过构建surfactin突变体菌株发现surfactin在防治细菌性条斑病中起主要作用。生防菌处理水稻植株后能够诱导植株防卫反应相关基因PR-la、PR-1b、NPR1和PAL基因的表达,并在处理24小时后达到最大值,表明Lx-11菌株引发植株产生系统免疫反应。
参考文献：
[1]. 水稻细菌性条斑病抗性QTL qBlsr5a的精细定位及候选基因的表达分析[D]. 韩庆典. 福建农林大学. 2008
[2]. 水稻对细菌性条斑病菌侵染反应的分子机理研究[D]. 曾建敏. 福建农林大学. 2003
[3]. 水稻细菌性条斑病菌中hshB基因及其所在基因簇功能的研究[D]. 宋志伟. 南京农业大学. 2015
[4]. 水稻条斑病菌hrp基因簇功能分析及hcm1转基因水稻的研究[D]. 李玉蓉. 南京农业大学. 2010
[5]. 水稻黄单胞杆菌的分子标记与致病相关因子的鉴定[D]. 冯雯杰. 山东农业大学. 2014
[6]. 非寄主抗病抑制子AvrRxo1的双功能结构域鉴定[D]. 常清乐. 山东农业大学. 2013
[7]. 水稻细菌性条斑病侵染水稻明恢63诱导差异蛋白质组学研究[D]. 黄青云. 厦门大学. 2006
[8]. OsbHLH81基因在水稻抗条斑病和白叶枯病中的功能鉴定[D]. 左丽萍. 山东农业大学. 2018
[9]. AvrRxo1调控水稻维生素B6合成影响水稻对条斑病抗性[D]. 刘海峰. 山东农业大学. 2015
[10]. 水稻细菌性条斑病菌遗传多样性研究与生防菌剂研发[D]. 张荣胜. 南京农业大学. 2012
标签：植物保护论文; 水稻论文; 启动子论文; 同源重组论文; 水稻品种论文; 基因合成论文; 突变理论论文; 同源基因论文; 调控论文; genbank论文;