（江苏豪森药业集团有限公司，江苏 连云港 222069）
【摘 要】目的：建立HPLC法测定阿戈美拉汀中的有关物质。方法：采用C18色谱柱，以1%三乙胺溶液（量取10ml三乙胺，加水至1000ml，用磷酸调节pH值至7.0）为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱温为45℃，在276nm紫外波长条件下进行检测。结果：10个已知杂质的分离度和其余未知杂质与阿戈美拉汀均得到有效的分离。结论：本测定方法准确可靠、专属性强、灵敏度高、重复性好，适用于阿戈美拉汀杂质的测定。
【关键词】阿戈美拉汀；杂质测定；梯度洗脱；高效液相色谱；
中图分类号： 文献标识码： 文章编号：
[ 中图分类号 ]R2[ 文献标号 ]A[ 文章编号 ]2095-7165（2018）18-0297-02
引 言
阿戈美拉汀是一种新型的抗抑郁药，为褪黑激素受体激动剂和5-羟色胺(5-HT)2C受体拮抗剂。该药对重度抑郁症(MMD)疗效明显，不良反应小，能有效调整生物节律、改善睡眠质量,而无性功能障碍和撤药症状[1~2]。法国Servier开发研制的阿戈美拉汀为褪黑素的生物（电子）等排体类似物，其以萘核取代了吲哚环，使其褪黑素更具代谢稳定性[3]。药物成品会因合成工艺、起始原料、中间体和药物降解而产生一些杂质，这些杂质会影响药物疗效，甚至产生不良反应，必须严格控制[4~6]。目前国内有报道采用RP-HPLC法测定阿戈美拉汀原料药中的有关物质，但其对杂质的控制个数较少。本研究在参照中国药典2015年版有关物质相关指导原则[7]，进行大量的实验摸索，确定HPLC梯度洗脱的方法对本品中有关物质进行控制。
1 实验部分
1.1 仪器与试药
Agilent1260高效液相色谱仪，G1314F VWD与G1315D DAD检测器，
Chemstation色谱工作站，Phenomenex公司Luna C18色谱柱（200mm×4.6mm，5μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂）。
阿戈美拉汀及各已知杂质均由江苏豪森药业集团有限公司提供；乙腈（MERCK公司）为色谱纯；三乙胺（TEDIA公司）为色谱纯；磷酸（国药集团化学试剂公司）为分析纯；水为自制纯化水。
1.2 色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以1%三乙胺溶液（量取10ml三乙胺，加水至1000ml，用磷酸调节pH值至7.0）为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱（B相0min,0%；25min,60%；35min,60%；38min,65%;42min,65%；45 min,20%；50min,20%）；流速1.0ml/min，检测波长为276nm；柱温为45℃，进样量20μl。
1.3 溶液配制
1.3.1 稀释液 1%三乙胺溶液—乙腈（55︰45）。
1.3.2 供试品溶液 分取阿戈美拉汀中间体2、中间体3、中间体4、中间体6、中间体7、杂质C、杂质A、杂质B、起始原料A、杂质D和阿戈美拉汀对照品适量，精密称定，加稀释液溶解并定量制成每1ml中含1mg的溶液，备用。
1.4 方法学考察
1.4.1 专属性试验
在1.2的色谱条件下，对1.3.2项下的起始原料A和各主要中间体及杂质A、杂质B、杂质C进行检测，各杂质的分离度均符合规定，系统适用性良好，色谱图见下图。
1-中间体4；2-杂质C；3-中间体6；4-阿戈美拉汀；5-杂质D；6-起始原料A；7-中间体7；8-中间体3；9-中间体2；10-杂质A；11-杂质B。
有关物质专属性图
1.4.2 强制降解试验
储备液：取样品约100mg至50ml量瓶中，用稀释液配制成每1ml含阿戈美拉汀2mg的溶液，作为储备液。分别移取储备液适量，在酸（1mol/L HCl）、碱（1mol/L NaOH）、氧化（10%H2O2）、高温（固体105℃）、热解（80℃水浴）、光照（4500lx）24小时，考察阿戈美拉汀降解情况，将上述7种样品在1.2的色谱条件下分别进样，结果表明各破坏条件下的主峰峰纯度均小于纯度阈值，主峰峰纯度良好，主峰与各杂质峰分离度均大于1.5。
1.4.3 线性关系考察
分别取阿戈美拉汀及相关杂质，用稀释液制备杂质限度水平相当的系列浓度溶液。精密量取测试溶液各20μl，注入液相色谱仪中，记录色谱图，量取峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，①中间体2，0.200μg/ml～1.202μg/ml；A=11.63×C+0.100，r＝0.9980；②中间体3，0.201μg/ml～1.207μg/ml；A=32.59×C+0.895，r＝0.9980；③中间体4，0.198μg/ml～1.186μg/ml；A = 24.90×C+0.012，r＝0.9985；④中间体6，0.198μg/ml～1.190μg/ml；A=19.97×C+0.109，r＝0.9980；⑤中间体7，0.199μg/ml～1.193μg/ml；A=32.42×C+0.402，r＝0.9985；⑥杂质C，0.176μg/ml～1.054μg/ml；A=24.95×C+0.448，r＝0.9960；⑦杂质A，0.200μg/ml～1.202μg/ml；A=24.94×C+0.576，r＝0.9960；⑧杂质B，0.203μg/ml～1.217μg/ml；A=25.98×C+0.001，r＝0.9985；⑨起始原料A，0.195μg/ml～1.171μg/ml，A=5.249×C+0.058，r＝0.9970；⑩杂质D，0.233μg/ml～1.395μg/ml；A=13.0220×C-0.8520，r＝0.9991；阿戈美拉汀，0.198μg/ml～1.189μg/ml， A = 26.20×C+0.138，r＝0.9970。
1.4.4 检测限定量限测定
在1.2的色谱条件下，配制不同浓度的样品溶液，分别进样确定本品与各杂质的检测限（S/N为2~3）和定量限（S/N为8~10）。起始原料A、中间体2、中间体3、中间体4、中间体6、中间体7、杂质C、杂质A、杂质B、杂质D及阿戈美拉汀的最低检出限分别为6.4ng、1.9ng、1.0ng、0.7ng、1.0ng、1.0ng、0.8ng、1.9ng、1.9ng、2.8ng、1.0ng，与检测样品浓度的比值分别为0.03%、0.01%、0.005%、0.004%、0.005%、0.005%、0.004%、0.01%、0.01%、0.01%、0.005%；
起始原料A、中间体2、中间体3、中间体4、中间体6、中间体7、杂质C、杂质A、杂质B、杂质D及阿戈美拉汀的最低定量限分别为16.0ng、6.4ng、3.2ng、2.4ng、3.2ng、3.2ng、2.7ng、6.4ng、6.4ng、8.4ng、3.2ng，与检测样品浓度的比值分别为0.08%、0.03%、0.02%、0.01%、0.02%、0.02%、0.01%、0.03%、0.03%、0.02%、0.04%。
1.4.5 精密度试验
取样品由不同人员在不同仪器上，用不同色谱柱进行检测，结果显示人员A、B、C分别用不同仪器测定6次，各已知杂质均未检出；最大未知单杂的平均值为0.07%，SD=0%；总杂的平均值为0.48%，SD=0.01%。说明本方法通用性很好，不同仪器、不同时间及不同人员的差异很小。
1.4.6 重复性试验
取样品在1.2色谱条件下重复6次测定，各已知杂质均未检出；最大未知单杂平均值为0.08%，SD=0.01%；总杂质平均值为0.17%，SD=0.005%，说明本方法重复性很好。
1.4.7 耐用性试验
在1.2的色谱条件下，将流动相A的pH值和柱温进行小范围的变动，①改变柱温±2℃，主峰前杂和主峰分离度R在2.1～2.3之间，拖尾因子为1.04。②改变流动相pH±0.2，主峰前杂和主峰分离度R都为2.2，拖尾因子为1.04。结果表明各检测条件均能满足有关物质检测要求，本方法的耐用性很好。
1.4.8 溶液稳定性试验
取样品在1.2色谱条件下检测，结果显示总杂在0小时检出为0.23%，放置24小时后检出为0.24%；说明样品在稀释液中24小时内非常稳定。
2.结论
本文开发了一种准确可靠的HPLC方法，能对阿戈美拉汀中的有关物质进行有效的控制，并且对工艺中的杂质进行了全面的分析控制。通过检索，没有找到该品种关于有关物质的标准制定依据。
参考文献
[1] Luis S，Belen A． Agomelatine: a novel mechanism of anti-depressant action involving the melatonergic and serotonergicsystem[J]． Europ Psychinary，2008，2( 1): 1~7。
[2] 胡茂荣，陈晋东，李乐华，等。阿戈美拉汀：一种新型抗抑郁药[J]，中国新药与临床杂志2009，（02）：81-85。
[3] 王轩，马红敏，周宜遂。阿戈美拉汀合成路线图解[J]，中国药物化学杂志，2012，（04）：334-336+340。
[4] 张哲峰。药物杂质研究中风险控制的几个关键问题[J]，现代药物与临床，2010，25（5）：327-333。
[5] 谢沐风。再谈仿制药研发中杂质研究思路之我见[J]，中国医药工业杂质，2015，46（5）：538-546。
[6] 戚立凯，狄斌。药物杂质研究方法最新进展[J]，中国药科大学学报，2015，46（3）：257-263。
[7] 中国药典2015年版四部[S]，2015：374，375，376。
Determination of related substances in Agomelatine by HPLC
Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Co., Ltd.，Jiangsu Lianyungang 222069
Abstract:Objective To establish a method for the determination of impurity in Agomelatine by HPLC. Methods The column（Phenomenex Luna C18 200×4.6mm 5μm) was used. The mobile phase A was consisted of 1% triethylamine(TEA) (pH adjusted to 7.0 by phosphoric acid，shake). The mobile phase B was acetonitrile and gradient elution. The flow rate was 1ml/min. The column temperature was 45℃.The detection wavelength was 276nm. The injection volume was 20μl. Results Agomelatine and the other related substances can be separated effectively under the above chromatographic conditions.Conclusion The method is accurate and reliable, has strong specificity, high sensitivity and good repeatability, and is suitable for the determination of impurity in Agomelatine.
Keywords: Agomelatine;impurity determination;gradient elution;HPLC
论文作者:张翠,掌效舟,孙井龙,李赛,顾娟
论文发表刊物: 《医师在线》2018年9月18期
论文发表时间:2019/3/15
标签：杂质论文; 中间体论文; 色谱论文; 溶液论文; 条件下论文; 乙胺论文; 主峰论文; 《医师在线》2018年9月18期论文;