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摘要：目的：对一种新的液体双试剂谷氨酸脱氢酶检测试剂盒（GLDH）进行方法学评价。方法：评价北京九强生物技术股份有限公司新型液体双试剂及英国Randox公司干粉谷氨酸脱氢酶检测试剂盒的精密度、线性、干扰因素、最低检测限、相关性以及稳定性。结果：1）九强及Randox试剂的批内精密度和室内精密度良好；2）在1-120U/L检测范围内，九强及Randox试剂稀释线性良好；3）抗坏血酸、血红蛋白、结合胆红素对测定均无明显干扰，抗丙酮酸干扰性能九强优于Randox；4）两种试剂的最低检测限可以满足临床需求；5）九强与Randox试剂在0.7-120U/L，回归方程为 y（九强）= 1.006x（Randox）-0.108，相关系数为0.999，；6）九强试剂开盖一个月，测定质控稳定性良好，而Randox试剂有明显下降趋势。
结论：九强新推出的液体双试剂谷氨酸脱氢酶（GLDH）检测试剂盒分析性能及稳定性良好，抗干扰能力强，在性能及稳定性上均优于进口Randox干粉试剂，可以定量分析样本中的谷氨酸脱氢酶，也更加方便检验科医生使用。
关键词：谷氨酸脱氢酶；精密度；线性
谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase，GLDH；EC1.4.1.3）是一种主要存在于细胞线粒体基质中的酶，人体中以肝脏含量最高，其次为肾脏、胰腺、脑、小肠粘膜及心脏等器官。
测定GLDH的方法主要有两种方法。
第一种，以谷氨酸为底物，经GLDH催化生成α- 酮戊二酸，α- 酮戊二酸与重氮化磺酸或2，4-二硝基苯肼腙反应，检测吸光度变化。第二种，以α- 酮戊二酸为底物，利用NAD（P）H在340nm下的吸光度变化为测定酶活。
第二种方法为德国临床化学会推荐方法，市场上各个厂家均采用该方法，据我们调研，目前进口试剂均为干粉剂型，不方便临床操作使用，而国内有厂家虽为液体剂型，但抗干扰及稳定性不好，最近北京九强生物技术股份有限公司（简称九强）新推出了一种液体双试剂谷氨酸脱氢酶检测试剂盒，我们以进口英国Randox公司（简称Randox）冻干粉试剂作为对照，对其进行了性能评价。
1.材料与方法
1.1试剂及仪器
分别订购北京九强生物技术股份有限公司（液体双试剂，批号：13-0204P）和英国Randox公司（干粉试剂，包括R1a，R1b，R2，需要复溶，LOT：248404）共两个厂家的试剂盒。试剂均使用Olympus AU2700全自动生化分析仪进行测定。干扰物质为单独购买纯物质添加入基质血清得到。
1.2样本：使用本院门诊及住院患者的血清样本；
1.3测定原理及反应参数
1.3.1测定原理：
在血清或血浆中首先加入乳酸脱氢酶，将内源性的丙酮酸转化为乳酸清除，然后血清中的GLDH催化试剂中的底物（铵离子、α- 酮戊二酸、NADH）反应，生成NAD+，而NADH的消耗速率，即340nm吸光度的变化速率与GLDH的活力成正比，进而测定GLDH的活力；
1.3.2反应参数：
Randox试剂为速率法，S：R1：R2= 15：150：30 主波长：340nm，副波长 410nm，读点16-27；
九强试剂也为速率法，S：R1：R2= 16：150：50 主波长：340nm，副波长 410nm，读点16-27；
1.4方法
1.4.1精密度：
依据美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）EP5-A2文件要求，取高低两个不同水平的GLDH样本，每天测定2批，每批测定2次，评价20天，按照推荐公式，分别计算两种试剂的精密度；
1.4.2线性分析：
选取高值血清样本，使用低值血清样本进行稀释，分别按照1，1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，稀释高值样本，加上水空白（做为0值），共得到8个水平的样本分别使用各自试剂盒测定，评价试剂线性；
1.4.3干扰实验：
选取血清基质（约28U/L），加入抗坏血酸（50mg/dl），血红蛋白（200mg/dl），结合胆红素（50mg/dl），丙酮酸（500 μmol/L）。
1.4.4最低检测限：
依据NCCLS EP-17A 确定 GLDH 的LoB、LoD 和LoQ。空白样品进行60 次测定，每日 1 批，每批重复检测20 次，共3天，记录浓度值，计算LOB。5 个 浓度的低浓度样品做重复测定，测定3批，每批4次，记录浓度值，计算LOD。5个浓度的低浓度样品做重复测定，测定5批，每批8次，记录浓度值，计算LOQ。
1.4.5相关性实验：
选取覆盖检测范围的新鲜血清样本，比较两种试剂的相关性；
1.4.6稳定性实验：
试剂开启后，在试剂仓内开盖放置四周，隔天测定Randox定值质控品（HN1530，Lot 768UN；HE1532，Lot 560UE），观察试剂稳定性。
1.5统计方法
采用Excel 2007进行统计学分析。
2.结果
2.1精密度：
按照EP-5A2 的要求，计算出GLDH的批内精密度及室内精密度，其中九强试剂的批内精密度和室内精密度分别为 S1：1.47%，2.15%，S2：0.88%，1.54%；Randox 试剂分别为S1：1.22%， 2.40%，S2：0.79%，2.22%；具体见表1.
2.2线性分析：
九强试剂线性回归分析方程为y=122.6x + 0.885，R2=0.999，Randox试剂线性回归分析方程为y=119.7x + 1.462，R2=0.998.以稀释比例为x，带入回归方程，计算y的估计值与测定值的相对偏差，两种试剂在1～20 U/L（含20 U/L）范围内线性偏差小于2 U/L，在20～120 U/L范围内线性偏差小于10%，表明两种方法在1-120U/L以内，线性关系良好。
2.2干扰实验：
干扰实验表明，抗坏血酸（50mg/dl），血红蛋白（200mg/dl），结合胆红素（50mg/dl），对九强及Randox试剂均无明显干扰，丙酮酸500 μmol/L对九强试剂干扰小于10%（回收率92.6%），对Randox试剂影响稍大（回收率86.2%）。
2.2最低检测限：
依据NCCLS EP-17A要求，计算得到九强及Randox试剂最低检测限，九强试剂的LOB\LOD\LOQ分别为0.25 U/L、0.43 U/L、0.54 U/L；Randox试剂的分别为 0.14 U/L、0.26 U/L、0.47 U/L；
2.2相关性实验：
选取临床门诊及住院血清样本，剔除超过检测范围高值样本，共测定146例新鲜血清样本，进行两种试剂的相关性比较，结果表明，九强与Randox试剂相关系数为0.999，回归方程为 y（九强）= 1.006x（Randox）-0.108，检测范围为0.7 - 120.0 U/L。
2.3稳定性实验：
开盖数据测定一个月后，见图1，可以看出，九强试剂开盖一个月，测定质控稳定性良好，且偏差均在靶值 2SD以内；而Randox试剂有明显下降趋势；
图1 GLDH试剂开盖稳定性
3.讨论
谷氨酸脱氢酶（GLDH）作为肝脏疾病的辅助诊断指标，在临床上已经有相当长的时间，目前进口试剂均为干粉剂型，因为操作繁琐，在一定程度上限制了该项目在临床上的推广和应用。国内有部分厂家有液体试剂，但稳定性差，且产品没有清除内源性丙酮酸的干扰，测定的不是真正的谷氨酸脱氢酶。本次我们以Randox的干粉试剂作为对照，评价了九强新推出的液体双试剂谷氨酸脱氢酶检测试剂盒。
经本实验室检测及验证，九强液体双试剂精密度良好，线性可达到120U/L；值得注意的是，九强试剂在试剂一中加入了乳酸脱氢酶，清除了内源性丙酮酸，进而降低丙酮酸对测定的干扰，干扰实验显示，九强试剂的抗丙酮酸干扰性能优于进口Randox试剂；九强试剂基本不受抗坏血酸、结合胆红素、血红蛋白的影响。
在相关性检测时，检测日常新鲜血清，大部分样本的GLDH都在1U/L以上，也说明两种试剂盒的最低检测限可以满足临床需要。另外，有极个别样本超过了说明书提到的检测范围上限120U/L，有一例样本九强试剂测值为350U/L，而Randox 测值302.7U/L，稀释4倍后两种试剂测值一致，均为118U/L，即该样本理论值在472U/L，因此在个别样本超过线性高值时，可以按照说明书稀释后测定。
试剂的稳定性实验显示，九强试剂在试剂仓开盖一个月不定标，测定第三方两水平质控与靶值十分接近，而Randox干粉试剂复溶后一个月，测定质控有明显下降。另外，通过本次相关性实验研究表明，九强与Randox试剂测定血清样本的相关性良好（相关性因子R2=0.999），可以满足临床科室的需要。
总之，九强液体双试剂谷氨酸脱氢酶（GLDH）检测试剂盒分析性能及稳定性良好，抗干扰能力强，在性能及稳定性上均优于进口Randox干粉试剂，可以定量分析样本中的谷氨酸脱氢酶，也更加方便检验科医生使用。
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论文作者:石久江1,晏志国2
论文发表刊物:《健康世界》2014年24期供稿
论文发表时间:2016/4/11
标签：试剂论文; 谷氨酸论文; 样本论文; 精密度论文; 血清论文; 丙酮酸论文; 稳定性论文; 《健康世界》2014年24期供稿论文;