张立海 王娇 谭柏宏 尹智冲 王跃生 黄文丽 尹彦斌
【摘 要】 目的 观察Roux-en-Y胃转流术对链脲佐菌素造模的糖尿病大鼠血糖控制效果及各组大鼠血清Angptl3在不同阶段水平的变化，探讨Angptl3与2型糖尿病的关系以及Roux-en-Y胃转流术对其影响。方法 分别取链脲佐菌素造模成功的T2DM健康雄性大鼠及周龄相当的非造模健康雄性大鼠各20只。将其随即分为T2DM手术组（DRO组）、T2DM假手术组（DSO组）、正常手术组（NRO组）、正常假手术组（NSO组），每组各10只。分别检测各组大鼠手术前、手术后第1周、手术后第4周 及手术后第8周体重、空腹血糖、血清胰岛素及血清Angptl3水平，观测其变化，并分析其相关性。结果 术前，DRO组与DSO组及NRO 组与NSO组组间比较，各组组内大鼠的体重、FPG 、INS、血清Angptl3水平差异均无统计学意义（P＞0.05）；在DRO组及DSO组中FPG 、INS 、血清Angptl3水平均明显高于NRO 组（P＜0.01）与NSO组（P＜0.01）。术后第1 周，DRO组体重、 FPG 、INS 、血清Angptl3水平较术前均有所下降，除体重（P＞0.05）外，其余指标与术前相比均有显著性差异（P＜0.05）；术后第 4 周，DRO组体重、 FPG 、INS 、血清Angptl3水平较术前及术后第1周均有所下降，除体重（P＞0.05）外，其余指标与术前相比均有显著性差异（P＜0.05）；术后第8周，DRO组上诉各项指标水平在大鼠血清中的水平进一步下降，除体重（P＞0.05）外，其余指标与术前相比均有显著性差异（P＜0.01）。除DRO组外其余三组组间，术前、术后第1周、术后第4周及术后第8周，体重、FPG 、INS 及血清Angptl3水平进行比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。在手术前、手术后第1周、手术后4周及术后第8周中，血清Angptl3水平与其对应的血清 INS 水平在DRO组与DSO组中均呈正相关（P＜0.01），其相关系数分别为r=0.858，r=0.422。结论 Roux-en-Y 胃转流术能有效降低T2DM大鼠血糖，胃转流术控制血糖可能部分是通过降低Angptl3的分泌进而降低胰岛素抵抗，Roux-en-Y胃转流术对正常大鼠血糖无影响。
【关键词】 Roux-en-Y胃转流术； 2型糖尿病； Angptl3； 血糖； 胰岛素； 胰岛素抵抗
Research of Angptl3 in gastric bypass for the treatment of type 2 diabetes mellitus in rats
【Abstract】 Objective To observe the effect and the possible role of Roux-en-Y gastric bypass on blood glucose of streptozotocin diabetic rats and level of serum Angptl3 of rats in different phases.To explore the relationship between Angptl3 and type 2 diabetes . Methods The twenty healthy male rats were selected and twenty SD male rats with T2DM were selected at the same time .Then they were randomly divided into 4 groups : T2DM-Roux-en-Y Gastric Bypass group（DRO group），T2DM-sham operation group（DSO group），operation group（NRO group) and normal-sham operation group（NSO group），10 rats in each group . Detect the following medical Indexes: their weight, plasma glucose（FPG) level, serum insulin (INS) level and Chemerin level, which were determined by ELISA before operation and on week 4，8 after operation，respectively. To observe the change of these indicators and to analyze the correlation between them. Results Before operation, DRO group compared with DSO group and NRO group compared with NSO group that the weight, FPG level,INS level and Chemerin leve were not statistically significant (P > 0.05); however,FPG level, INS level and Chemerin level in both DRO group and DSO group were significantly higher than those in NRO group respectively (P＜0.01); it had the same result that NSO group compared with DRO group and DSOgroup (P＜0.01).On first weeks after operation, FPG, INS, body weight, serum level of Angptl3 were decreased, other indexes compared with those before operation were significantly different (P < 0.05) ,in addition to body weight (P > 0.05),in DRO group. On fourth weeks after operation, FPG, INS, body weight, serum Angptl3 level was decreased than first weeks after operation, other indexes compared with those before operation were significantly different (P < 0.05), in addition tobody weight (P > 0.05),in DRO group. On eighth weeks after operation, level of appeal indices to further decline in serum of rats, other indexes compared with those before operation were significantly different (P < 0.01), in addition to body weight (P > 0.05), in DRO group. The weight, FPG, INS and Angptl3 level in serum, were not statistically significant (P > 0.05) on preoperative, first weeks after operation, fourth weeks after operation and eighth weeks after operation , in the other three groups except in the DRO group. The level of serum INS and serum Angptl3 in the corresponding were positively correlated in the DRO group and DSO group (P < 0.01),on preoperative, first week after operation, operation after eighth weeks and 4 weeks after operation. The correlation coefficients were respectively r=0.858, r=0.422. Conclusions Roux-en-Y gastric bypass surgery can effectively reduce the blood glucose in T2DM rats, it may be partly by reducing the secretion of Angptl3 that gastric bypass control blood glucose and reduce insulin resistance. Roux-en-Y gastric bypass surgery does not have effect on normal rats.
【Key words】 Roux-en-Y gastric bypass; Type 2 diabetes mellitus; weight; Plasma glucose; Chemerin; Insulin
近二十年来，随着我国经济的发展， T2DM已成为威迫我国国民生命和健康的首要疾病之一，已成为迫切需要解决的重大公共卫生问题。当前全世界约有2.8亿的糖尿病患者，发病率逐年升高，并呈现年轻化趋势，其中90%为2型糖尿病[1]，当前发现一类与血管再生密切相关的生长因子家族：血管生成素。现在已知的血管生成因子和一组血管生成素样蛋[2]白是两个家庭的成员。ANGPTL3具备血管生成素家庭成员近似的结构特性[3]，是一种分泌性蛋白因子[4]。ANGPTL3在调节脂肪代谢、胰岛素抵抗及预防并治疗糖尿病高脂血症等方面均起着重要的作用，同时也表明ANGPTL3与2型糖尿病是密不可分的，但具体的机制目前还不是十分明确，深入研究探讨ANGPTL3及其受体表达的特性，以及其与 2型糖尿病的相关性，有助于为预防及治疗2型糖尿病及其他代谢综合征开辟新的医疗手段，通过不断的对ANGPTL3作用的深入研究，ANGPTL3有望成为2型糖尿病早期诊断与治疗的有效靶点。
材料与方法
1．实验动物
SPE级SD成年雄性大鼠80只 ,体重260±20 g/只, 8周龄,购自佳木斯大学动物实验中心。
2．主要试剂及仪器
大鼠Angptl3、胰岛素Elisa试剂盒、小鼠血管生成素样蛋白3（ANGPTL3）ELISA试剂盒（日本IBL），链脲佐菌素（STZ）（上海劲马实验设备有限公司），血糖试纸、血糖仪（上海强生医疗器材有限公司）,戊巴比妥钠(北京普博斯生物科技有限公司),手术器械、超净工作台（上海医疗器械集团有限公司），离心机（美国）。
3．实验方法
3.1 T2DM大鼠模型的建立
依据参考文献[5]2型糖尿病大鼠造模方法：选取SPF级SD成年雄性（3月龄）大鼠80只,体重280±30克/只，利用随机数子分组法分为两组，正常组（40 只）成模组（40 只），正常组用基础饲料喂养，成模组用富含高脂饲料（88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和 0.2%胆盐）喂养。在喂养的第 28 天，不给予任何食物，空腹过夜，在第 29 天上午采尾血测定血糖和血脂。取样后给予成膜组大鼠一次性腹腔注射 STZ 40mg/kg。七天后取尾血测血糖，以血糖 > 16.7mmol/L 为糖尿病，造模成功。
3.2 实验动物分组
取已成模成功的大鼠二十只，随机分为2型糖尿病RYGBP手术组（DRO组）和2型糖尿病假手术组（DSO组）各十只。另将正常组大鼠随机分为正常RYGBP手术组（NRO组）和正常假手术组（NSO组）各十只。
3.3 手术
术前：完善手术操作大鼠的禁食、麻醉、备皮、应用抗生素、消毒铺巾等一系列的准备工作。
手术：通过查阅大量的文献[6]以及综合预实验所得结果，采取最适宜的RYGBP手术方式: 麻醉满意后行上腹部正中切口长约4 cm,丝线结扎胃远端,距Treitz韧带10 cm处切断空肠,远端空肠与近端胃后壁吻合,距胃肠吻合口远端10 cm行空肠端侧吻合,所有吻合均采用7-0无创伤绵纶线间断缝合。
术后：术后当天仍然禁食，术后第二天仍禁食，仅给予糖盐水。待大鼠排便后，给予适量流食，逐渐过渡到正常饮食。
4．检测指标
4.1体重检测
分别于手术前、手术后第1周、第4周和第8周测量各组大鼠的空腹体重。
4.2空腹血糖（FPG）检测
分别于术前及术后第1、 4 周、8 周取大鼠尾静脉血测量大鼠空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)。
4.3酶联免疫吸附分析（ELISA ）检测血清ANGPTL3
分别于术前及术后第1周、 4 周、8 周大鼠禁食 12h 以上，取尾血 2ml，ELISA 法统一检测血清ANGPTL3水平。操作按试剂盒说明书进行, 通过绘制标准曲线计算标本中ANGPTL3浓度。检测范围：0.31-20ng/ml。检测灵敏度： ANGPTL3最低检测浓度小于0.04ng/ml。
4.4酶联免疫吸附分析（ELISA）检测血清胰岛素insulin（INS）
采用 ELISA 法检测各组大鼠术前及术后第1周、 4 周、8 周的空腹血清胰岛素insulin（INS）水平，具体操作方法同ANGPTL3检测。
5．统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,数据以均数±标准差( x±s)表示,定量资料比较采用正态分布检验及方差分析,检验水准α=0.05。计数资料间的比较采用χ2检验，不满足χ2检验应用条件的资料，采用Fisher精确概率法，以 P＜0.05 为差异具有统计学意义。
结 果
1．体重
术前：各组大鼠体重水平无明显差异（P＞0.05）。术后：DRO组体重呈下降趋势，但无统计学差异（P＞0.05）；DSO组、NRO组、NSO组大鼠第1、4、8周体重逐渐升高，与术前相比都具有统计学意义（P＜0.01），见表1。
2．空腹血糖（FPG） 水平变化
术前：DRO组与DSO组和NRO组与NSO组FPG的差异无统计学意义（P＞0.05）；但在FPG水平上做比较，DRO组明显高于NRO组（P<0.01），DSO组明显高于NSO组（P＜0.01）。术后：DRO组第1周FPG水平与术前相比有所下降，有统计学意义（P＜0.05）；DRO第4周FPG较术前下降，有统计学意义（P＜0.05）；DRO第8周FPG较术前下降，有统计学意义（P＜0.01）；DSO组、NRO组、NSO组术前与术后第1、4、8周FPG水平相比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。
3．血清胰岛素（INS） 水平变化
术前：DRO组与DSO组和NRO组与NSO组INS水平上的差异无统计学意义（P＞0.05）；但在INS水平上做比较，DRO组明显高于NRO组（P<0.01），DSO组明显高于NSO组（P＜0.01）。术后：与术前相比，DRO组术后第1周、第4周和第8周INS水平明显下降，分别具有统计学意义（P＜0.01）；DSO组、NRO组、NSO组术后各时相与术前相比，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。
4．血清血管生成素样蛋白3（Angptl3）水平变化
术前：DRO组与DSO组和NRO组与NSO组Angptl3水平上的差异无统计学意义（P＞0.05）；但在Angptl3水平上做比较，DRO组明显高于NRO组（P<0.01），DSO组明显高于NSO组（P＜0.01）。术后：与术前相比，DRO组术后第1周、第4周和第8周Angptl3水平明显下降，分别具有统计学意义（P＜0.01）；DSO组、NRO组、NSO组术后各时相与术前相比，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表4。
5．血清Angptl3与体重、FPG及INS之间的相关性分析
DRO组Angptl3与INS呈正相关 （r=0.858，P＜0.01），与FPG呈正相关（r=0.855，P＜0.01），与体重无相关 （P＞0.05）；DSO组Angptl3与INS也呈正相关（r=0.422，P＜0.01），与体重及FPG无相关（P＞0.05）；NRO组及NSO组中Angptl3与体重、FPG及INS之间均无相关性（P＞0.05）。
讨 论
2型糖尿病是一种营养代谢型疾病，其特征为胰岛素抵抗或胰岛素相对分泌不足，临床表现为：高血糖、多饮、多食、多尿、体重减轻。传统的治疗方法为节制饮食、适当的体育运动、应用降糖药物、使用胰岛素等。由于患者的依从性比较差，血糖不能得到很好的控制，甚至出现了糖尿病的一系列并发症。寻找新的治疗糖尿病的方法成为近年来大量学者及临床医务人员追寻的目标，在手术治疗糖尿病方面，取得了一定的进展。目前已开展的Roux-en-Y胃转流术（RYGBP）在临床上被广泛应用，胃转流手术（GBP）拥有更小的创伤，更低的风险，更快的恢复，并且无复发；术后大部分患者出院之前在停用了胰岛素和降糖药物后，血糖依然维持在正常范围之内，还能有效的控制糖尿病的一系列并发症越来越受到患者的青睐。
以往的研究表明：胃转流手术术后可将2型糖尿病的血糖等指标降低，甚至控制在正常范围内；可降低或治愈2型糖尿病的一系列并发症；能控制糖尿病前期患者的各项生理指标，阻止其发展为2型糖尿病。
本研究结果显示：DRO组FPG术后第1、4、8周血糖呈进行性下降，并且都具有统计学意义；其余3组术前与术后各时相PFG都无明显的意义，差异无统计学意义。这些研究结果表明RYGBP可明显的降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖，而对正常大鼠的空腹血糖不产生影响，同以往的研究相符[7]：胃转流术可有效的治疗2型糖尿病。
ANGPTL3最近被发现的与血管新生密切相关的生长因子家族，ANGPTL3在调节脂肪代谢、胰岛素抵抗及预防并治疗糖尿病高脂血症等方面均起着重要的作用，贯穿于2型糖尿病的发生发展整个过程中。本研究结果发现：术前DRO组及DSO 组与NRO 组及NSO 组ANGPTL3及INS水平差异无统计学意义，在DRO和DSO组中血清ANGPTL3和INS水平明显高于NRO组合NSO组，ANGPTL3与INS呈正相关。手术后DRO组ANGPTL3合INS水平与术前比较明显下降，而其余3组术后各时相与术前相比无明显的变化，综合实验研究表明：1.ANGPTL3可能会增强胰岛素抵抗。2.RYGBP术后2型糖尿病患者病情好转，可能是由于ANGPTL3的表达下降，胰岛素抵抗降低，机体胰岛素敏感性增强，从而血糖得到了良好的控制。这可能成为RYGBP治疗2型糖尿病的机制，但其确定性有待于大量研究证实。
本研究发现，同以往的研究发现一致：RYGBP在一定程度上可控制2型糖尿病大鼠的血糖，而对正常大鼠的血糖无影响。手术后ANGPTL3水平下降，与此同时胰岛素的敏感性上升，这可能是RYGBP治疗2型糖尿病的可能机制之一，有助于为预防及治疗2型糖尿病及其他代谢综合征开辟新的医疗手段，通过不断的对ANGPTL3机制的深入研究， ANGPTL3有可能成为2型糖尿病早期诊断与治疗的有效靶点。
参考文献
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[2]Witzenbichler B,MaisonPierre Pc, Jones P,et al.Chemotactic properties of angiopoietin-land-2,ligands for the endothelial-specific receptor tyrosine kinase Tie2.J Biol Chem,1998,273:18514一18521.
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论文作者:张立海,王娇,谭柏宏,尹智冲,王跃生,黄文丽,尹
论文发表刊物:《中华临床医师杂志》(电子版)2016年4月第7期
论文发表时间:2016/7/18
标签：术后论文; 大鼠论文; 术前论文; 糖尿病论文; 统计学论文; 血糖论文; 血清论文; 《中华临床医师杂志》(电子版)2016年4月第7期论文;