齐锦[1]2003年在《MICA反应性γδT细胞抗肿瘤作用的研究》文中指出人类MHC Ⅰ类链相关基因A(MICA)是位于MHC-Ⅰ类区域的非经典HLA-Ⅰ类基因家族成员，具有高度多态性。该基因可在多种上皮肿瘤细胞表面表达，并可被Vδ1 γδ T细胞所识别。本论文旨在研究固相化的重组MICA分子(rMICA)诱导卵巢上皮肿瘤(OEC)和结肠上皮肿瘤(CC)组织中Vδ1 γδ T细胞的体外扩增反应，并进一步探讨MICA反应性Vδ1 γδ T细胞对上皮来源的肿瘤细胞细胞毒作用。由于Vδ1 γδ T细胞可在MHC非限制性和无需抗原处理与呈递的条件下识别表达在肿瘤细胞表面的MICA，因此，该种简捷的识别应答可能会开辟肿瘤过继免疫治疗的新途径。本研究将为这一肿瘤的过继免疫治疗新策略建立基础，并为MICA反应性Vδ1 γδ T细胞作为肿瘤过继免疫治疗的新型候选效应细胞提供实验依据。 首先，我们从卵巢癌细胞系SKOV_3中提取总RNA，通过RT-PCR克隆了MICA的全长cDNA。利用pET原核表达系统表达了含有MICA全长或胞外结构域(α1-α3)的融合蛋白MICA*008，并成功地进行了纯化。同时，真核表达载体瞬时转染Daudi细胞也获得了成功。这些系统的建立为后续的研究奠定了基础。 其次利用原核表达的重组MICA*008蛋白制备了系列的特异性抗MICA单克隆抗体1F10，2D10，3E8，4D2和5G11以及家兔多抗血清。通过ELISA、间接免疫荧光和Western-blot对抗体进行了特异性鉴定。利用流式细胞仪分析表明单抗3E8和5G11可识别表达在HeLa细胞表面的MICA分子天然构象。抗—MICA抗体的获得为进一步的研究提供了有力的工具。
赵建晴[2]2004年在《MICA反应性Vδ1 γδ T细胞受体功能研究》文中提出人MHC Ⅰ类链相关基因A(MICA)，位于MHC Ⅰ类基因区，与MICB等同属于MIC家族。MICA是高度糖基化的单链穿膜蛋白，其基本结构与MHC Ⅰ类分子相似，但它不含β2微球蛋白，没有与CD8结合的位点，也不能与抗原肽结合。MICA在多种上皮来源肿瘤细胞表面高表达，是一种肿瘤相关抗原。同时，MICA也是一种应激诱导的危险信号。 Vδ1 γδT细胞是上皮细胞间淋巴细胞(IELs)的主要组份，它们参与抗感染一线防御和对恶变的免疫监视。研究发现肿瘤细胞表达的MICA分子可被富集于其中的Vδ1 γδT细胞表面的NKG2D受体和TCR Vδ1同时识别。MICA与相应受体结合后可激活Vδ1 γδT细胞产生细胞毒作用，引起肿瘤细胞杀伤。但是，肿瘤细胞MICA分子表达与Vδ1 γδT细胞识别过程十分复杂，二者的相互关系尚未完全阐明。我们这项工作通过γδT细胞对MICA~+肿瘤细胞杀伤作用和γδT细胞受体表达等研究，旨在说明Vδ1 γδTCR对MICA分子识别作用。 在本课题组的前期工作中，我们从卵巢癌细胞系SKOV3克隆了MICA的全长cDNA(MICA*008)。利用pET原核表达系统表达了含有MICA胞外结构域(α1-α3)的重组蛋白(rMICA)，并且证明了固相化的重组MICA分子可诱导卵巢上皮肿瘤(OEC)组织中Vδ1 γδT细胞的体外扩增反应，并观察到MICA反应性Vδ1 γδT细胞对上皮来源的肿瘤细胞的细胞毒作用。 在本研究中我们首先扩增并克隆了多个来自不同卵巢癌病人肿瘤组织中浸润γδT淋巴细胞受体V基因片断，测定并分析了这些片断的序列，发现这些克隆Vδ1连接区序列呈现出高度多样性。 随后，我们以固相化rMICA体外刺激扩增肿瘤组织中Vδ1 γδT细胞，检
赵慧[3]2009年在《基因修饰CDR3δ移植型γδT淋巴细胞的抑癌作用研究及抑郁症患者外周血中细胞因子的研究》文中认为卵巢癌是女性生殖器官叁大恶性肿瘤之一,死亡率占据妇科恶性肿瘤首位,预后差。目前已有的卵巢癌肿瘤治疗方法包括手术治疗,化学药物治疗和放射治疗,但是都有其局限性。从而,迫使人们努力寻找新的治疗手段,以达到特异而有效的识别并杀灭肿瘤细胞的目的。其中生物学治疗手段已引起人们的广泛关注。生物治疗包括非特异的细胞因子(白介素-2,干扰素-α等)疗法和单克隆抗体、αβ细胞毒性T细胞(CTL)过继治疗等靶向治疗方法,对微小肿瘤以及残留病变的清除有一定的疗效。但是单克隆抗体和αβT阻细胞精密识别靶抗原的优点又限定了其抗肿瘤治疗的肿瘤谱,同时治疗用的大量抗体和CTLs的来源也是不易解决的问题。目前,γδT细胞因其识别抗原广泛,且识别无MHC分子限制性,成为过继治疗的候选细胞。但在γδT细胞制剂的制备方法上仍存在某些问题亟待解决。如中晚期肿瘤患者或化疗后患者体内免疫抑制,导致种子细胞数量减少和免疫活性下降,致使体外扩增细胞数量受限,难以达到治疗所需数量的细胞制剂。因此使用基因工程方法制备基因修饰的γδT淋巴细胞治疗肿瘤不失为一个值得尝试的新型策略。近年来,我们实验室选择TCRδ链的CDR3 (CDR3δ)为研究对象,通过CDR3合成多肽、CDR3移植性Ig与肿瘤靶细胞、靶组织以及肿瘤细胞提取蛋白的相互作用的实验,验证了CDR3是TCRyδ与抗原结合的关键部位,进而证明γδ6T细胞能够经由其细胞受体(yδTCR)δ链的CDR3区(CDR3δ)广泛地识别、进而杀伤多种实体肿瘤细胞。因此,本文的第一部分旨在利用基因工程技术,制备特异肿瘤反应性的CDR3δ移植型γδT细胞。通过体内体外实验以证明其对肿瘤具有杀伤作用,从而为临床过继性免疫治疗提供新思路和新方法。本研究主要包括以下几个方面的工作：一、建立mRNA电转外周血淋巴细胞(PBLs)技术的平台用于移植的肿瘤特异性的CDR3δ序列的筛选。将线性化的pGEM4Z/EGFP/A64质粒作为体外转录RNA的模板,通过不同的电转参数下细胞电转率及细胞存活率的比较,建立mRNA电转的平台。将实验室前期从卵巢癌TIL获得的γδTCRδ2的特异性CDR3序列OT1,OT3和OT10分别嵌合进入全长的γδTCRδ2链,全长的γδTCRδ2链与γ9链分别体外转录成mRNA后,共同转染抗CD3抗体刺激的正常人PBMC,使其细胞膜表面表达TCRγδ,分别命名为γ9δ2(OTl)T细胞,γγ9δ2(OT3)T细胞和γ9δ2(T10)T细胞。检测上述转染细胞,在肿瘤细胞蛋白的刺激下,活化分泌的细胞因子及其对多种肿瘤细胞的细胞毒作用。结果显示,相对于γ9δ2(OT1)T细胞,γ9δ2(OT3)T细胞和γ9δ2(T10)T细胞具有更显着的细胞毒作用,且分泌更多的细胞因子。进而,结合实验室以前的研究结果,我们选用嵌合OT3序列的δ链和γ9链进行下一步的实验。二、基因修饰的γ6 T淋巴细胞抑癌作用及其杀伤机制的研究鉴于mRNA电转技术得到的基因修饰的淋巴细胞的转染效率低,表达时间短的缺陷,我们运用逆转录病毒技术制备基因修饰的淋巴细胞。我们分别包装含有OT3序列全长的γδTCRδ2链与γδTCRγ9链的逆转录病毒颗粒,将获得的高滴度病毒浓缩后,感染经抗CD3抗体刺激的正常人PBMC,使其细胞膜表面表达TCRγδ,命名为γ9δ2(OT3)T细胞。结果显示γγ9δ2(OT3)T细胞被多种肿瘤细胞蛋白刺激后,TNF-a和IFN-γγ分泌增加。同时,对多种肿瘤细胞也具有细胞毒作用。而且,这种细胞毒作用能被抗TCRγδ的单克隆抗体所阻断。这些结果提示,γ9δ2(OT3)T细胞能够被肿瘤抗原活化,且具有抗肿瘤作用。为了研究转染细胞细胞毒活性的作用机制,我们进行了Fas/FasL途径的抑制剂BFA和穿孔素／颗粒酶途径的抑制剂CMA对γγ9δ2(OT3)T细胞的细胞毒阻断实验。结果发现,BFA对γγ9δ2(OT3)T细胞肿瘤杀伤作用的最大抑制率仅有20-30%；CMA对γ9δ2(OT3)T杀伤Fas低表达的SKOV3细胞的杀伤活性抑制率可达56.71%,对Fas高表达的H08910细胞的杀伤活性抑制率达33.93%。联合应用CMA和BFA对γγ9δ2(OT3)T细胞的细胞毒作用抑制率达60%以上。以上结果提示,γγ9δ2(OT3)T细胞对肿瘤的细胞毒作用中,穿孔素／颗粒酶和Fas/FasL途径都发挥作用,但穿孔素／颗粒酶途径起主要作用,尤其在对Fas低表达的肿瘤细胞的细胞毒作用中更为重要。叁、γ9δ2(OT3)T细胞体内抑癌作用研究通过裸鼠荷人卵巢癌肿瘤模型,肿瘤局部注射γ9δ2(OT3)T细胞,观察其对肿瘤的治疗效果。结果显示,γ9δ2(OT3)T细胞配合IL-2治疗,相对于空载体感染的细胞配合IL-2治疗组,肿瘤的生长明显受到抑制,裸鼠的生存期也有所延长。总之,本文第一部分通过将γδTCR基因序列转染进入抗CD3抗体刺激的外周血单个核细胞中,获得具有特异肿瘤反应性的免疫效应细胞。并且通过体内外实验验证了基因修饰细胞的抗肿瘤的能力,为肿瘤免疫治疗提供了新的思路与方法。抑郁症的发病率和患病率较高,其严重影响了病人的生理、心理健康及社会交往,使病人的日常生活能力明显受损,增加了致残率和死亡率。传统理论认为,抑郁症主要是由于单胺神经递质类物质活性降低引起。最近,又有其他新的理论解释抑郁症的病理生理学。其中糖皮质激素,神经营养因子和免疫系统细胞因子网络的变化逐渐引起了人们的关注。目前对抑郁症的研究主要集中在单个细胞因子群,特别是单核促炎性细胞因子(IL-1β,IL-6,TNF-α)。然而,细胞因子之间具有多效性而且彼此之间密切相互作用。细胞因子属于不同的细胞群分泌对免疫反应有不同的应答。因此,本文的第二部分采用ELISA法研究对抑郁症患者血清中3个亚系的细胞因子,主要是单核细胞因子(IL-1β,IL-6,TNF-α),Thl细胞因子(IFN-γ和IL-2)及一个Th2细胞因子(IL-4)进行了研究。结果表明,抑郁症患者血清IL-1β和IL-6水平显着高于正常对照组,且血清IL-1与IL-6变化成正相关(r=0.308 P<0.01),提示IL-6与IL-1在抑郁症的发病过程中可能具有相关性。抑郁症患者TNF-α水平高于正常对照组,但是没有统计学差异。抑郁症患者血清中Thl型细胞因子水平明显低于正常对照组,Th2型细胞因子明显高于正常对照组。上述结果提示抑郁症患者Th1/Th2细胞因子分泌严重失衡。此外,我们用ELISA法检测了抑郁症患者血清中胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)及MHCI类链相关基因A(MICA)的表达,结果发现,抑郁症患者血清GDNF显着低于对照组,MICA显着高于对照组。上述检测的指标在抑郁症病人接受6个星期的百优解及传统医学的针刺治疗后,都有明显的逆转。这提示GDNF和MICA可能是抑郁症的生物指标之一。然而其与抑郁症病因、病理变化机制及相关的神经递质的作用都需要进一步深入研究。总之,本文的第二部分初步研究了抑郁症患者外周血中细胞因子,GDNF及MICA的变化,为抑郁症的发病机制研究提供了一些依据,上述细胞因子有可能作为抑郁症患者临床诊断的辅助手段。
吴振添[4]2006年在《NK细胞活化性受体NKG2D及其配体MICA/B在急性白血病免疫逃逸机制中的初步研究》文中研究表明目的：了解急性白血病患者肿瘤细胞表面MICA／B表达情况和血清可溶性MICA和MICB的水平及其水平与自然杀伤细胞活化性受体NKG2D的关系，探讨NKG2D—MICA／B在白血病肿瘤免疫逃逸机制中的作用，为白血病肿瘤免疫治疗打下实验基础和理论基础。 方法：选择20例未治疗初发急性白血病患者，男13例，女7例，采用骨髓细胞形态学、免疫学、细胞遗传学(MIC分型)诊断。流式细胞术检测白血病细胞表面MICA／B表达水平、ELISA法检测血清可溶性MICA及MICB含量，同时检测患者NK细胞活化性受体NKG2D表达水平。取5例正常健康人血做对照。 结果：1、20例急性白血病患者白血病细胞表面不表达或弱表达MICA／B，正常人血细胞表面基本不表达MICA／B。但患者正常淋巴细胞有少量表达。2、正常人血清sMICA水平(5.1±2.8)pg／mL，sMICB为(4.3±3.2)pg／mL。患者血清sMICA和sMICB异常升高，sMICA为(63.4±45.7)pg／mL，sMICB(123.5±67.8)pg／mL，两者均高于正常对照组(P＜0.0025)。3、患者NK细胞活化性受体NKG2D表达率为(79.23±11.06)％，正常对照组为(93.05±5.72)％，患者表达率明显低于正常对照组(P＜0.01)。 结论：20例初发急性白血病患者肿瘤细胞低表达MICA／B，急性白血病患者NK细胞活化性受体NKG2D的表达低于正常对照组，提示急性白血病患者NK细胞的NKG2D-MIC杀伤肿瘤细胞效应减弱，这可能是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一。患者血清的sMICA和sMICB异常升高，可能是白血病细胞表面MICA／B的脱落所致，这也许是NK细胞及NKG2D杀伤活性下降的重要原因之一。
孔燕[5]2008年在《人类γδT细胞识别应激分子-4型UL16结合蛋白的机制研究》文中研究指明UL16结合蛋白(UL16 Binding Proteins，ULBPs)是一个NK细胞活化型受体一NKG2D的配体家族，目前发现的同系物包括ULBP1～5。ULBPs可应激性表达在一些肿瘤细胞或病原体感染细胞的表面。ULBP1、2、和3之间存在55-60%同源性，而ULBP4序列则变化较大，且相关研究较少，仅限于ULBP4-NKG2D相互作用和活化NK细胞方面。γδT细胞表面表达NKG2D，可识别MICA、ULBPs分子等配体分子。研究发现，γδT细胞表面的T细胞受体(TCR)γ和δ链异质二聚体分子也识别MICA。这种NKG2D和TCRγδ对相同配体分子双重识别的生物学意义尚不完全明了，据推测，可能与确保固有免疫细胞能及时清除表达应激分子的受损细胞有关的免疫监视功能有关。本研究关注以下四个科学问题：第一，回答TCRγδ是否识别ULBP4分子?这一问题至今尚无答案。事实上，ULBPs家族分子是否可与TCRγδ结合，至今无结构生物学的证据。由于ULBP4具有一定的基因表达的多样性，我们推测机体可能会启动具有受体多样性的TCRγδ对其产生识别，故以ULBP4分子为靶分子，探讨TCRγδ对其识别的可能性。在这一问题框架下，我们要研究δ1链，或δ2链对其结合的特异性，并探究δ链中与配体结合起关键作用的部位一互补决定区(CDR)3的基因序列变化的特点。第二，澄清ULBP4反应性γδT细胞的特性，如主要亚群，细胞因子分泌谱系和肿瘤细胞毒等。第三，利用抗体阻断实验分析ULBP4-NKG2D和ULBP4-TCRγδ双重识别的生物学意义。第四，通过ULBP4在EB病毒感染B淋巴细胞和肿瘤细胞表面的表达和ULBP4介导的γδT细胞细胞毒分析，来探究ULBP4在免疫监视(尤其是在细胞恶变早期)中的作用。我们希望通过针对以上四个科学问题的科学研究可基本阐明γδ-T细胞对ULBP4识别的机制，并为系统阐释ULBP4的生物学意义提供有价值的资料。为解决上述科学问题，我们进行了以下研究：(1)利用293ET真核表达系统表达了人ULBP4分子胞外区(1～226氨基酸)的重组蛋白ULBP4_(1-226)；利用pcDNA真核表达载体系统在EL4细胞中稳定表达全长的ULBP4基因，这些系统的建立为后续的研究奠定了基础。(3)首次使用固相化ULBP4分子诱导OEC和CC中的肿瘤浸润γδT淋巴细胞的体外扩增，获得纯度为80%的Vδ2 T细胞，并开展ULBP4反应性γδT细胞TCR Vδ-CDR3区的结构生物学研究。(4)利用配体受体酶联免疫结合实验、流式细胞术和γδTCR基因转染的TCR-β链缺陷型的T细胞系J．RT3-T3．5细胞平台证实，ULBP4与TCRγ9δ2特异结合。(5)ELISA法检测ULBP4刺激γδT细胞产生细胞因子的谱系。MTT方法检测γδT细胞对表达ULBP4的肿瘤细胞的杀伤活性。(6)在抗体封闭实验中，分别分析了anti-NKG2D、anti-TCRγδ、anti-NKG2D+anti-TCRγδ单抗封闭前后，ULBP4活化的γδT细胞分泌IFN-γ水平及对ULBP4阳性的肿瘤细胞细胞毒的变化。实验结果显示，anti-NKG2D+anti-γδTCR单抗联合阻断的效果强于anti-γδTCR或anti-NKG2D单独阻断作用。(7)结合流式细胞术和组织化学方法，检测ULBP4在不同来源肿瘤细胞、组织和EB病毒转化前后B淋巴细胞表面的表达。分析ULBP4介导的γδT细胞细胞毒效应。综上，γδT细胞可凭借表面的NKG2D和TCRγδ结合并识别与肿瘤和感染相关的应激分子ULBP4，其自身发生细胞活化，对肿瘤细胞，恶变细胞，病毒感染细胞迅速产生细胞毒效应，体现了固有免疫系统在免疫监视中所发挥的直接与迅捷的特点。以ULBP4为靶的免疫诊断与治疗策略可能为肿瘤的早期诊断与干预提供新型手段。
曹伟[6]2007年在《ULBPs的免疫识别机制、其剪切变体的功能以及相关的肿瘤免疫逃逸机制的研究》文中研究指明NKG2D是一种C型凝集素激活性受体，由同源二聚体构成，可表达于NK、NKT、CD8~+αβT和γδT等多种免疫细胞表面，在固有免疫和适应性免疫应答中都起着非常重要的作用。近几年来，ULBPs(又称为RAET1分子)作为一类新发现的人NKG2D配体家族日益受到关注。该基因家族业已报道的成员有ULBP1(RAET1I)、ULBP2(RAET1H)、ULBP3(RAET1N)、ULBP4(RAET1E)和ULBP5(RAET1G)。从结构上看，所有的ULBPs成员都与MHC-Ⅰ类分子相类似，即都含α1和α2功能域，但不含α3功能域和β2微球蛋白。其中前叁者即ULBP1～3是通过GPI(糖基磷脂酰肌醇)连接的膜蛋白亚家族，而后两者RAET1E和RAET1G则是含跨膜区和胞内区的膜蛋白亚家族。此外，RAET1G通过选择性的剪切还能生成不含跨膜区和胞内区的截短变体RAET1G2。ULBPs可表达于多种肿瘤细胞的表面，不仅是NKG2D的功能性配体，而且可能还可以通过TCRγδ1途径直接激活γδT细胞，并在抗肿瘤的免疫反应中发挥重要的作用。本文的第一项研究内容旨在利用先期MICA和γδT细胞研究的工作基础，就ULBPs激活γδT细胞的抗肿瘤作用及其免疫识别机制开展研究。通过人类ULBPs基因克隆与重组蛋白的表达、ULBPs单克隆抗体制备等基础性工作，建立ULBPs体外扩增γδT细胞的方法，并观察其对肿瘤细胞的特异性细胞毒作用；同时开展对ULBPs反应性γδT细胞的CDR3区序列分析、TCR和NKG2D在γδT细胞免疫识别和活化中的关系分析等研究，为ULBPs类新分子的抗肿瘤作用和其免疫识别机制研究以及γδT细胞过继免疫治疗肿瘤的新策略奠定理论和实验基础。ULBPs和MICA反应性γδT细胞过继免疫治疗肿瘤的方法可克服目前普遍应用的αβT细胞特异性抗肿瘤免疫治疗中出现的肿瘤抗性和抗原呈递低下等主要缺陷，因此该新策略在肿瘤过继免疫治疗方面有着光明的应用前景。首先，从人红白血病细胞系K562、人宫颈癌细胞系Hela、人浆液性卵巢腺癌细胞系HO-8910中提取总RNA，通过RT-PCR技术分别克隆了ULBP1、RAET1G和RAET1G2；ULBP2和ULBP3；ULBP4的全长cDNA。利用pET原核表达系统重组表达了ULBPs家族的所有成员；此外，还利用pcDNA~(TM)3.1/myc-His(-)A真核表达载体系统在CHO中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达全长的ULBPs基因家族，同时还分泌表达了ULBP3的胞外功能域，这些系统的建立为后续研究奠定了基础。其次，分别利用原核表达的重组ULBP4和RAET1G2蛋白制备了特异性单克隆抗体。通过ELISA、间接免疫荧光、流式细胞仪和Western blot等技术对单克隆抗体进行了特异性鉴定。这些抗体的获得为进一步的研究提供了有力的工具。最后，对ULBPs家族中的ULBP3成员进行了初步的研究。在实验的早期阶段，由于未能获得肿瘤患者的外周血或肿瘤组织，我们对健康人的外周血进行了尝试，结果发现：ULBP3在体外不仅能刺激健康人外周血NK细胞的增殖(54.7％VS 9.9％)，还能刺激γδT细胞的增殖(15.3％VS 2.7％)，考虑到扩增γδT细胞的效率较低，直接做功能研究需要大量的PBMC并进行流式分选，因而我们采用折中的研究策略——即直接对其CDR3区序列进行分析，结果显示：δ1亚型中某一序列呈优势分布，占到了78.57％(33/42)，而在抗TCRγδ特异性抗体扩增来源的δ1序列库中，该优势序列只占到了10.71％(3/28)，这一差别具有明显的统计学意义(P＜0.05％)。氨基酸序列分析显示：与小鼠中T22特异性的TCRδ序列相类似的，ULBP3-δ1主型序列具有完整的Vδ1、D3和Jδ1胚系基因片断。但有趣的是：γ9的CDR3区序列并没有明显的优势分布特征，提示TCRγδ1对ULBP3的识别可能以δ1链为主，而不依赖于γ链。为了进一步证明该TCRγδ1对ULBP3识别的特异性，我们从ATCC引进了用于证明抗原特异性TCR的J.RT3-T3.5细胞。遗憾的是，接下来的TCRγδ1全长基因转染研究因载体的原因导致TCR表达量很低而未能成功，但是这部分研究内容为今后抗原特异性TCR基因转染平台的成功建立以及γδT细胞对ULBPs家族其他成员的识别研究工作积累了经验。本文的第二项研究内容旨在鉴定我们所发现的ULBPs剪切变体的功能——即是否都是人NKG2D的功能性配体?最初，我们在克隆ULBPs基因家族的过程中意外地发现ULBP4的叁个剪切变体(ULBP4-Ⅰ、ULBP4-Ⅱ和ULBP4-Ⅲ)和RAET1G2的一个剪切变体(RAET1G3)，尽管这些变体的发生频率比较低(＜5％)。氨基酸序列分析显示：这些变体与其各自的父本序列比较有小片段氨基酸的缺失或插入。功能研究显示：转染了ULBP4各剪切变体的Raji细胞和CHO细胞都能被NKG2D-hIgG1Fc段融合蛋白所识别；此外，和游离性的RAET1G2一样，ULBP4各剪切变体的胞外段功能域蛋白以及RAET1G3与NK-92细胞共育后都能下调后者NKG2D的表达，从另一方面也证明了它们都是人NKG2D的功能性配体；最后，原核表达的RAET1G3重组蛋白还能刺激NK-92细胞分泌IFN-γ。综合以上的实验结果，证明所发现的这些ULBPs剪切变体都是人NKG2D的功能性配体，这一结果提示人NKG2D受体对其配体的识别具有很强的可塑性；同时，这一发现将有助于我们更加全面地了解ULBPs基因家族。本文的第叁项研究内容旨在分析ULBPs中含跨膜区和胞内区的膜蛋白亚家族成员RAET1E(即ULBP4)是否参与了肿瘤逃逸以及其逃逸机制如何?首先，我们在克隆RAET1E基因的过程中克隆到了其截短的不含跨膜区和胞内区的基因(我们命名为RAET1E2)，并且在蛋白质水平证明了该截短基因的存在。其次，功能研究显示：RAET1E2阳性的肿瘤细胞培养上清、RAET1E2基因转染的COS-7细胞培养上清以及RAET1E2重组表达蛋白与NK-92细胞共育后都能明显下调后者NKG2D的表达，而且NK-92细胞在其NKG2D下调表达之后对多种靶细胞的细胞毒性作用明显下降。综合以上的实验结果，除了已经发现的在蛋白水平的脱落所介导的免疫逃逸机制(例如MICA和ULBP2)，我们首次发现了：ULBPs在RNA水平的选择性剪切能生成截短的不含跨膜区和胞内区的可溶性的蛋白，从而介导某些肿瘤的免疫逃逸，这一发现丰富了我们对肿瘤免疫逃逸机制的认识，进而为肿瘤逃逸的免疫干预提供新的信息和更多的靶点。本文的第四项研究内容为人外周血γδT细胞体外扩增方法的建立，该技术方法的建立与改进将为以后的实验研究提供有力的工具。综上所述，本文具有以下几个创新点：1.开展TCRδ1-CDR3区的结构生物学研究，发现了ULBP3反应性的61主型序列，其CDR3区序列如下：CALGELGSYLYWGIRYTDKLIFGKG，共25个氨基酸，具有完整的Vδ1、D3和Jδ1胚系基因片断，为深入了解TCRδ1-CDR3区在免疫识别中所起的作用提供了必要的信息；2.新发现多个有功能的ULBPs剪切变体，即都能被人NKG2D激活性受体所识别，为更加全面地了解ULBPs基因家族提供了线索；3.除了已报道的叁个ULBPs相关的肿瘤逃逸机制外(包括蛋白水平的脱落机制)，首次发现ULBPs在RNA水平的选择性剪切能生成截短的不含跨膜区和胞内区的可溶性的蛋白(RAET1E2)，从而介导某些肿瘤的免疫逃逸，丰富了我们对ULBPs所介导的肿瘤免疫逃逸机制的认识。
郑为东[7]2007年在《骨肉瘤NKG2D表达及对NK细胞杀伤活性的影响》文中进行了进一步梳理第一部分:骨肉瘤NKG2D受体的检测目的:通过研究骨肉瘤患者和健康人外周血NK细胞NKG2D受体的表达情况,分析探讨骨肉瘤患者NK细胞表面受体NKG2D与骨肉瘤发生的关系及其临床价值。方法:对10例骨肉瘤和10例健康人,采用流式细胞术定量分析检测外周血NK细胞NKG2D的表达情况。结果:骨肉瘤组和正常对照组NKG2D的表达量分别为(95.10±2.97)%与(98.03±0.80)%。骨肉瘤患者NK细胞的NKG2D蛋白表达量低于正常对照,差异有显着性(P<0.05)。结论:NK细胞NKG2D表达异常与骨肉瘤的发生发展可能有关。第二部分:骨肉瘤NK细胞杀伤活性的检测机体自身的免疫功能与肿瘤的发生、发展密切相关。自然杀伤细胞是机体免疫系统中一类十分重要的淋巴细胞,它不像细胞毒性T细胞,不需预先致敏,亦无MHC限制性,在病变早期即能迅速发挥杀瘤效应,在肿瘤免疫监视中发挥着举足轻重的作用,被认为是机体免疫防御体系的第一道屏障。目前关于NK细胞功能和调节的研究引起了人们极大的兴趣,成为免疫学和肿瘤学的热点。同时,分析肿瘤逃逸现象的分子机制,对我们全面掌握肿瘤发生、发展的本质,寻找克服肿瘤免疫逃逸的方法有重要的参考价值。目的:研究骨肉瘤患者和健康人外周血NK细胞活性及NKG2D多克隆抗体(pAb)对NK细胞细胞毒作用的影响,分析探讨骨肉瘤患者NK细胞活性的变化与NKG2D表达量的关系,并进一步了解骨肉瘤发病原因。方法:分离10例骨肉瘤和10例健康人外周血单个核细胞,用MTT比色法检测抗NKG2DpAb加入前后NK细胞的细胞毒效应。结果:与正常对照组相比,骨肉瘤患者外周血NK细胞的细胞毒活性降低;NK细胞的细胞毒效应与其表面的NKG2D的表达水平密切相关。结论:骨肉瘤患者机体NK细胞的杀伤活性下降;其活化性受体NKG2D表达的下降是NK细胞活性下降的原因之一;NKG2D表达异常可能对NK细胞的功能状态起着重要的调节作用;NKG2DpAb通过封闭NK细胞表面的NKG2D分子显着抑制NK细胞的细胞毒效应;骨肉瘤的免疫逃避可能与NKG2D表达下降有关。
郗雪艳[8]2008年在《T细胞受体δ2链互补决定区（CDR）3与抗原结合的分子结构基础》文中认为晚近,固有免疫中的细胞成分—γδT细胞在抗感染免疫、肿瘤免疫、免疫调节以及自身免疫等方面的重要作用广受关注。然而,与承担特异性细胞免疫功能、MHC—抗原肽—TCRαβ三元体结构解析较为清楚的αβT细胞形成鲜明对比的是,免疫学术界对γδT细胞受体(TCRγδ)识别抗原的结构基础所知甚少,同时TCRγδ所识别的抗原鉴定工作也进展缓慢。研究表明,TCRγδ链,尤其是TCRδ链上的互补决定区(CDR3)是与抗原表位结合的关键部位。近年来,我们实验室选择TCRδ2链的CDR3(CDR3δ)为研究对象,在CDR3合成多肽、CDR3移植性Ig与肿瘤靶细胞、靶组织以及肿瘤细胞提取蛋白的相互作用机制方面做了大量的工作,验证了CDR3δ是TCRδ2链与抗原结合的关键部位。为了更真实地反应TCRγδ的结合活性,本研究中,我们通过TCRγδ重建技术,构建了一个利用细胞膜表达不同CDR3δ移植型TCRγδ异质二聚体的技术体系,来研究CDR3δ与抗原特异性结合的分子结构基础。另一方面,该技术体系也为寻找γδT细胞的抗原表位提供新的方法。本文的主要工作及学术成果如下:一、CDR3δ与抗原结合的分子结构基?1.构建了CDR3区移植型TCRγδ转染细胞系将嵌合了特异性CDR3区序列的全长γ9和δ2链共转染J.RT3-T3.5细胞,使其细胞膜表面表达TCRγδ,构建了CDR3区移植型TCRγδ转染细胞系。这种TCRγδ转染细胞系能够模拟γδT细胞特异性识别抗原。2.TCRγδ识别抗原的关键部位是CDR3δ我们构建了卵巢癌TIL中δ2的特异性CDR3序列OT3移植型TCRγδ转染细胞系,命名为OT3γδTCR细胞。OT3γδTCR细胞在多种肿瘤细胞的刺激作用后,活化分泌IL-2。同时,这种活化作用能被抗TCRγδ的单克隆抗体所阻断。OT3γδTCR细胞对多种肿瘤细胞也具有细胞毒作用,杀伤活性也能被抗TCRγδ的单克隆抗体所阻断。另外,γ9链和OT3δ2链共转染及单独的OT3δ2链转染的细胞在肿瘤抗原刺激后IL-2的表达没有差异,提示TCRγδ与肿瘤抗原的结合主要依赖TCRδ2链。OT3γδTCR细胞与肿瘤抗原的反应性高于无关CDR3序列对照转染细胞(即两种细胞表达的TCR具有相同的γ9链和携带不同CDR3区序列的δ2链)。这些结果进一步证实,OT3γδTCR细胞能够模拟γδT细胞特异性识别肿瘤细胞抗原,并且TCRγδ识别抗原的过程中CDR3δ起着关键的作用。3.CDR3δ的侧翼序列是抗原结合特异性的关键决定簇为了进一步探讨CDR3δ与配体作用的分子结构基础,我们将OT3的V、D和J区突变体相对应的核甘酸序列嵌入到完整的δ2链中,与相同的γ9链共转染,构建各个突变体转染细胞,分别命名为VmOT3γδTCR、DmOT3γδTCR和JmOT3γδTCR细胞。在γδTCR表达率相同的前提下,比较各个转染细胞与肿瘤细胞的反应性。结果显示,VmOT3γδTCR细胞和JmOT3γδTCR细胞在HO8910、Hela和SKOV3细胞总蛋白及HSP70、hMSH2 N端蛋白(MNS)和C端蛋白(MCS)刺激作用下,细胞活化表达IL-2的量要远远低于OT3γδTCR细胞的,而DmOT3γδTCR细胞表达IL-2的量降低不明显。同时,在不同的效靶比时,VmOT3γδTCR细胞和JmOT3γδTCR细胞对SKOV3细胞的杀伤作用远远低于OT3γδTCR细胞的,而DmOT3γδTCR细胞的杀伤活性降低不明显。这一结果与我们实验室前期用OT3突变肽检测与肿瘤细胞的结合特性相吻合,进一步提示,正是侧翼序列(V和J)决定了TCRδ2-CDR3与靶细胞的结合。4.CDR3δ97位的疏水性氨基酸在识别非肽抗原和蛋白抗原方面的差异我们用相同的方法也构建了OT10γδTCR转染细胞,OT10是在δ97位具有疏水性氨基酸的CDR3δ序列。非肽抗原刺激OT10γδTCR细胞能分泌IL-2,而当用点突变的方法将897的异亮氨酸(I)突变成同样疏水性氨基酸亮氨酸(L)以及酸性氨基酸天冬氨酸(D)和羟基类氨基酸丝氨酸(S)后,这些突变体转染细胞在非肽抗原刺激作用后IL-2的表达量有所差异。突变成亮氨酸后,IL-2的表达量下降不明显,而突变成另外两种氨基酸后,其IL-2的表达量降低明显或几乎没有。实验结果进一步说明δ97位置的疏水性氨基酸对于非肽抗原的识别至关重要。但是,δ97位的氨基酸突变却不能改变转染细胞对SKOV3细胞总蛋白的识别。提示CDR3δ97位的疏水性氨基酸在识别非肽抗原和蛋白抗原方面存在差异。二、以OT3γδTCR细胞系为探针,利用差异筛选的方法在噬菌体随机展示肽库中进行抗原表位筛选以OT3γδTCR细胞作为探针,用差异筛选的方法,在噬菌体十二肽库中,筛选TCRγδ特异结合的十二肽,得到了两条优势序列。人工合成的优势十二肽的结合特性分析与体外功能实验,证明这两条十二肽都可为OT3γδTCR所识别,提示可能是其抗原表位。这一实验结果证明我们的策略是可行的。本研究通过结构生物学手段进一步验证了CDR3δ在抗原结合中所起的关键作用,即CDR3δ决定抗原结合的特异性。我们所取得重要创新性科学发现为,首次发现CDR3δ侧翼序列的V和J片段决定CDR3δ与配体的结合特异性。由于CDR3δ侧翼序列在结构上是呈现的保守特点,故在理论上推测其CDR3δ侧翼序列只能与结构同样保守的蛋白多肽序列结合。在此意义上说,TCRγδ所识别的配体是结构保守和数量有限的。因此,这一发现为TCRγδ识别抗原的有限多样性提供了强有力的结构生物学证据。我们还首次创立了OT3γδTCR细胞作为探针,以差异筛选的方法,在噬菌体十二肽库中筛选TCRγδ特异结合的十二肽的新策略,并且通过实验验证了这一策略是可行的。利用这一策略将为γδT细胞所识别的肿瘤抗原表位或肿瘤相关抗原表位的发现提供新思路和技术支持,进而为肿瘤的诊断、免疫治疗提供更多更的生物标记物或治疗靶点,为围绕γδT细胞所进行的肿瘤治疗的应用开发奠定坚实的基础。此外,实验中我们还发现了新的人NKG2D的功能性配体,即ULBP4的叁个剪切变体(ULBP4-Ⅰ、ULBP4-Ⅱ和ULBP4-Ⅲ)和RAET1G2的一个剪切变体(RAET1G3)。
代玉梅[9]2011年在《人类γδT细胞对内源性配体分子人MutS同源蛋白2的识别机制及相关天然免疫监视作用研究》文中认为人类γδT细胞是T淋巴细胞中的一个特殊群体,在机体抗肿瘤及抗感染免疫应答中发挥着重要作用。然而,由于已发现和鉴定出的抗原(或配体)数量有限,且缺乏相应的反应性亚克隆T细胞抗原识别受体(T cell receptor, TCR)的结构信息,γδT细胞与肿瘤细胞或病毒感染细胞之间相互作用的分子机制尚有待于进一步阐明。人类MutS同源蛋白2(Human MutS homologue 2, hMSH2)是DNA错配修复蛋白家族的一个重要成员,通常定位于细胞核并与hMSH3或hMSH6形成异源二聚体,参与修复DNA合成中的碱基错配,以保证基因组的忠实性。遗传性或获得性的hMSH2缺陷与诸多癌症的发生、发展及转归密切相关。在前期的研究工作中,本实验室采用基于TCR互补决定区36链(Complementary determining region 3δchain, CDR3δ)肽结合特性的免疫亲和筛选技术策略,用OT3肽探针从卵巢癌细胞系SKOV3的细胞提取物中钓取了叁个可能被Vδ2 TCR识别的配体,hMSH2是其中之一。初步的研究结果表明,hMSH2在SKOV3的细胞表面有异位表达,γδT细胞对SKOV3细胞的杀伤作用亦可为抗hMSH2抗体(Antibody, Ab)部分封闭。鉴于此,我们推测hMSH2是一个能为γδT细胞所识别的、肿瘤相关的内源性抗原(或配体)分子。本研究旨在对此进行验证,并进一步探讨γδT细胞识别hMSH2的分子机制及hMSH2在γ6 T细胞介导的天然免疫监视应答中的作用和意义。本文的第一项研究内容旨在探索hMSH2的膜异位表达在上皮肿瘤细胞中是否具有普遍意义。针对此问题,分析了宫颈癌、胃癌、肺癌、结直肠癌及卵巢癌肿瘤细胞系HeLa、803、NCI-H520、HR8348、SKOV3、HO8910及ES-2细胞中hMSH2的基因序列、mRNA水平及蛋白质表达情况,并对这五种肿瘤病人癌组织标本中hMSH2的分布进行了分析。流式细胞术检测结果表明,hMSH2在受测的七种上皮肿瘤细胞表面均存在异位表达(阳性率14.2～68.2%),而在正常对照细胞HK-2、成纤维细胞及γδT细胞表面则几乎没有表达(阳性率<2.2%),提示hMSH2的膜异位表达在上皮肿瘤细胞中可能具有普遍意义。激光共聚焦扫描显微镜术和免疫组织化学染色分析的结果也显示,hMSH2在上皮肿瘤细胞中出现异常的亚细胞分布,表现为广泛的胞膜、胞质异位表达,胞核分布则多减弱或消失。基因测序结果表明,hMSH2的基因序列在大多数上皮肿瘤细胞系中并无突变,其mRNA表达水平在不同上皮肿瘤细胞系间也存在较大差异。hMSH2在上皮肿瘤细胞表面不寻常的异位表达为其作为γδT细胞识别的配体提供了可能。因此,本文的第二项研究内容重点验证了γδT细胞对肿瘤细胞膜异位表达的hMSH2的识别作用。首先,运用抗体杀伤封闭实验,在HeLa、803及NCI-H520细胞中初步证实了hMSH2的膜异位表达与γδT细胞对上皮肿瘤细胞的细胞毒作用间存在联系。其次,运用小RNA干扰(Small interference RNA, siRNA)技术靶向沉默HeLa、803及NCI-H520细胞中hMSH2的表达,并比较γδT细胞对干扰组及Mock组杀伤效率的差异。结果表明,异位表达的hMSH2的确能被γδT细胞识别,并参与γδT细胞对上皮细胞肿瘤的免疫监视作用。随后,通过杀伤实验及重组hMSH2 (Recombinant hMSH2, rhMSH2)体外刺激实验进一步证实Vδ2 T细胞是hMSH2的主要反应性γδT细胞亚群。最后,通过对HeLa、803及NCI-H520细胞膜蛋白的分离纯化Western blot分析,鉴定出上皮肿瘤细胞膜异位表达的hMSH2为分子量(Molecular weight, MW)约105千道尔顿(Kilodalton, kDa)的全长蛋白质。由于Vδ2 T细胞组成性地表达NKG2D受体,且有研究表明γδT细胞的某些配体分子如MHCⅠ类分子链相关抗原A和B(MHC classⅠ-related chains A and B, MICA/B)、UL16结合蛋白4(UL16-binding protein 4, ULBP4)等存在TCR及NKG2D双重识别机制,本文的第叁项研究内容着重探讨了γδT细胞对hMSH2的识别是否同样存在TCRγδ及NKG2D双重途径。首先,用抗体封闭与siRNA干扰相结合的方法,研究TCRγδ和/或NKG2D封闭是否能够抑制膜异位表达hMSH2所介导的γδT细胞(或NK-92细胞)对肿瘤细胞的识别与杀伤作用；其次,将rhMSH2蛋白在体外与γδT细胞预孵育,经流式细胞术分析rhMSH2对TCRγδ及NKG2D的竞争性结合作用；此外,运用表面离子共振技术(Surface plasmon resonance, SPR)对NKG2D与rhMSH2的直接结合作用及亲和力进行了进一步分析。结果显示,hMSH2介导的γδT细胞(或NK-92细胞)对肿瘤细胞的识别与杀伤能被anti-TCRγδ和/或anti-NKG2D Ab封闭所抑制；rhMSH2能竞争性地与TCRγδ及NKG2D结合;NKG2D能直接与rhMSH2结合,Kd值为132 nM。这些结果说明γδT细胞对hMSH2的识别存在TCRγδ及NKG2D双重途径。γδT细胞在抗病毒感染免疫中发挥着重要作用。γδT细胞识别的某些内源性抗原(或配体)分子,如热休克蛋白(Heat shock protein, HSP) 90、HSP60及ULBPs等,在病毒感染细胞中出现表达上调。因此,本文的第四项研究内容通过建立Epstein-barr病毒(Epstein-barr virus, EBV)转化细胞模型,观察hMSH2在EBV转化类淋巴母细胞中的表达变化及这种变化对γδT细胞清除病毒感染细胞作用的影响,进一步研究了hMSH2在γδT细胞介导的病毒感染免疫监视中的作用。结果表明,EBV感染细胞hMSH2的转录水平及膜异位表达均明显增高；膜异位表达的hMSH2亦介导了γδT细胞对EBV感染细胞的识别,并显着增强了γδT细胞的靶向杀伤作用。这提示hMSH2可能如γδT细胞识别的大多数内源性抗原(或配体)一样具有应激分子的特性,且在γδT细胞介导的抗EBV感染免疫应答中发挥重要作用。综上所述,本文得出的主要结论如下：(1)hMSH2的膜异位表达在上皮肿瘤细胞中具有一定的普遍性；(2)异位表达的hMSH2能被γδT细胞的抗原识别受体TCRγδ和NKG2D双重识别,并主要参与Vδ2 T细胞介导的对肿瘤细胞的杀伤作用；(3)上皮肿瘤细胞膜异位表达的hMSH2为MW约105 kDa的全长蛋白；(4)hMSH2的异位表达能被EBV感染所诱导,并显着增强γδT细胞对病毒感染细胞的清除作用。本研究的创新点体现在：一是初步验证了hMSH2的膜异位表达在上皮肿瘤细胞中具有一定的普遍性,提示hMSH2可能是一个新发现的上皮肿瘤标志分子；二是首次证明hMSH2作为一个肿瘤相关的内源性抗原分子,能通过TCRγδ及NKG2D双重识别途径被γδT细胞识别,为γδT细胞识别的抗原(或配体)谱增添了新的分子,揭示了γδT细胞识别、杀伤上皮来源肿瘤细胞的新的分子机制；三是首次报道了hMSH2分子在EBV感染细胞中的诱导表达,并阐明了该分子在γδT细胞介导的抗EBV感染免疫中的作用,揭示了γδT细胞识别和清除EBV病毒感染细胞的新的分子机制,丰富了目前对γδT细胞在病毒感染免疫中重要作用的认识。总之,本文通过对上皮来源肿瘤细胞及EBV转化B细胞表面hMSH2的异位表达及γδT细胞对其识别机制的深入研究,进一步揭示了γδT细胞免疫监视的新型作用方式,为全面阐明γδT细胞的生物学功能提供了新的线索,亦为建立新的肿瘤及病毒感染免疫治疗策略提供了可能的靶标分子。
宋媛[10]2017年在《细胞因子激活的供体NK细胞和供体γδT细胞在异基因造血干细胞移植中的作用与机制研究》文中研究说明第一部分细胞因子激活的记忆样供体NK细胞在异基因造血干细胞移植后移植物抗白血病中的作用与机制目的:体外实验筛选诱导记忆样NK细胞的细胞因子组合,并验证细胞因子刺激的NK细胞的记忆样细胞表型;体内实验检测细胞因子激活的记忆样供体NK细胞在异基因造血干细胞移植后发挥的移植物抗白血病作用及机制。方法:在体外实验中,培养小鼠骨髓来源的NK细胞,体外加细胞因子IL-12、IL-15、IL-18单独或两两联合或叁者联合刺激NK细胞16小时,并以IL-2刺激的NK细胞作为对照,流式胞膜染色检测细胞因子体外刺激的NK细胞纯度、活化成熟表型,胞内染色检测细胞因子的分泌情况,细胞毒实验及流式染色检测NK细胞对肿瘤细胞体外杀伤水平,并通过体外细胞因子的再次刺激实验检测记忆样NK细胞的记忆能力。以BALB/c(H2Kd)小鼠为受体鼠,经清髓辐照后,过继输注C57BL/6(H2Kb)小鼠的骨髓细胞建立异基因造血干细胞移植模型,于移植当天,过继输注小鼠B细胞淋巴瘤A20(H2Kd)细胞或A20-luc稳转细胞构建小鼠白血病模型,并于移植当天、移植后第7天或移植后第14天输注异基因(CD45.1背景的C57BL/6小鼠H2Kb)来源的体外培养的记忆样NK细胞以及对照NK细胞,观察小鼠生存状况、记录小鼠体重变化并通过小动物活体成像系统监测受体鼠的疾病进展,评价记忆样供体NK细胞在移植物抗白血病中的作用。流式检测移植后过继输注的供体NK细胞在受体鼠体内的活化成熟状态、增殖活性、凋亡水平以及受体鼠内免疫细胞表型,探寻记忆样供体NK细胞在移植物抗白血病中的作用机制。并对以上实验结果进行统计学分析。结果:(1)各细胞因子组合的激活培养对NK细胞纯度没有影响,NK细胞纯度均高于95%,本实验中体外培养的NK细胞高表达成熟分子CD43,IL-12/18以及IL-12/15/18联合刺激培养的NK细胞,其CD11b的表达显着高于对照NK细胞。IL-12/18以及IL-12/15/18刺激培养的NK细胞与对照NK细胞相比,其表面活化分子NKG2D的表达水平降低,而NKp46的表达水平略有升高,细胞因子IL-12/18以及IL-12/15/18刺激培养的NK细胞表面CD25的表达水平明显高于对照NK细胞;IL-12/18以及IL-12/15/18对NK细胞分泌的Granzyme B、Perforin的水平没有影响,与对照相比,IL-12/18以及IL-12/15/18显着增强了NK细胞的IFN-γ的分泌水平;(2)于初次刺激后第四天,用细胞因子IL-12/15再次刺激NK细胞,发现IL-12/18和IL-12/15/18刺激的NK细胞纯度略高于对照NK细胞,并且其CD11b、NKG2D、NKp46、CD25的表达水平明显高于对照NK细胞,IL-12/18和IL-12/15/18刺激的NK细胞再次经IL-12/15刺激后,其IFN-γ的分泌水平显著高于对照NK细胞;初次刺激后第8天,IL-12/18和IL-12/15/18刺激的NK细胞CD25、IFN-γ的表达水平显著高于对照NK细胞,IL-12/15/18刺激的NK细胞其Granzyme B的分泌水平也显着高于对照NK细胞。当第8天用细胞因子再次刺激时,发现IL-12/18和IL-12/15/18激活的NK细胞显着提高了IFN-γ的分泌水平。(3)体内实验中,输注一次供体NK细胞后第15天的活体成像结果显示IL-12/15/18刺激的NK细胞对白血病的发展发挥显着的抑制作用;(4)IL-12/18、IL-12/15/18激活的记忆样NK细胞在体内的活化成熟表型优于对照NK细胞,其Granzyme B、Perforin、IFN-γ的分泌水平在各个靶器官中也得以维持,但是代表其杀伤能力的CD107a的分泌与对照NK相比没有差异;在各个靶器官中,细胞因子激活的记忆样NK细胞在体内的增殖水平高于对照NK细胞,并且其早期凋亡细胞所占百分比低于对照细胞,细胞因子IL-12/18、IL-12/15/18激活的记忆样NK细胞在体内各靶器官中所占的百分比以及绝对数目都要高于传统培养的对照NK细胞;(5)此外输注IL-12/18、IL-12/15/18诱导的NK细胞后,脾脏中CD4+T细胞、CD8+T细胞以及肝脏中CD8+T细胞分泌的TNF-α的水平明显升高,表明其增强了T细胞的抗肿瘤效应。结论:IL-12/18、IL-12/15/18的细胞因子组合可以激活免疫表型为CD43hiCD11bhiCD25hiIFN-γhi的记忆样NK细胞,并且该记忆样NK细胞可以在体内维持良好的活化成熟表型及效应因子的分泌,但不影响NK细胞在体内外对肿瘤细胞的直接杀伤水平。过继输注IL-12/18、IL-12/15/18诱导的免疫记忆样NK细胞通过在体内强大的增殖及存活能力以及对脾脏、肝脏中CD4+T细胞、CD8+T细胞分泌TNF-α的水平的增强,从而在异基因造血干细胞移植后发挥显着的抗白血病效应。第二部分细胞因子激活的记忆样供体NK细胞在异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病中的作用与机制目的:研究IL-12/18、IL-12/15/18激活的记忆样供体NK细胞在异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病中的作用与机制。方法:本实验中构建了两种急性移植物抗宿主病模型,一种是模型对照鼠于一周左右全部死亡的超急性移植物抗宿主病模型;另一种是模型对照鼠于40天左右全部死亡的普通急性移植物抗宿主病模型。以BALB/c(H2Kd)小鼠为受体鼠,在超急性移植物抗宿主病模型中,受体鼠经致死剂量辐照一次以达到清髓效果,过继输注C57BL/6(H2Kb)小鼠的骨髓细胞和脾细胞构建超急性移植物抗宿主病小鼠模型,在普通急性移植物抗宿主病模型中,受体鼠经两次辐照(间隔4小时)以达到清髓效果,然后再输注C57BL/6(H2Kb)小鼠的骨髓细胞和脾细胞。为研究IL-12/18、IL-12/15/18激活的记忆样NK细胞在移植物抗宿主病中的作用,尾静脉注射等量的对照NK细胞、IL-12/18或IL-12/15/18激活的记忆样NK细胞,观察小鼠生存并对小鼠症状进行评分。为研究IL-12/18、IL-12/15/18激活的NK细胞在急性移植物抗宿主病中的作用机制,于移植后第4天,取小鼠脾脏、肝脏、肺脏和小肠等靶器官的淋巴细胞,流式染色检测各靶器官中淋巴细胞免疫表型;于移植后第14天,取受体鼠脾脏淋巴细胞,通过混合淋巴细胞反应实验检测细胞因子体外刺激的供体NK细胞对T细胞异基因反应的影响。并对以上实验结果进行统计学分析。结果:(1)较为缓和的急性移植物抗宿主病模型中,于移植当天单次输注供体NK细胞时,IL-12/18体外刺激的NK细胞与对照NK细胞与未输注NK细胞的模型对照鼠相比,能够明显减缓疾病症状延长小鼠生存率,而IL-12/15/18激活的NK细胞输注则不影响疾病进程;(2)于移植当天、移植后第7天以及移植后第14天多次输注NK细胞,IL-12/15/18诱导的NK细胞表现出加重移植物抗宿主病的趋势,而IL-12/18对疾病的进展仍发挥了一定的控制作用;(3)混合淋巴细胞反应实验表明IL-12/18激活的NK细胞和对照NK细胞能够明显降低T细胞的异基因反应,而IL-12/15/18刺激的NK细胞则对T细胞的异基因反应未产生明显影响;(4)在超急性移植物抗宿主病模型中,于移植当天单次输注对照NK细胞、IL-12/18或IL-12/15/18激活的NK均能够抑制疾病的进展,并且IL-12/18、IL-12/15/18刺激的NK细胞较对照NK细胞发挥更为显着的抑制移植物抗宿主病效应;(5)IL-12/18、IL-12/15/18诱导的NK细胞在超急性移植物抗宿主病模型中能够明显降低T细胞数量,并且明显降低T细胞中T-bet的表达水平。结论:IL-12/18、IL-12/15/18刺激的供体NK细胞在严重的超急性移植物抗宿主病中能够通过控制T细胞数目及T-bet的表达发挥抑制移植物抗宿主病作用,而在缓和的急性GVHD中,IL-12/15/18诱导的供体NK细胞则未表现出抑制移植物抗宿主病作用,而IL-12/18激活的NK细胞的输注显着控制了受体鼠的a GVHD的病情并延长其生存周期。第叁部分供体γδT细胞在异基因造血干细胞移植后移植物抗白血病中的作用与机制目的:研究供体γδT细胞在异基因造血干细胞移植后移植物抗白血病中发挥的作用及其作用机制。方法:体外培养TCRβ-/-小鼠(C57BL/6背景)来源的γδT细胞及其主要亚群Vγ1、Vγ4细胞,流式检测细胞的活化状态和细胞因子分泌水平,细胞毒实验检测Vγ1、Vγ4、γδT细胞对A20细胞的体外直接杀伤水平;以BALB/c小鼠为受体鼠,经清髓辐照后,过继输注野生型C57BL/6小鼠和TCRδ-/-小鼠(C57BL/6背景)的骨髓细胞建立异基因造血干细胞移植移植模型,于移植当天,过继输注小鼠B细胞淋巴瘤A20细胞构建白血病小鼠模型,观察生存并记录体重变化,流式检测移植后各个靶器官中免疫细胞表型、数目和细胞因子分泌情况;在构建的白血病受体鼠中过继输注体外培养的Vγ1、Vγ4、γδT细胞,观察生存并记录体重变化,流式染色检测各脏器中免疫细胞表型;构建白血病小鼠模型,体外培养野生型C57BL/6小鼠、IL-17A-/-小鼠(C57BL/6背景)来源的Vγ4细胞并过继输注到受体鼠内,观察生存并记录体重变化,研究Vγ4细胞分泌的IL-17A在移植物抗白血病中的作用。并对以上实验结果进行统计学分析。结果:(1)当供体γδT细胞缺失时,白血病小鼠的体重下降严重、生存率明显降低,表明供体γδT细胞在体内发挥抗白血病效应;(2)Vγ1、Vγ4、γδT细胞表面高水平表达NKG2D受体,同时可以分泌大量的Granzyme B、TNF-α和IFN-γ,体外对A20有直接杀伤作用,并且在体外发挥主要直接杀伤作用的亚群为Vγ1细胞;(3)当供体γδT细胞缺失时,脾脏、肝脏中CD8+T细胞分泌IFN-γ的量显著降低;(4)过继输注Vγ4细胞能够明显延长白血病小鼠的生存率,有效控制白血病进展,表明其在体内为发挥抗白血病作用的主要细胞亚群;(5)Vγ4细胞分泌的IL-17A在体内发挥了一定的抗肿瘤效应。结论:供体γδT细胞在体内通过调节CD8+T细胞分泌IFN-γ能力发挥抗白血病效应,在体内发挥主要抗白血病效应的亚群为Vγ4细胞。
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