郭宏强[1]2003年在《PCR检测淋巴细胞恶性增殖性疾病基因重排在临床中的应用》文中研究表明一、背景 近年来，淋巴细胞恶性增殖性疾病的发病率逐年上升，但是，对其明确诊断却存在一些困难，同时，患者治疗后对其疗效评价、预后评估、是否需要维持治疗及维持时间多长的判断都存在困难。因此，寻找一个快速、特异性强、敏感性高的方法用于临床评估淋巴细胞恶性增殖性疾病正日益受到人们的重视。 B和T淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟，由于受外界抗原的刺激，其抗原受体(Ig和TCR)基因必须通过基因重排才能形成有功能的基因。因此每个淋巴细胞的抗原受体基因编码完全不同。在淋巴细胞分化发育的某一阶段，一旦某一个淋巴细胞发生恶性转化，进而单克隆增生，就会形成恶性病变。正常人和淋巴结炎患者的抗原受体(Ig和TCR)基因由于重排的多样性，经PCR扩增后，其基因片段长短不一，电泳后就会呈现弥散状(smear)。如果为恶性病变，由于是单克隆增生(少数为双克隆或寡克隆)，经PCR扩增后，电泳出现一条明显的带(或两条带)。因此，通过这种方法可以鉴别良、恶性病变，并可对临床上的一些疑难病例进行明确诊断。 随着治疗手段的不断改进，淋巴系统恶性增殖性疾病的完全缓解率和持续缓解时间均明显提高，预防复发逐渐成为治疗的关键。复发的主要原因为缓解后体内仍残留恶性细胞。一般常规形态学检查不能发现的那一部分肿瘤细胞，被称为微小残留病灶(MRD)。应用PCR法可以从10~6个正常细胞中检测到一个恶性细胞。因此通过应用PCR检测MRD可以评价疗效，评估预后，指导临床治疗。 本课题通过研究免疫球蛋白重链(IgH)和T细胞受体-γ(TCR-γ)基因郑州大学硕士研究生论文(2003)PCR检测淋巴细胞恶性增殖性疾病基因重排在临床中的应用重排，来探索它在淋巴系统增殖性疾病中的作用，为基因重排在淋巴系统恶性增殖性疾病的诊断、疗效评价、预后评估及指导治疗方面提供理论基础和临床应用价值。 二、材料与方法 (一)标本和组织 1)共收集经病理学明确诊断为非霍奇金淋巴瘤的32例患者的外周血标本、31例骨髓标本及3例石蜡包埋组织标本和8例急性淋巴细胞白血病患者的外周血标本。病例选自郑州大学第一附属医院肿瘤科和血液科。另选1例正常人的外周血作为对照。 2)切取省内几家病理科1996一1998年间巧例单纯依赖形态学诊断为淋巴瘤的蜡块包埋组织和22例诊断为淋巴结炎的石蜡包埋组织及14例诊断为淋巴结核的蜡块组织。 3)新近的4例经省内多家医院病理科会诊不能明确诊断的疑难病例的石蜡包埋组织标本，此4例均来自郑州大学一附院肿瘤科。 4)5例NHL患者化疗前后的外周血标本，此5例均来自郑州大学一附院肿瘤科。 (二)方法 应用多聚酶链聚合反应法(半巢式PCR和多重PCR)和10%聚丙烯酞胺凝胶电泳及银染来检测基因重排。技术路线蜡外周血丰广髓提取DNAPCR专增10%聚丙烯森凝胶电泳 蕊丰成像分析郑州大学硕士研究生论文(2003)PCR检测淋巴细胞恶性增殖性疾病基因重排在临床中的应用 (叁)统计 采用x“检验进行率与率之间的比较，以P<0.05作为差异显着性标准。 叁、结果 1.对已明确诊断的标本检测，其总阳性率可达89.19%(66/74)，其中急淋100%(8/8)，NHL为87.88%(58/66)。NHL外周血阳性率为84.38%(27/32)，骨髓标本的阳性率为90.32%(28/31)，3例蜡块组织均为阳性。早期NHL患者(I、11期)标本的阳性率为68.00%(17/25)，晚期患者(111、IV期)标本的阳性率为95.12%(39/41)。 2.巧例单纯依赖形态学诊断为淋巴瘤的蜡块组织出现基因重排的阳性率为80%(12/巧)，22例淋巴结炎和14例淋巴结核的蜡块组织基因重排检测发现重排阳性的为47.22%(17/36)。 3.对4例疑难病例的石蜡包埋组织应用基因重排检测发现其中2例出现smear带，而另外两例中，一例发现有TCR一丫重排，另一例为IgH、TcR一Y双重重排。后此4例切片经301医院进行形态学会诊结合免疫组化和临床表现，两例重排为smear的均诊断为淋巴结炎，而另外两例，一例诊断为外周T细胞性淋巴瘤，一例诊断为套细胞性淋巴瘤。 4.对5例患者化疗前后的外周血标本进行观察，化疗前5例均有重排带，化疗后除两例重排带消失外，其余3例仍有重排带，其中2例均已复发，复发的两例中，一例行自体造血干细胞移植支持下的大剂量化疗，另一例进行了二线治疗，现均存活。另外一例仍有重排带的低度恶性NHL一直采用维持治疗，仍存活。无重排带出现的两病例现仍存活，已分别达1.5年，2年。 四、结论: 1.应用PCR法检测基因重排可作为淋巴细胞来源的良、恶性病变的一种辅助诊断手段。当作为NHL诊断手段时，最好采用组织标本(包括冰冻组织、新鲜组织或蜡块组织)进行，次之为骨髓，再次为外周血。 2.应用基因重排检测微小残留病灶(MRD)，对疾病的分期有一定的临床应用价值。 3.分期越晚，基因重排检测率越高。 4.通过基因重排来检测微小残留病灶(MRD)，可以评价疗效，评估预后，指导临床治疗。
耿哲, 黄亮, 王迪, 熊婕, 朱莉[2]2011年在《流式细胞免疫分型联合PCR检测抗原受体基因重排在淋巴增殖性疾病诊断与鉴别诊断中的应用》文中提出背景与目的:淋巴增殖性疾病是一组病理形态、免疫表型、临床特征高度异质性的疾病。本文旨在评价流式细胞免疫分型联合聚合酶链反应(PCR)检测抗原受体基因重排在淋巴增殖性疾病诊断中的应用价值。方法:分离79例拟诊淋巴增殖性疾病患者的新鲜病理标本(淋巴结、脾脏、胃活检组织和肝穿组织),流式细胞术分析细胞的免疫表型特征;同时采用BIOMED-2多重PCR分析组织的抗原受体基因重排状况及其克隆来源;并与病理诊断及免疫组织化学结果进行比对。结果:患者最终确诊为非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma,NHL)37例(46.8%),霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma,HL)3例(3.8%),淋巴组织良性病变34例(43.0%),恶性肿瘤淋巴结转移4例(5.1%)。在19例B-NHL确诊患者中,流式免疫分型和抗原受体基因重排诊断符合率均为94.7%(18例):18例T-NHL确诊患者中,流式免疫分型和抗原受体基因重排诊断符合率分别为72.2%(13例)和50%(9例);在34例淋巴组织良性病变的患者中,流式细胞免疫分型虽未见单克隆幼稚细胞,但有7例(19.4%)抗原受体基因重排呈单克隆性;在3例HL确诊患者中,流式免疫分型未能检测出来,抗原受体基因重排均为多克隆性;4例恶性肿瘤转移患者中(3例转移浸润淋巴结,1例转移浸润肝脏),流式细胞免疫分型均检测到大量异常幼稚细胞,其中3例无特殊抗体标记,另外1例表达幼稚髓系标记;抗原受体基因重排均为多克隆性。结论:应用流式细胞免疫分型联合抗原受体基因重排分析,对于淋巴组织良、恶性增殖的鉴别和不同类型恶性淋巴瘤的诊断,具有很好的辅助价值。
孙振昌[3]2006年在《非霍奇金淋巴瘤外周血基因重排的检测及临床意义》文中进行了进一步梳理背景和目的 近年来，恶性淋巴瘤(ML)的发病率逐年上升，其中非霍奇金淋巴瘤(NHL)占恶性淋巴瘤的89.1％，约为霍奇金淋巴瘤(HD)的7倍。在临床工作中，常规组织形态学和免疫组化等方法对NHL的准确分期、治疗的疗效评价、预后评估、是否需巩固治疗及巩固治疗时间的判断都存在一定困难。因此，需要建立一套基于分子水平的针对NHL诊断、治疗和预后的综合评估体系。 非霍奇金淋巴瘤经化疗后可达到完全缓解，但此时体内仍有约10~6以下的肿瘤细胞，这些残留的肿瘤细胞是导致复发的主要原因，它们被称为微小残留病灶(MRD)，常规检查手段往往不能发现，因此需要有一种更敏感的方法来检测MRD。 从B和T细胞群体上看，每个Ig或TCR基因重排形式各异，即每个淋巴细胞的抗原受体基因编码完全不同。在淋巴细胞分化发育的某一阶段，一旦某一个淋巴细胞发生恶性转化，进而单克隆增生，就会形成恶性病变，其抗原受体基因编码即基因构型是一致的。正常人的外周血中淋巴细胞多为成熟的淋巴细胞，为多克隆性，其抗原受体(Ig和TCR)基因由于重排的多样性，经多聚酶链聚合方法(PCR)扩增后，其基因片断长短不一，电泳后就会呈现弥散状(smear)。非霍奇金淋巴瘤细胞，多为单克隆增生(少数为双克隆或寡／亚克隆)，经PCR扩增后，电泳出现一条明显的条带。实验证明，淋巴组织中正常淋巴细胞有归巢(homing back)现象，淋巴结组织的淋巴细胞可以不断地进入血流又回到淋巴结。因此淋巴瘤的肿瘤细胞亦具有归巢现象，应用PCR法可以从10~6个正常细胞中检测到一个恶性非霍奇金淋巴瘤细胞，因此，应用PCR技术可对非霍奇金淋巴瘤外周血中
张晓飞[4]2003年在《非霍奇金淋巴瘤IgH基因和TCR基因克隆性重排检测及凝胶扫描技术初步研究》文中提出所有正常发育的B细胞和T细胞均要分别进行免疫球蛋白重链(IgH)基因重排和T细胞受体(TCR)基因重排。由于每个淋巴细胞均有自己独特的基因重排，细胞之间重排的差异导致淋巴组织良性增生性疾病表现为多克隆重排。众所周知在恶性肿瘤中，肿瘤细胞起源于同一克隆。在非霍奇金淋巴瘤中表现为IgH基因和/或TCR基因单克隆重排。这是用基因重排检测鉴别淋巴组织良性增生性疾病与恶性淋巴瘤的理论依据及分子病理学基础。近年来运用聚合酶链反应(PCR)技术检测淋巴瘤基因克隆性重排已在国外广泛开展，国内亦有报道。PCR检测IgH基因重排常针对V区序列相对保守的FRⅠ、FRⅡ、FRⅢ及J区序列设计一致的V区及J区引物。其中最常用及检测率最高的是针对FRⅢ引物FR3A。使用FR3A引物，PCR在B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)IgH基因克隆性重排检测率可达60％左右，但FR3APCR常因CDR发生体细胞突变而扩增失败，联合应用其余FR引物可提高PCR-IgH基因克隆性重排检测率。PCR检测TCR基因克隆性重排常针对TCRγ及TCRβ基因靶点来检测。TCRγ基因结构相对简单，并且其重排发生在T细胞发育的早期，几乎在所有的T淋巴细胞肿瘤中均可检测到，因此临床最常靶对TCRγ基因来检测TCR基因的重排。在T细胞非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)中，PCR的TCRγ基因克隆性重排检测率60％左右，TCRβ约为40％，联合检测TCRβ，TCRγ可将TCR基因克隆性重排检测率提高至70％-80％。淋巴瘤基因克隆性重排有时并非型特异性，约5％-10％成熟T-NHL及B-NHL表现为双重重排(表型为B或T的淋巴瘤同时发生IgH基因及TCR基因克隆性重排)。双重重排与它们向恶性转化的关系仍有待阐明，发生双重重排的淋巴瘤病例是否在生物学行为(如增殖)有别于仅发生单克隆重排的淋巴瘤病例， 浙江大学硕土学位论文这些问题国外报道较少，国内也未见报道。目前常采用琼脂糖及聚丙烯酷胺凝胶电泳来检测分析PCR产物，在判断结果时可能多少带点主观，因此我们尝试采用凝胶扫描技术，使在结果判断时可采用相对客观的标准。 我们采用 PCR方法，联合！gH FR3A及 FRZA、TCRY、TCR6引物，检测 125例非霍奇金淋巴瘤（NHL）IgH基因及TCR基冈克隆性重排，以了解在NHL中，各种不同病理类型的肿瘤川不同的引物行PCR方法的克隆性重排的检测率，从而寻求最有效的检测方法，并了解IgH基因及TCR基因克隆性重排检测在非霍奇金淋巴瘤病理诊断中的作用及地位。用免疫组织化学方法检测了其中 117例 NHL的 Ki67蛋白表达，探讨发生双重重排的淋巴瘤与正常的单克隆重排的淋巴瘤在细胞增殖方面有无差异。并对13例良性淋巴组织（5例反应性增生淋巴结，3例慢性扁桃体炎，5例正常人外周血单核细胞）及 65例经FR3APCR及聚丙烯酚胺凝胶电泳检测证实为IgH基因克隆性重排B－NHL病例，采用凝胶扫描技术进行分析，以寻求及验证非霍奇金淋巴瘤单克隆重排判断的相对客观的标准。最后对B－NHL行PCRIgH基因FR3A，T－NHL行TCRY基因克隆性重排检测的敏感性研究。 材料与方法 1 材料：收集 1997－2002年我医学院附属医院及省内其它医院 125例 NHL标本，其中日－NHL96例，T－NHL29例，全部标本经中性福尔马林固定、常规石蜡包埋、4～SPm连续切片，除常规HE染色外，采m免疫组化SP法标记淋巴细胞亚群，根据肿瘤的免疫表型，划分为B－NHL或T－NHL。按照WHO关丁淋巴及造血系统肿瘤分类对所有病例进行分类。 2方法：采用 PCR方法，用 lgH FR3A及 FRZA、TCRY、TCR6引物对 125例 NHL行 IgH基因及 TCR基因克隆性重排检测。并对其中的 117例 NHL采用免疫组化两步法检测 Ki－67蛋白表达。操作按试剂盒说明书进行。将M细胞 DNA及一已知 TCRY克隆性重排T－NHL的DNA与多克隆的正常人淋巴结DNA按不同比例混合以研究IgHFR3APCR及 TCRYPCR基因克隆性重排检测的敏感性。上述试验均设阳性对照及多克隆阴性对照及空白对照。对 13例良性淋巴组织及 65例 IgH基因克隆性重排 BNHL，IgHFR3APCR的扩增产物行聚丙烯酷胺凝胶电泳，并采用凝胶扫描技术进行分析。在扫描曲 3 浙江大学硕土学位论文 线结果分析上，我们设定y轴为相应光密度值，X轴为产物长度。计算hi／hZ比值（hi代 表正常分布曲线以上的最大的峰高，hZ代表上常分布峰的峰高）。免疫组化结果计算增殖 指数：选择有代表性区域，在高倍视野下（40X 10）计数数个高倍视野的全部肿瘤细胞共 达 1000个，同时计数阳性细胞数，计算出增殖指数［（阳性细胞／1000）X 100％］。实验结 果用SPSS统计软件进行统计学处理，组间比较采用one－way检验。 结 果卜 采用FR3A引物，克隆性匕H基因重排在96例B－NHL中检测率为68O（65／96），采用 FRZA引物，检测率为 61o（59／96），联合FR3A，FRZA引物，总检测率为 83％（80／96）。2．TCRY克隆性重排在29例T－NHL中检测率?
陈治宇[5]2006年在《流式细胞术和聚合酶链反应检测B细胞淋巴瘤骨髓侵犯及临床意义的研究》文中研究表明B细胞淋巴瘤(B—cell lymphoma)是起源于B淋巴细胞的恶性增生性疾病，属于一类非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma，NHL)。临床上主要表现为无痛性淋巴结肿大，和霍奇金淋巴瘤相比，更易发生于淋巴结外组织和器官；同时还可以伴有全身症状如发热、盗汗及体重减轻等。根据2000年世界卫生组织关于造血和淋巴系统肿瘤的新分类，B细胞恶性肿瘤可分为十余种，在各种类型的B细胞淋巴瘤中，临床生物学行为具有较大差异，在B细胞淋巴瘤的病程发展过程中，较易发生骨髓侵犯。对有骨髓侵犯的患者，Ann Arbor分期则直接划分为□期，在提示侵袭性淋巴瘤预后的IPI(International Prognostic Index，IPI)分级系统中，结外侵犯的多少作为一个重要的组成部分，对预后有明显影响。判断恶性淋巴瘤骨髓侵犯可以得到3方面的作用：(1)进一步确认和诊断疾病；(2)提供关于分期信息；(3)提供预后危险因素的判断。骨髓活检和骨髓穿刺是临床常用于判断骨髓侵犯的行之有效的形态学方法，而流式细胞技术和分子生物学诊断技术的发展则为骨髓侵犯的判断提供了新的发展方向，在国外，这两种技术已经在判断B细胞淋巴瘤骨髓侵犯中得到了深入研究。本研究则主要着力于应用新的技术在检测中国人B细胞淋巴瘤骨髓侵犯中的地位和作用。本研究包括叁个部分：第一部分流式细胞术在B细胞淋巴瘤患者骨髓检测中的应用研究目的：探讨流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)在检测B细胞淋巴瘤骨髓侵犯中的可行性及有效性，并初步评价其临床病理价值。方法：采用CD45-SSC设门联合叁种不同荧光标记的抗CD45、CD5、CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD43、FMC7、λ和κ抗体在EPICS-XL~(?)型流式细胞仪上对79例B细胞淋巴瘤患者骨髓进行检测，与骨髓细胞形态检测比较。结果：(1)在79例B细胞淋巴瘤患者中，用FCM检测出35例(44.3％)患者有侵犯，而骨髓细胞形态学只检测出16例(20.3％)，两者有显着性差异(P＜0.05)；符合率为60／79(75.9％)。(2)用FCM检测，弥漫大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)及小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)患者在初诊时的侵犯率分别为20.0％、43.8％和100％。(3)对未确定具体类型的4例骨髓侵犯患者，根据免疫表型能够帮助诊断。(4)FCM特异性较好，在非淋巴细胞性白血病中未检出异常，FCM检测的灵敏度在15％。(5)FCM结果阳性率和累及器官、组织学类型、Ann Arbor分期和危险组别有明显关系，在结内和结内外均有累及、惰性淋巴瘤、分期晚以及高-中危组的患者中FCM阳性机会高于相对应的组别(P＜0.001)，有B组症状及复治的患者中FCM检出骨髓侵犯高于相应的组别，但未显示统计学意义(P＞0.05)，与性别、年龄、LDH水平和脾脏侵犯与否无关(P＞0.05)。在初治患者中结果相似。(6)FCM是否阳性和患者治疗后获得完全缓解(complete response，CR)有明确关系，FCM阳性者获得CR的机会低于阴性者，差异具有统计学意义(P＜0.05)，但是在和短期生存的关系中未见FCM结果对其产生影响。结论：FCM是检测B细胞淋巴瘤骨髓侵犯的有效方法，较骨髓细胞形态学敏感；且能够起到辅助诊断的作用；FCM检测的灵敏度在15％左右，Ann Arbor分期晚和惰性淋巴瘤患者中FCM阳性率高于分期早和侵袭性淋巴瘤患者；FCM阳性者治疗后获得CR机会低于阴性患者，对于生存的影响需延长随访时间进一步观察。第二部分聚合酶链反应检测B细胞淋巴瘤骨髓免疫球蛋白重链基因重排的研究目的：探讨聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)在检测B细胞淋巴瘤骨髓侵犯中的可行性及有效性，并初步评价其临床病理价值。方法：采用半巢式PCR方法对105例B细胞淋巴瘤患者骨髓中免疫球蛋白重链(Immunoglobulin heavy chain，IgH)基因的单克隆性重排进行检测，与骨髓细胞形态检测比较。结果：(1)在105例B细胞淋巴瘤患者中，用PCR检测出48例(45.7％)患者有侵犯，而骨髓细胞形态学只检测出22例(21.0％)，两者有显着性差异(P＜0.05)；符合率为71.4％(75／105)。(2)用PCR检测，弥漫大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)及小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)患者在初诊时的侵犯率分别为30.8％、25.0％和100％。(3)PCR检测灵敏度较高，为2-4％。(5)PCR结果阳性率与Ann Arbor分期有明显关系，在分期晚的患者中PCR阳性机会高于相对应的组别(P=0.02)，在年龄大于等于60岁、男性、复治、LDH水平正常以及惰性淋巴瘤患者中高于相应的年龄小于60岁、女性、初治、LDH水平升高以及侵袭性淋巴瘤患者，但未显示统计学意义(P＞0.05)，与累及器官、B组症状、脾脏侵犯与否无明显相关性(P＞0.05)。(6)PCR是否阳性和患者治疗后获得CR有明确关系，PCR阳性者获得CR的机会低于阴性者，差异具有统计学意义(P＜0.05)，但是在和短期生存的关系中未见PCR结果对其产生影响。结论：PCR是检测B细胞淋巴瘤骨髓侵犯的有效方法，较骨髓细胞形态学敏感；PCR检测的灵敏度在2％-4％左右，Ann Arbor分期晚患者中PCR阳性率高于分期早的患者；PCR阳性者治疗后获得CR机会低于阴性患者，对于生存的影响需延长随访时间进一步观察。第叁部分骨髓细胞形态学、FCM免疫表型检测和PCR检测基因重排在B细胞淋巴瘤骨髓侵犯检测中的比较目的：比较骨髓细胞形态学、流式细胞术免疫表型检测和聚合酶链反应检测IgH重排在判断B细胞淋巴瘤骨髓侵犯中的诊断价值。方法：采用骨髓穿刺细胞形态学、FCM和PCR对75例B细胞淋巴瘤患者骨髓同时进行检测，并进行叁者之间的比较。结果：(1)骨穿检出16例，阳性率21.3％，FCM检出36例，阳性率为48％，PCR检出33例，阳性率为44％，叁者之间的差别均有统计学意义(P＜0.05)。(2)叁种检测方法的符合率为64％(48／75)，其中6例患者FCM阳性、形态学和PCR检测均阴性，2例患者FCM和形态学检测阳性、PCR检测阴性，14例患者FCM检测和PCR检测阳性、形态学检测阴性，5例患者PCR检测阳性、FCM和形态学阴性。(3)FCM和PCR的符合率为82.7％(62／75)。结论：FCM和PCR比骨髓细胞形态学的检出率高，对后者是有益的补充，FCM和PCR的检出对临床具有参考价值，但需进一步观察叁种检测方法不相符合患者的临床表现，以判断叁种检测方法的结果对疾病结局的影响。
周泽平[6]2004年在《免疫球蛋白kappa基因重排在B细胞增殖性疾病中的检测及其应用》文中研究表明[目的] 探索和评价免疫球蛋白kappa基因重排检测在B淋巴细胞增殖性疾病中的价值。 [方法] 选取93例B淋巴细胞增殖性疾病及反应性增生标本，运用降落PCR方法扩增Ig kappa CDR3区，以异源双链分析鉴别扩增产物以分辨其克隆性。 [结果] 在所有确诊的72例B淋巴细胞增殖性疾病中Ig kappa扩增的阳性率为47.2％。其中14例急性B淋巴细胞白血病中有2例阳性(14.3％)；3例慢性淋巴细胞白血病中有2例阳性；55例B细胞恶性淋巴瘤中有30例阳性(54.5％)。在11例不典型增生的病例中，Ig kappa单克隆检出率为2／11(18.2％)；10例反应性增生中无一出现单克隆重排；石蜡组织中Ig kappa扩增成功率为32／43(74.4％)。 [结论] 作为一个独立的分子标记，以PCR方法扩增Ig kappa确定B淋巴细胞增殖性疾病的克隆性在其临床诊断及生物学特性研究方面是一种有前途的方法，且适用于基因组DNA保存不佳的标本以进行回顾性研究。
杜善梅[7]2008年在《T细胞非霍奇金淋巴瘤基因重排及T细胞相关细胞因子受体表达模式的研究》文中认为淋巴瘤的病理诊断被公认为是临床病理中难度最大的,仅靠组织形态学以及免疫组化结果有时容易造成误诊及漏诊。随着分子生物学的发展,分子克隆分析无论是在淋巴瘤的初次诊断还是以后的随访中日益重要并且逐渐成熟,国外,特别是免疫球蛋白基因的克隆分析,已经用于B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin lymphoma,B-NHL)的常规病理诊断。T细胞非霍奇金淋巴瘤(T-cell non-Hodgkin iymphoma,T-NHL)是一种相对较少见且高度异质性的恶性淋巴瘤,目前国内外对T-NHL的病理诊断还不太乐观。T-NHL的病理诊断要解决两个问题,一是不是T-NHL?二是哪一种类型的T-NHL?也就是T-NHL的诊断和分类问题。关于第一个问题,由于T-NHL其形态多变以及免疫学上无克隆性标记,主张对所有的T细胞增殖性疾病进行分子克隆性基因重排分析,尤其是T细胞富裕的B细胞非霍奇金淋巴瘤。克隆分析淋巴瘤的原理是基于所有恶性淋巴细胞都有一个共同的克隆起源。目前淋巴瘤的分子病理诊断中,聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction,PCR)因其快速、简单、高效、廉价,敏感度高以及对DNA的质和量要求不高等优点而逐步取代了Southern blot。一般来说,PCR检测的高灵敏度期望是从新鲜的或冰冻的样本中分离得到DNA,而从福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixed and paraffin embedded,FFPE)的组织样本中分离得到的DNA使其敏感性有所降低。不幸的是,在大部分的诊断病例以及回顾性研究中,仅能得到FFPE的组织样本。从FFPE的组织样本中分离出的DNA含有许多断裂的并伴有化学修饰的短小靶序列,不利于分子诊断。如何提高FFPE样本检测的敏感性是研究者面对的一个难题。另一方面不同文献中所选择的引物,PCR循环参数以及PCR产物分析方法都不尽相同,检测结果也有差异。因此,如何找到适合于常规临床病理诊断的标准程序是研究者面对的另一个难题。实际上与新鲜的或冰冻的样本相比,克隆分析FFPE样本的难度在于需要更多的实验,本研究获省科技厅项目(001110425)、浙江省自然科学基会项目(Y205292)和浙江省医药卫生科学研究基金(2006A084)资助其与大部分的体细胞基因PCR扩增相比更为复杂。以PCR为基础的克隆分析虽不是一项新颖的方法,但现有发表的文章很少有改变PCR参数扩增FFPE样本的DNA模板的研究分析。关于第二个问题,分化标记物表达的研究表明大多数T-NHL是由胸腺后T细胞的恶性转化发展而来的,因此这些恶性肿瘤被称为外周T细胞淋巴瘤(periferal T celllymphomas,PTCLs)。PTCLs一群高度异质性的恶性淋巴瘤,其诊断、分类及分子发病机制的研究一直是肿瘤病理学中最为困难和最有争议的领域之一。最新的2001年WHO分类标准,已经分化出了一些独立存在的肿瘤实体,如肠病相关性T细胞淋巴瘤(enteropathy type T cell lymphoma,ETTCL),间变性大细胞性T细胞淋巴瘤(anaplasticlagre T cell lymphoma,ALCL),血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(angioimmunoblastic T-celllymphoma,AITL),鼻型T/NK细胞淋巴瘤以及肝脾γδT细胞淋巴瘤等等,除此之外,一种新PTCLs被分出,即非特指外周T细胞淋巴瘤(periferal T cell lymphomas,unspecified,PTCL-U),然而这一术语仅用来描述一类异质性的淋巴瘤,而这类淋巴瘤有不同的临床特征,组织学特点,基因改变,治疗反应以及相应的预后。因此,详细的PTCLs分类,尤其是PTCL-U有待于进一步的澄清。迄今为止,T-NHL的分类大致基于形态学或临床准则。最近研究表明,正常T细胞亚群趋化因子受体的表达模式与该细胞亚群分泌的细胞因子相关,CCR3选择性表达在人类或小鼠的Th2细胞,CXCR3选择表达在Th1细胞。基于以上原因,本实验以FFPE中T细胞受体(TCR)γ基因重排为研究对象,选用TCR多重引物,通过优化DNA提取以及PCR多个参数分析T-NHL中TCRγ基因重排,以建立PCR扩增中不同变量性能改变的重要意义。另选用一对TCRβ通用性引物作为TCRγ多重引物的补充和比较,同时联合最常用以及检测率较高的FR3A和FR2A通用性引物检测T-NHL中IgH基因的克隆性重排在本实验室T-NHL中的检测率。我们研究趋化因子受体中Th1相关标记CXCR3和Th2细胞相关标记CCR3在T-NHL中表达以评估其与临床病理的关系。材料与方法1材料(1)T-NHL标本:收集1997-2008年我医学院附属医院及省内其它医院的T-NHL标53例。全部标本经中性福尔马林固定、常规石蜡包埋、4～5μm连续切片,除常规HE染色外,采用LCA(2B11,DAKO)、CD45RO(UCHL1,DAKO)、CD20(L26,DAKO)、CD30(Ber-H2,DAKO)免疫组化确定肿瘤的免疫表型。按照2001年WHO关于淋巴及造血系统肿瘤分类标准对所有病例进行分类:同时参照1992年Kail标准进行组织学高低级别分级。(2)对照组标本:收集反应性增生的淋巴组织石蜡标本4例,其中1例为淋巴结,3例为扁桃体。(3)Jurkat细胞:人类T细胞白血病细胞株,培养条件:选择RPMI 1640(含10%胎牛血清)培养基,放入37℃,5%CO2～95%空气饱和湿度培养箱中孵育。待细胞生长接近融合成簇,离心收集后待用。2方法(1)免疫组织化学检测T-NHL中LCA,CD45RO,CD20,CD30的表达,确定肿瘤免疫表型。(2)选取6例T-NHL和4例反应性增生的淋巴组织,根据脱蜡时间与脱蜡温度不同分为两组,然后常规蛋白酶K-酚氯仿法抽提石蜡组织DNA;TCRγ基因重排为研究对象,选用多重TCRγ引物,优化PCR循环参数。(3)采用PCR方法,联合TCRγ,TCRβ及FR3A、FR2A引物,检测53例T-NHL标本TCRγ、TCRβ及IgH基因克隆性重排,产物先2%琼脂糖电泳初筛,后行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。(4)选择Th1相关的细胞因子受体CXCR3和Th2相关的细胞因子受体CCR3,运用免疫组化方法检测这两种细胞因子受体在45例T-NHL中表达水平,评估其与临床病理的关系。(5)统计学处理:实验结果均使用SPSS16.0 for Windows软件包进行统计分析。3结果(1)根据免疫组织化学分型、组织学改变以及临床资料,同时参照2001年WHO关于淋巴及造血系统肿瘤分类标准对53例T细胞淋巴瘤进行分类,分为27例外周T细胞淋巴瘤,非特指(PTCL-U),12例肠病相关性T细胞淋巴瘤(ETTCL),8例间变性大细胞T细胞淋巴瘤(ALCL),6皮下脂膜炎性T细胞淋巴瘤(SCPTCL)。(2)脱蜡时间长和脱蜡温度高的一组DNA质量以及产量较高。(3)FFPE样本TCRγ多重引物扩增中:TCRγA,B管40个循环达到最佳扩增效果;TCRγA管退货温度在50.9℃～65.5℃都可达到满意的扩增效果,而TCRγB管则需在50.9℃～56.7℃;TCRγA,B管所需引物量50pmol以上,Mg2~+终浓度1.25～1.75 mM,dNTPs终浓度100～200 uM。(4)53例T-NHL中。采用优化的TCRγA,B管多重引物克隆性TCRγ基因重排检测率为62.3%(33/53),TCRβD2-J2通用性引物的检洲率为41.9%(23/53),联合TCRβ通用性引物,总检测率为66.0%(35/53)。(5)联合TCRγA,B管及FR3A、FR2A引物,7.6%(4/53)T-NHL检测到双重重排,免疫组化结果提示这4例均为T细胞表型。病理类型分别为3例外周T细胞淋巴瘤,非特指(PTCL-U)与1例间变形性大细胞性T细胞淋巴瘤(ALCL)。(6)免疫组化检测45例T-NHL中CXCR3与CCR3表达水平,结果发现CXCR3与CCR3总的表达率为24.4%,不同病理类型之间表达无显着性差异(P＞0.05)。4结论(1)延长脱蜡时间以及提高脱蜡温度有助于提高FFPE样本中DNA的质量和产量。(2)对TCRγ多重引物增加PCR循环次数有助于提高劣质DNA的扩增率,增加引物浓度,轻微增加的Mg2~+浓度结合标准量dNTPs可以改善TCRγ基因的克隆检测。(3)在TCRG多重引物优化过程中,我们的实验有助于确定哪一个参数以及如何改变来减少假阳性或假阴性。(4)采用优化的TCRγA,B管多重引物,克隆性TCRγ基因重排在T-NHL中检测率高于TCRβ通用性引物D2-J2,但联合TCRβ通用性引物D2-J2,可以提高总检测率。(5)基因重排与淋巴瘤细胞的免疫表型并不一致。不能通过基因重排来确定T、B细胞系来源,除非必须同时进行Ig和TCR基因重排,排除其一才能确定其细胞系来源。(6)根据肿瘤细胞是否表达CXCR3或CCR3来进一步分类T-NHL,还需进一步的实验验证。
梁勇[8]2011年在《血浆游离DNA检测在恶性淋巴瘤早期诊断中的意义》文中指出目的选取临床常见的弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B—cell lymphoma, DLBCL)为研究对象,探讨血浆游离DNA检测对非霍奇金淋巴瘤(Non-hodgkin lymphoma, NHL)早期诊断及治疗评价的意义。方法1.分别提取20例初治及复发DLBCL、10例T-NHL患者、20名健康人及10例淋巴结炎性肿大患者血浆游离DNA,通过PCR的方法检测IgH、bcl-2/IgH基因克隆性重排,并分别与外周血及骨髓单个核细胞DNA进行比较观察。2.分别提取22例初治及复发DLBCL患者、10名健康人及10例淋巴结炎性肿大患者血浆游离DNA及单个核细胞DNA,通过甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR, MSP)和非甲基化特异性PCR (unmethylation-specific PCR, unMSP)分别检测血浆游离SHP-1、P16基因启动子区域甲基化状态；RT-PCR方法分别检测单个核细胞SHP-1及P16基因甲基化后mRNA的表达情况。结果1.20例初治与复发DLBCL、10例T-NHL病例全部成功提取出血浆游离DNA,20名正常人及10例淋巴结炎性肿大患者均未提取出血浆游离DNA；20例初治与复发DLBCL病例中12例IgH基因重排阳性(60%),10例Bcl-2/IgH基因重排阳性(50%)；5例临床缓解的DLBCL病例未检出IgH基因重排,4例临床缓解的DLBCL病例未检出Bc1-2/IgH基因重排,10例T-NHL病例末检出IgH及Bc1-2/IgH基因重排；患者血浆游离IgH、Bcl-2/IgH基因克隆性重排分别与外周血及骨髓单个核细胞IgH、Bcl-2/IgH基因克隆性重排结果对比显示,血浆游离DNA的阳性率高于外周血及骨髓单个核细胞DNA,但差异不具有统计学意义(P>0.05),可能需要积累更多的病例。2.22例DLBCL中21例存在血浆游离SHP-1基因启动子区域甲基化,16例存在血浆游离P16基因启动子区域甲基化,甲基化频率分别为91.0%及71.0%;SHP-1、P16基因启动子区甲基化后该基因处于沉默状态故而相应mRNA表达减少或完全消失,而10名健康人及10例淋巴结炎性肿大患者SHP-1、P16基因mRNA的表达均为阳性；动态观察显示缓解期患者血浆游离SHP-1、P16基因启动子区域均呈持续甲基化状态。结论1.采用血浆游离DNA检测DLBCL患者IgH及Bc1-2/IgH克隆性重排具有较高的临床诊断价值,可提高淋巴瘤患者的早期诊断率,且敏感性大于外周血及骨髓单个核细胞DNA,标本取材简单方便,对患者的治疗反应监测也有重要参考价值。2.血浆游离SHP-1、P16基因启动子区域在DLBCL中存在高度甲基化,由其所致的SHP-1、P16基因沉默可能是肿瘤发生的重要因素之一,血浆游离SHP-1、P16基因甲基化可作为NHL一个良好的分子诊断标记及可能的治疗靶点。
王海莉[9]2005年在《恶性淋巴瘤骨髓基因重排的检测及临床意义》文中指出背景和目的 近年来,恶性淋巴瘤(ML)的发病率逐年上升,国内非霍奇金淋巴瘤(NHL)约为霍奇金淋巴瘤(HD)的7倍。在临床工作中,恶性淋巴瘤治疗前要作出全面诊断,包括亚型、亚类、临床分期、有无B症状、预后分数等以利于合理地选用治疗方案和评估预后。但是,全面诊断仍存在一些困难。一方面,目前淋巴瘤主要依靠以形态学为主、免疫组化为辅的诊断手段,一部分病例凭此方法仍不能确定是否为淋巴瘤及对其亚类的判断;另一方面,在分期上,恶性淋巴瘤发生骨髓浸润(BMI)者分为Ⅳ期,骨髓涂片是目前检测BMI的常用形态学方法,但其检出率低,假阴性率较高。总之,常规诊断方法对NHL的准确分期、治疗的疗效评价、预后评估、是否需巩固治疗及巩固治疗时间的判断都存在困难。因此,需要建立一套NHL诊断和治疗的综合评估体系。 随着新的治疗方法和治疗药物的临床应用,恶性淋巴瘤的治疗效果取得了很大进步。但仍有部分病例治疗退缩后很快复发,甚至少数病例开始即对治疗抗拒,称为复发性或难治性淋巴瘤。复发的主要原因为体内仍残留恶性细胞,常规形态学检查往往不能发现,被称为微小残留病灶(MRD)。需要有一种更敏感的方法来检测MRD。 随着分子生物学的发展,从基因水平研究和分析疾病的技术逐渐应用于临床,为淋巴瘤诊断提供了有效工具。B和T淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟,由于受外界抗原的刺激,其抗原受体(Ig和TCR)基因必须通过基因重排才能形成有功能
易智慧[10]2002年在《胃良性淋巴增殖至胃MALT淋巴瘤序列演进中临床及分子病理学研究》文中认为背景与目的 胃MALT淋巴瘤来源于胃粘膜相关淋巴样组织(mucosa-associated lymphoid tissue，MALT)，为淋巴结外非何杰金淋巴瘤中最常见者。一系列证据提示胃MALT淋巴瘤产生于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H．Pylori)感染后获得MALT的基础上。H．pylori感染引发胃MALT淋巴瘤的具体的分子机制尚不清楚。目前研究较多的是染色体易位t(11；18)(q21；q21)，被认为是胃低恶性MALT淋巴瘤的特征染色体及由依赖H．pylori生长变为不依赖的分子标记。BCL10是一种凋亡调节分子。t(11；18)致BCL10过度表达，具促进细胞转化、抑制凋亡功能，通过模拟抗原受体信号，最终导致NF-κB通路的激活，驱动不依赖抗原的生长和胃MALT淋巴瘤的演进。胃MALT淋巴瘤的早期诊断对治疗方案的选择及预后的判断至关重要。组织学是诊断的金标准；然而单凭胃活检组织学仅能对近1／3的早期病例
参考文献：
[1]. PCR检测淋巴细胞恶性增殖性疾病基因重排在临床中的应用[D]. 郭宏强. 郑州大学. 2003
[2]. 流式细胞免疫分型联合PCR检测抗原受体基因重排在淋巴增殖性疾病诊断与鉴别诊断中的应用[J]. 耿哲, 黄亮, 王迪, 熊婕, 朱莉. 中国癌症杂志. 2011
[3]. 非霍奇金淋巴瘤外周血基因重排的检测及临床意义[D]. 孙振昌. 郑州大学. 2006
[4]. 非霍奇金淋巴瘤IgH基因和TCR基因克隆性重排检测及凝胶扫描技术初步研究[D]. 张晓飞. 浙江大学. 2003
[5]. 流式细胞术和聚合酶链反应检测B细胞淋巴瘤骨髓侵犯及临床意义的研究[D]. 陈治宇. 复旦大学. 2006
[6]. 免疫球蛋白kappa基因重排在B细胞增殖性疾病中的检测及其应用[D]. 周泽平. 昆明医学院. 2004
[7]. T细胞非霍奇金淋巴瘤基因重排及T细胞相关细胞因子受体表达模式的研究[D]. 杜善梅. 浙江大学. 2008
[8]. 血浆游离DNA检测在恶性淋巴瘤早期诊断中的意义[D]. 梁勇. 天津医科大学. 2011
[9]. 恶性淋巴瘤骨髓基因重排的检测及临床意义[D]. 王海莉. 郑州大学. 2005
[10]. 胃良性淋巴增殖至胃MALT淋巴瘤序列演进中临床及分子病理学研究[D]. 易智慧. 中国协和医科大学. 2002
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