陈平华[1]2001年在《抗线虫基因表达载体质粒构建和遗传转化研究》文中研究表明本研究围绕抗线虫基因的遗传转化展开，主要内容包括：1.植物表达载体的构建；2.农杆菌介导的遗传转化试验；3.基因枪法遗传转化研究；4.抗性植株的分子鉴定。 提取克隆载体P1832，用NcoI酶切，经klenow补平，再经SacI酶切，切下完整的基因片段，然后用低熔点胶电泳，回收小片段；提取表达载体pBI121，用SmaI和SacI双酶切，用低熔点胶电泳，回收大片段；pBI121大片段和P1832小片段按1：3的浓度比混合，用T4 DNA ligase连接，11℃保温16-18小时后，反应液直接转化E.coli感受态细胞，在含K100mg/L的LB固体培养基上涂板，在设立对照的情况下，对长出的抗性单菌落提取质粒进行酶切鉴定，对正确的重组子取名为pBI1812/DH5α并进行扩增，提取质粒转化农杆菌Agrobacterium LBA4404，对抗性单菌落进行直接PCR鉴定，获得pBI1812/LBA4404农杆菌株，含35s启动子，用于对双子叶植物材料的遗传转化试验。 同样的方法，提取克隆载体P1832，用NcoI酶切，经Klenow酶补平，再经SacI酶切，切下完整的基因片段，然后用低熔点胶电泳，回收小片段；提取表达载体pBIL-2，用KpnI酶切，经T4 DNA polymerase补平，再经SacI酶切，低熔点胶电泳回收大片段；pBIL-2大片段和P1832小片段按1：3的浓度比混合，用T4 DNA ligase连接，同样直接转化E.coli感受态细胞并涂板，提质粒鉴定、扩增、转化农杆菌，经鉴定获得pBI18-2/LBA4404农杆菌株，含Ubi启动子，用于单子叶植物的遗传转化试验。 取甘蔗高产、高糖商业品种ROC16、福农93-3608的梢部，在超净工作台上取心叶，横切为厚2mm左右的圆片，接种于MS＋3mg/L 2,4-D的固体培养基上，25℃，暗室内诱导愈伤组织；取生长良好的胚性愈伤组织，在MS＋BA2mg/L＋NAA0.1mg/L＋CaCl2 4.4g/L的培养基上预培养2天，用含100μmol/LAcetosyringone（Aldrich）固体培养基上共培养3天，然后诱导筛选抗性愈伤组织，最后分化成苗。再取甘蔗胚性愈伤组织，选择2mm3大小的颗粒20-30粒，用基因枪PDS-1000/He轰击，选择抗性愈伤组织分化成苗；取大豆无菌 苗，取子叶节，用农杆菌PmyBA44M侵染；对大豆愈伤组织用基国枪 轰击，然后在培养基 1／2 MS＋BA 0．sin＋／L＋IBA 0＊sing／L＋Cef250mg／L＋ K刃mg／L上筛选诱导芽丛。 用微量提取DNA的方法提取抗性苗 DNA，经NR检测，获得T PCR 阳性甘蔗黄化苗3株；大豆早熟1号子叶节经农杆菌侵染后获得抗性再生苗。
陈平华, 许莉萍, 陈如凯[2]2004年在《抗线虫基因表达载体构建与转化甘蔗研究初报》文中进行了进一步梳理试验研究利用德国引进的抗线虫基因Hs1pro 1构建表达载体并转化甘蔗 (SaccharumofficinarumL .) ,以获得抗线虫转基因植株。提取克隆载体P1832用NcoⅠ酶切、Klenow补平和SacⅠ酶切 ,回收基因片段 ;提取表达载体pBIL 1用KpnⅠ酶切、T4DNApolymerase补平和SacⅠ酶切 ,回收大片段 ;目的片段用T4DNAligase连接并转化E .coli,鉴定重组质粒 ;用基因枪轰击转化甘蔗品种“ROC”16获得 16株再生苗 ,其中 4株经PCR检测呈阳性 ,通过Southern杂交 ,证明Hs1pro 1基因已整合到其中 3株甘蔗基因组中
陈平华, 陈如凯, 潘大仁, 许莉萍, 袁照年[3]2003年在《Hs1 pro-1双子叶表达载体构建和转化大豆研究初报》文中研究指明用从德国引进的抗线虫基因Hs1pro-1构建表达载体并转化大豆,以获得抗线虫转基因植株.提取克隆载体p1832,用Nco 酶切、Klenow补平和Sac 酶切,回收基因片段;提取表达载体pBI121,用Sma 和Sac 酶切,回收大片段;目的片段用T4DNA连接酶连接并转化E.coli,鉴定重组质粒;用基因枪轰击转化大豆品种早熟1号,获得18株再生苗,其中3株经PCR检测呈阳性,通过Southern杂交,证明Hs1pro-1基因已整合到其中2株大豆的基因组中.
参考文献：
[1]. 抗线虫基因表达载体质粒构建和遗传转化研究[D]. 陈平华. 福建农林大学. 2001
[2]. 抗线虫基因表达载体构建与转化甘蔗研究初报[J]. 陈平华, 许莉萍, 陈如凯. 中国生态农业学报. 2004
[3]. Hs1 pro-1双子叶表达载体构建和转化大豆研究初报[J]. 陈平华, 陈如凯, 潘大仁, 许莉萍, 袁照年. 福建农业大学学报. 2003