龚红建[1]2016年在《Δ133p53协同p73促进DNA双链断裂修复》文中研究说明p53家族在个体发育、肿瘤抑制与发生、细胞周期调控、细胞凋亡等方面有非常重要的作用。p53家族成员(p53、p63和p73蛋白)之间有较高的序列相似性,在DNA结合域上p73与p53蛋白有63%的相似度,p63与p53蛋白有60%的相似度,这也暗示着这三种蛋白能够结合至相同的DNA序列来转录激活同一靶基因,已有研究证明p53家族蛋白都能参与调控某些基因。著名抑癌因子p53蛋白在DNA损伤下被激活且聚集在核内转录调控相关基因,抑制细胞周期或促进细胞凋亡等从而维持基因组的稳定性。但现有研究已经证明p53却抑制DNA双链断裂修复(DSB),似乎与其抑癌功能相悖。近年来已证明p53基因可编码多种异构体,它们可以协同或拮抗p53调节下游信号通路,但对其功能和生物学意义的研究才刚刚开始。p53异构体斑马鱼△113p53以及其在人细胞中的同源蛋白△133p53缺失全部的转录激活域和部分的DNA结合结构域,保留全部的多聚体结构域,它是p53的靶基因,能特异地拮抗p53介导的细胞凋亡。有意思的是它仅被γ-射线照射激活,不被UV和热激激活,那么△113p53/△133p53乃是否在DNA双链断裂中起着重要的作用呢?本论文第一部分工作从以下两个方面探讨了这个科学问题,具体结果如下：1)发现△113p53/A133p53促进]NHEJ、HR和SSA三种DNA DSB修复途径。首先我们观察到△113p53/△133p53只能被DNA双链断裂损伤胁迫诱导表达,然后在斑马鱼和人类细胞系中,采用NHEJ、HR和SSA三种修复分析系统,发现△113p53/神经△A133p53对此三种修复方式都起着促进作用,并不依赖于全长p53。此种促进作用是通过提高DSB修复关键基因Lig4、RadS1以及Rad52的表达来进行的。2)p73协同A133p53促进DNA DSB修复。△133p53蛋白缺失转录激活结构域,却能转录激活Lig4、Rad51和Rad52的表达而不依赖于p53,那么这又是怎样发生的呢?已知p53家族之间都具有类似的寡聚化结构域,不同的异构体可能形成异源多聚体。所以我们检测在DNA DSB下p53其它家族成员的激活表达,发现p73蛋白也可以被DNA双链断裂胁迫激活,且与△133p53表达时期一致。进一步研究发现△133p53促进DNADSB修复是依赖于p73,在DNA DSB胁迫下,敲低p73会增加DNA损伤积累以及加速细胞衰老。免疫共沉淀显示它们在体内可以形成蛋白复合物。染色质免疫共沉淀揭示△133p53促进p73结合到修复相关基因Lig4、Rad51、Rad52基因启动子处,进而激活它们的表达,促进DNA双链断裂修复。我们首次发现了△133p53和p73基因在DNA双链断裂修复的作用,同时也解开了全长p53抑制DNA DSB修复的困惑。本论文第二部分工作是斑马鱼1号染色体22种基因敲除。CRISPR-Cas9技术的发展极大降低了大规模开展斑马鱼基因敲除的成本。为创建中国自己的斑马鱼突变体库,使国内斑马鱼同行广泛受益,同时提升中国斑马鱼领域科学家的国际影响力和话语权,中国科学家组成了大规模敲除斑马鱼1号染色体基因的联盟。在斑马鱼一号染色体整基因敲除计划中,利用CRISPR-Cas9技术,成功构建了22个基因敲除突变体。这些材料最终都会免费通过国家斑马鱼资源中心向国内外学术界公开。通过对于这些基因的逐个敲除,我们可以进一步破解这些基因的功能,从而建立各种发育与疾病模型,最终希望通过这些模型研究与人类相关的发育和疾病研究等。
秦夏[2]2011年在《P53在辐射致DNA损伤反应中的染色质重塑功能研究》文中提出在真核生物中,基因组DNA都是以高度包装的染色质形式存在,这就对基因在转录、复制、修复、重组时相关因子有效地接近DNA形成了天然的屏障,执行上述生理功能需要松散染色质的结构。染色质松散是染色质动态变化即染色质重塑(chromatin remodeling)的重要环节。越来越多的证据表明,染色质重塑在DNA损伤反应中起着非常重要的作用。在细胞DNA损伤反应(DNA damage response, DDR)中,通过染色质重塑可以开放DNA损伤位点,使DNA修复蛋白募集到DNA损伤位点,从而执行和完成修复功能,维持基因组的稳定性。DNA损伤反应过程中的染色质重塑作用和机制研究在最近几年才开始受到关注,由于受到研究技术手段的限制,这方面的信息还不是很多,而且染色质重塑与DNA损伤修复之间的偶联关系与内在机制知之更少。为了深入、直观地研究染色质重塑的分子机制,本研究通过引进并改进一种基于Lac阻遏子和Lac操纵子的大规模染色质重塑报告系统,可以直观地观察靶基因诱导的染色质重塑的时间动力学和强度。本研究的主要目的是探讨DNA损伤修复与染色质重塑之间的偶联机制,并通过大规模染色质重塑报告系统寻找潜在的参与染色质重塑功能的DNA损伤修复反应蛋白,包括P53蛋白、p53诱导基因3蛋白PIG3 (p53-inducible gene 3)等。转录因子P53作为一个重要的抑癌基因,在细胞损伤应答中可诱导细胞周期阻滞、细胞凋亡、细胞分化以及DNA损伤修复等,以维持基因组的稳定性,被誉为“基因组的守护者”。在一系列交错复杂的DNA损伤应答通路中,P53对靶基因的转录激活是其发挥功能的重要方式;另外,细胞在应激状态下,P53的翻译后修饰对于其执行不同的生物学功能有着重要意义。基于P53在DNA损伤修复调控网络中的核心地位,本研究将从染色质大规模重塑这个全新的角度来寻找P53参与DNA损伤修复的证据并进一步探讨DNA损伤修复与染色质重塑之间的偶联机制。作为p53诱发表达上调的靶基因之一,PIG3 (p53-inducible gene 3)参与了细胞早期凋亡反应,同时在DNA辐射损伤的早期应答中发挥重要功能。那么,PIG3在DNA辐射损伤后是否也参与到染色质的大规模重塑呢?这也是本研究要回答的问题之一。本实验建立了一种便捷实用且易于观察和分析的大规模染色质重塑荧光显微检测技术。该技术的原理是借助将256个Lac操纵子插入到DG44 CHO细胞中的基因组中建立的AO3-1细胞株,通过基因共扩增可产生一个大概90Mb的异染色质区域。我们将要检测的目的基因与Lac阻遏子(LacR)及荧光蛋白GFP融合,该质粒转染AO3-1细胞后,表达融合蛋白,其中GFP会发出绿色荧光。基于LacR识别并结合Lac操纵基因的原理,融合蛋白可以靶向到细胞的异染色质区,在激光共聚焦显微镜下直接观察荧光斑点面积的大小。如果目的基因表达产物具有松驰染色质的功能,荧光斑点就相应扩展。因此,通过测算斑点面积就可判断目的基因是否能够诱导包括Lac操纵基因在内的大尺度染色质松散(荧光点面积的大小与染色质松散的程度正相关)。本论文是基于上述技术路线和实验室前期的工作基础,围绕DNA损伤修复研究方向开展的研究,取得了如下的实验进展:(1)用4Gyγ射线分别照射P53野生型的A549细胞和P53缺陷型的H1299细胞,发现辐射损伤后PIG3 (p53-inducible gene 3)的诱导表达只发生在A549细胞,而未发生在H1299细胞。说明电离辐射对PIG3的表达上调是依赖P53基因的功能。同时,PIG3在H1299细胞中有一定的基础表达水平,说明其基础性表达是不依赖P53功能的。(2)基于大规模染色质重塑荧光显微观察技术,构建LacR-PIG3-GFP重组质粒,转染AO3-1细胞,转染后通过激光共聚焦显微镜观察发现,PIG3在正常情况下并未展现出大规模染色质重塑功能,但在10Gyγ射线照射后则能够一定程度地诱导染色质的大尺度松散。提示其在DNA损伤修复与染色质大规模重塑之间发挥一定的偶联作用。(3)通过大规模染色质重塑报告系统对P53基因进行研究发现:P53在正常及辐射损伤情况下都能够诱导染色质的大尺度松散,特别是在辐射损伤后其诱导染色质重塑的功能更加明显。深入研究发现,乙酰转移酶抑制剂漆树酸和DNA-PKcs的特异抑制剂Nu7026能显著抑制P53介导的大规模染色质重塑。微球核酸酶(MNase)消化实验同样证明了P53参与到DNA损伤反应中的大规模染色质重塑。(4)通过定点突变实验,进一步明确了P53第46位丝氨酸位点S46能够抑制P53诱导大规模染色质重塑的活性,而S15,S37,S20,K120位点都能够增强P53诱导大规模染色质重塑的活性。在这其中,K120是乙酰化位点,其余的是磷酸化位点。在本研究中,我们着重探讨了染色质重塑在DNA损伤修复反应中的功能机制,并首次证明了P53直接参与到了染色质大规模重塑反应中。
陈寒嫣[3]2017年在《常用有机磷酸酯阻燃剂对斑马鱼肝脏毒性研究》文中研究指明有机磷酸酯阻燃剂(Organophosphate Flame Retardants,OPFRs)是一种常用的添加型阻燃剂,其已被广泛应用于各种商业和工业产品中。由于OPFRs通常作为添加剂而不与产品化学键合,因此各种含高浓度OPFRs的产品在使用过程中极易将OPFRs释放到环境中。目前,在灰尘、大气、水、土壤、沉积物等环境介质和人体、鱼类、鸟类等生物体内均检测到了 OPFRs的存在。但关于OPFRs的潜在风险和毒性机理的知识仍十分有限。本研究以斑马鱼为受试生物研究了 8种常用OPFRs——磷酸三苯酯TPhP、磷酸甲酚二苯酯CDP、磷酸三乙酯TEP、磷酸三丙酯TPrP、磷酸三丁酯TBP、磷酸三(丁氧基乙基)酯TBEP、磷酸三(2-氯乙基)酯TCEP和磷酸三(1,3-二氯丙基)酯TDCPP对斑马鱼肝脏基因表达的影响和对肝细胞的DNA损伤效应。实验中,将雌雄斑马鱼暴露于1/20(96h-LC50)和1/100(96h-LC50)浓度水平的OPFRs溶液中7天,测定了斑马鱼肝脏中氧化应激、细胞周期调节、DNA修复和凋亡通路中相关基因表达的变化,并通过单细胞凝胶电泳测定了斑马鱼肝细胞的DNA损伤程度。比较了不同OPFRs暴露浓度、不同结构OPFRs对斑马鱼毒性效应的区别,探讨了雌雄鱼对OPFRs暴露的不同响应,并初步分析了造成毒性差异的潜在机制。主要研究结果如下:1)OPFRs暴露改变了斑马鱼肝脏中编码抗氧化酶的基因(Mn-SOD、CuZn-SOD、CAT和GPx)的表达水平,诱导了肝脏中的氧化应激。低浓度TPhP、TBEP和TDCPP的暴露诱导斑马鱼抗氧化系统中基因表达显著上调。高浓度暴露组的雌鱼中,氧化应激相关基因的表达也表现为上调,而雄鱼中抗氧化酶基因表达则受到了抑制。2)OPFRs暴露使斑马鱼肝细胞受到明显的DNA损伤。随着OPFRs暴露浓度的上升,肝细胞DNA损伤程度也随之增加。OPFRs的碳链长度和结构与其造成的DNA损伤程度有一定相关性。雌雄鱼对DNA损伤的耐受性也有所不同,雌鱼对OPFRs的耐受性更强。3)OPFRs处理组中,DNA受损的斑马鱼肝细胞会在DNA合成前期(G1)、DNA合成期(S)或DNA合成后期/有丝分裂期(G2/M)发生阻滞,细胞周期调节相关基因的表达发生变化。高浓度OPFRs暴露后,斑马鱼肝脏中Orc1、Ccna1和Ccnb表达显著下调。低浓度TPhP、TBEP和TDCPP暴露抑制了 Ccnb的表达。4)OPFRs暴露会诱导斑马鱼肝细胞启动DNA修复系统,以修复受损基因。低浓度TPhP、TBEP和TDCPP处理组的斑马鱼,以及高浓度TBP、TBEP和TCEP处理组的雌鱼中DNA修复相关基因Fen1和Rpa3的表达上调,启动了 DNA修复程序。但高浓度OPFRs暴露下的雄鱼中相关修复基因的表达则下调,细胞DNA修复能力下降。5)OPFRs暴露会启动斑马鱼肝细胞凋亡通路。低浓度TPhP、TBEP和TDCPP的暴露引起斑马鱼中凋亡通路下游基因Cas3和Cas9表达水平的上升,诱导依赖细胞凋亡蛋白酶的凋亡通路。同时,随着TPhP、TBEP和TDCPP暴露浓度的升高,斑马鱼肝脏中Bax/Bcl-2比也随之升高,诱导了细胞色素C的释放,进而通过P53-Bax-Bcl-2通路诱导细胞凋亡。6)OPFRs对斑马鱼肝细胞的毒性具有结构特异性、浓度特异性和性别特异性。OPFRs的结构、浓度以及受试斑马鱼的性别不同,均会影响OPFRs的毒性效应。暴露浓度高,对斑马鱼的影响也更为显著。而在相同暴露条件下,雄鱼对OPFRs的响应比雌鱼更为敏感。本研究从基因水平探索了 OPFRs对斑马鱼的毒性效应,为进一步研究OPFRs对斑马鱼的毒性作用机理提供了理论依据,并为全面评价OPFRs的生态健康风险提供了数据支持。
王媛媛[4]2008年在《利用DNA拓扑结构探针研究DNA损伤信号转导》文中研究指明本研究采用由大连理工大学化学生物学课题组设计、合成的-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈衍生物~1a(3-(4-甲基哌嗪)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈)和~3a(3-(3-N,N'-二甲氨基-丙氨基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈)为研究工具，研究了不同程度的DNA构象改变在DNA损伤信号转导中的作用。在确定了~1a和~3a与DNA的结合模式的基础上，证明它们嵌入DNA双螺旋后，对于DNA双螺旋具有不同程度的解旋作用。通过免疫细胞荧光染色，研究细胞内的Ataxia-telangiectasia mutated(ATM)蛋白激酶能够响应~1a和~3a的胁迫，证明了一种新的能够被细胞信号转导通路蛋白ATM监测到的DNA损伤形式，同时确定了~1a和~3a是一对新的可以用来研究DNA损伤信号转导通路的DNA拓扑结构探针。利用~1a和~3a具有不同程度解旋DNA的特性，研究了ATM、RNAPII、p53等蛋白在DNA损伤信号转导中的作用、协同机制和影响因素。~1a触发的ATM磷酸化强于~3a，因此得出结论：ATM的激活程度与DNA解旋程度相关。另外，结合流式细胞术、免疫细胞染色、ChIP、定量PCR(Q-PCR)和Western blot，研究了培养细胞在~1a和~3a的胁迫下，p53的积累及磷酸化，RNAPII的超磷酸化和次磷酸化，以及RNAPII在转录基因上分布动力学，发现~1a可以诱导转录阻滞，最终引发依赖p53的凋亡，而~3a则不可以。以上的研究显示，转录阻滞和DNA解旋的程度相关。进一步的研究发现，在染色质构象改变的过程中，是转录阻滞而不是ATM的激活触发了p53的响应。这说明转录是更敏感的抗癌作用靶点。本研究筛选出一对新的可以用来半定量研究DNA构象损伤信号的DNA拓扑结构探针，并提出了ATM、p53和RNAPII在染色质构象改变诱导的凋亡通路中的作用机制。
杨雪娇[5]2012年在《CYP2A13在AFB1/AFG1所致BEAS-2B细胞急性损伤中的作用及机制》文中进行了进一步梳理黄曲霉毒素（Aflatoxins, AFs）污染是一个全球性的公共卫生问题，在发展中国家尤为严重。目前已鉴定分离的AFs主要包括20余种，而天然存在的AFs主要有四种：黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）、黄曲霉毒素B2（Aflatoxin B2,AFB2）、黄曲霉毒素G1（Aflatoxin G1, AFG1）、黄曲霉毒素G2（Aflatoxin G2,AFG2），其中AFB1毒性最大，属于I类强致癌物。AFs主要污染农作物和食物，生产、制备、加工处理农产品的农业食品业工人经常高暴露于AFs污染的环境中。尽管肝脏一直被认为是AFB1毒作用的重要靶器官，但流行病学和实验室研究表明AFB1暴露可能与肺癌发生有关。国内流行病学和实验室研究亦表明，饮食AFs污染（主要是AFG1）可能与肺癌发生有一定的关联。AFs是间接致癌物，在体内需经代谢活化才能发挥作用。细胞色素P450酶（Cytochrome P450，CYP450）是AFs在体内代谢活化过程中最主要的代谢酶，它能高效代谢活化AFB1/AFG1，生成包括环氧化物在内的多种代谢产物，继而可在体内与DNA、RNA和蛋白质等生物大分子结合形成DNA、RNA和蛋白加合物，攻击机体内的生物大分子，引发细胞毒性、细胞凋亡、周期改变、DNA损伤等毒效应，进而可能引起细胞恶变，引发机体肿瘤。已有研究显示，CYP1A2和CYP3A4是公认的人肝脏代谢AFB1的优势酶，但在肺脏中表达甚微；而CYP2A13是主要在人呼吸系统组织中表达的肝外CYP酶。鉴于CYP2A13在人呼吸道和肺脏中的高表达，CYP1A2几乎不在肺组织中表达，提示CYP2A13可能与人呼吸系统原位代谢AFs并进而引起呼吸系统损伤甚至肿瘤的发生有关。本研究利用细胞及分子生物学手段侧重研究AFs对稳定表达CYP2A13的人支气管上皮细胞（B-2A13）的毒性作用，通过与CYP2A6和CYP1A2进行比较，系统探讨了CYP2A13代谢活化AFs并导致细胞毒作用的能力，为阐明AFs与人呼吸系统损伤及肿瘤的关系提供线索。一、AFB1对B-2A13细胞的急性损伤效应及分子机制（一）目的选用已验证的稳定表达AFB1代谢相关CYP450酶的单克隆BEAS-2B细胞株（B-CYPs）作为细胞模型，通过观察和比较经AFB1处理所致的细胞急性毒效应、细胞凋亡、细胞周期改变、DNA损伤作用以及相关的分子机制，系统阐述CYP2A13在代谢活化AFB1及其致细胞损伤中的关键作用，为深入探讨CYP2A13在空气AFB1污染引起呼吸系统损伤中的作用及相关的防治措施提供线索。（二）方法1、AFB1（或AFB2）所致B-2A13细胞的急性毒效应采用MTT法测定细胞活性。用不同浓度的AFB1（1~10,000nM）或AFB2（1~100,000nM）处理B-CYPs细胞24或48h，通过比较细胞活性的差异，评价不同CYP450酶对AFB1或AFB2的代谢活化能力；此外，用0、1、10、100和500nM的AFB1处理B-2A13细胞6、12、24或48h，以观察AFB1所致细胞毒性的时间-反应关系。为进一步确认上述效应，分别给予B-2A13细胞两种处理：①分别联合给予100nM的AFB1和不同浓度的尼古丁（1、10和100μM）或8-MOP（0.01、0.1和1μM）24、48或72h；②先给予100μM尼古丁或1μM8-MOP处理2h，经1×PBS清洗后再加入100nM AFB1继续处理24、48或72h，通过分析尼古丁或8-MOP对AFB1所致细胞毒性的影响，验证CYP2A13对AFB1的代谢活化作用。2、AFB1所致B-2A13细胞的凋亡作用采用Hoechst33258染色和流式细胞仪分别检测细胞凋亡，采用Western blot检测相关凋亡蛋白的表达。首先用0、5、10、20、40和80nM AFB1处理B-CYPs细胞24h，再用相同浓度的AFB1处理B-2A13细胞12、24或48h，观察时间-反应关系，采用Hoechst33258染色测定细胞凋亡情况；此外，用0、5、20、80nM的AFB1处理单克隆细胞模型24h，采用流式细胞术验证细胞的凋亡情况。采用Western blot检测上述各浓度（或时间）点的相关凋亡蛋白的表达。为验证上述效应，分别采用80nMAFB1和100μM尼古丁（CYP2A13代谢活化AFB1的竞争性底物）或1μM8-MOP（CYP450酶的抑制剂）联合处理B-2A13细胞24h，进一步观察细胞凋亡状况并对相关凋亡蛋白的表达进行评价。3、AFB1所致B-2A13细胞的DNA损伤和修复作用采用彗星实验检测DNA损伤，Western blot检测DNA损伤和修复相关蛋白。首先用0、5、10、20、40和80nM AFB1处理B-CYPs细胞24h，比较不同CYP450酶对AFB1所致细胞DNA损伤的影响；然后再用相同浓度的AFB1处理B-2A13细胞6、12或24h，评价AFB1致B-2A13细胞DNA损伤的时间-反应关系。为评价DNA损伤后的修复效应，先用40nM AFB1处理B-2A13细胞24h，换新鲜培养基继续培养6、12或24h，检测各组DNA损伤的修复程度。同样，用80nM AFB1联合100μM尼古丁或1μM8-MOP处理B-2A13细胞24h，验证AFB1对B-2A13细胞的损伤作用。此外，通过分析上述各剂量（时间）点DNA损伤和修复蛋白的表达，评价AFB1致B-2A13细胞DNA损伤和修复的分子机制。4、AFB1对B-2A13细胞周期的影响采用流式细胞仪测定细胞周期。首先用0和80nM AFB1处理B-CYPs细胞24h，观察各细胞周期的变化；然后采用0、5、20和80nM AFB1处理B-2A13细胞24h，分析AFB1致B-2A13细胞周期变化的剂量-反应关系；最后再利用100μM尼古丁或1μM8-MOP与80nM AFB1的联合处理B-2A13细胞24h，进一步验证AFB1对B-2A13细胞周期的影响。5、AFB1所致B-2A13细胞DNA加合物的形成及8-OHdG和γH2AX蛋白的表达用0和80nMAFB1处理B-CYPs细胞24h，免疫荧光方法检测AFB1-DNA开环加合物的形成及8-OHdG和γH2AX蛋白的表达；此外，再利用100μM尼古丁或1μM8-MOP与80nM AFB1联合处理B-2A13细胞24h，进一步验证AFB1对B-2A13细胞AFB1-DNA开环加合物的形成以及8-OHdG和γH2AX蛋白表达的影响。（三）结果1、AFB1（或AFB2）所致B-2A13细胞的急性毒效应随着AFB1浓度的增加，B-2A13细胞活性呈现出剂量依赖性下降；随着AFB1处理时间的增加，B-2A13细胞活性也呈时间依赖性降低；AFB1处理细胞48h，B-2A13、B-1A2和B-2A6细胞的IC50值分别为140nM、740nM（约为B-2A13的5倍）和3020nM（约为B-2A13的20倍），B-2A13细胞显然比B-1A2细胞敏感，而B-2A6细胞则和空载细胞（B-Vector）一样，对AFB1的敏感性较差。AFB2对各B-CYPs细胞基本无毒性作用。尼古丁和8-MOP都可剂量依赖地抑制AFB1所致的B-2A13细胞毒作用，100μM尼古丁或0.1μM8-MOP处理细胞均可完全抑制AFB1的细胞毒作用。结果提示，CYP2A13在AFB1所致的细胞急性毒效应中有重要作用。2、AFB1所致B-2A13细胞凋亡作用无论Hochest33258染色结果还是流式细胞仪结果均显示，不同浓度AFB1处理各细胞24h，B-2A13细胞凋亡率存在着剂量-反应关系，B-Vector、B-1A2、B-2A6细胞基本无凋亡；不同浓度AFB1处理B-2A13细胞12、24或48h，B-2A13细胞凋亡率存在着时间-反应关系。100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFB1所致的细胞凋亡。结果提示，CYP2A13在AFB1所致的细胞凋亡中有重要作用。通过对凋亡相关蛋白表达的分析发现，C-PARP、C-Caspase-3蛋白表达随AFB1剂量增加而增加，并在20nM AFB1处理时显著增加（P<0.001）；Bcl-2蛋白表达随AFB1剂量增加而减少，Bax蛋白表达随AFB1剂量增加而增加。C-PARP、C-Caspase-3蛋白表达随处理时间的延长而显著增加（P<0.001）。与80nM AFB1处理组相比，100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFB1所致的细胞C-PARP、C-Caspase-3蛋白表达的增加（P<0.05, P<0.001），并可抑制AFB1所致的细胞Bcl-2蛋白表达的减少。结果提示，AFB1引起的B-2A13细胞凋亡可能与线粒体信号通路的激活有关。3、AFB1所致B-2A13细胞DNA损伤和修复作用不同浓度AFB1处理各细胞24h，B-2A13细胞DNA损伤存在着剂量-反应关系，B-2A13细胞DNA损伤效应强于B-1A2细胞，约为B-1A2细胞的3倍；B-Vector和B-2A6细胞基本无DNA损伤。不同浓度AFB1处理B-2A13细胞6、12或24h，DNA损伤存在着时间-反应关系。与24h+0h处理组相比，换用新鲜培养基继续培养，其AFB1所致的细胞DNA损伤效应仍继续存在，且随培养时间的延长，DNA损伤效应增强（P<0.001）。而100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFB1所致的DNA损伤（P<0.001）。结果提示，CYP2A13在AFB1所致的细胞DNA损伤中有重要作用。Western blot结果显示，p-ATM、p-BRCA1、p-Chk1、p-Chk2、p-p95、p-p53、γH2AX蛋白表达随AFB1剂量增加而增加；p-ATR、Mre11、Ku-80、XLF、Rad50、Rad52的蛋白表达水平基本未变。与20nM处理24h+0h组相比，DNA-PK、p-BRCA1、p-ATM、p-Chk1、p-Chk2、p-p95、p-p53、γH2AX蛋白表达随时间的增加而增加；Mre11、Ku-80、XLF、Rad50、Rad52的蛋白表达水平基本未变。上述实验中，CYP2A13和GFP的表达始终未变，提示细胞具有良好的稳定性。此外，100μM尼古丁或1μM8-MOP与80nM AFB1共处理细胞，可明显抑制AFB1所致的细胞p-BRCA1、p-ATM、p-Chk1、p-Chk2、p-p95、p-p53、γH2AX蛋白表达的增加。结果表明，AFB1引起的B-2A13细胞DNA损伤，可能通过激活DNA损伤修复相关蛋白的表达而发生。4、AFB1对B-2A13细胞周期的影响80nM AFB1处理各细胞24h，B-2A13和B-1A2细胞出现明显的S期阻滞（P<0.001），且B-2A13细胞S期阻滞现象较B-1A2细胞明显（P<0.001）；B-2A13细胞出现的S期阻滞存在着一定的剂量-反应关系；100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFB1所致的细胞周期改变（P<0.001）。结果表明，AFB1所致的B-2A13细胞周期改变主要以S期阻滞为主。5、AFB1所致B-2A13细胞DNA加合物的形成及8-OHdG和γH2AX蛋白的表达与DMSO处理组相比，B-2A13和B-1A2细胞核中有明显的AFB1-DNA开环加合物的形成（P<0.001），但B-2A13细胞相对荧光强度约为B-1A2细胞的9倍（311vs36），B-2A6和B-Vector细胞核中未见AFB1-DNA开环加合物的形成。同样，B-2A13和B-1A2细胞核中8-OHdG的表达明显增加（P<0.001），且B-2A13细胞的相对荧光强度约为B-1A2细胞的3倍（160vs55），B-2A6和B-Vector细胞核中无明显的8-OHdG表达。此外，B-2A13细胞核中出现γH2AX的显著表达（P<0.001），但B-1A2、B-2A6和B-Vector细胞核中未见γH2AX的表达。100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFB1所致DNA加合物的形成及8-OHdG和γH2AX蛋白的表达（P<0.001）。结果提示，CYP2A13可代谢活化AFB1生成AFB1-exo-8,9-环氧化物，并与细胞中DNA结合形成DNA加合物；此外，AFB1可致B-2A13细胞DNA中鸟嘌呤发生氧化损伤，可致细胞DNA发生双链断裂。（四）小结1．AFB1对B-CYPs细胞的损伤效应明显强于AFB2，B-2A13细胞对AFB1的毒作用比B-1A2细胞敏感，远强于B-2A6细胞及空载细胞（B-Vector），结果进一步证实了CYP2A13对AFB1较强的代谢活化能力，可能是AFB1的潜在的优势代谢酶。2．AFB1诱导的B-2A13细胞凋亡，可能是通过线粒体途径发挥作用的，而其诱导的细胞DNA损伤，可能与DNA损伤修复相关蛋白的激活有关。3．初步证实了AFB1可诱导B-2A13细胞形成AFB1-DNA开环加合物，并诱导细胞表达8-OHdG和γH2AX蛋白，从而导致细胞氧化损伤并最终发生DNA双链断裂，可能是其导致细胞毒性、细胞凋亡、DNA损伤和细胞周期改变的分子机制。二、AFG1对B-2A13细胞的急性损伤效应（一）目的通过观察和比较AFG1对B-CYPs细胞的急性损伤效应及其相关蛋白的表达，初步揭示CYP2A13对AFG1的代谢活化作用，阐明CYP2A13在AFG1所致细胞毒性、细胞凋亡以及DNA损伤中的关键作用，为探讨CYP2A13在空气AFG1及AFB1混合污染引起的呼吸系统损伤及其健康危害中的作用提供实验依据。（二）方法1、AFG1（或AFG2）所致B-2A13细胞的急性毒效应分别采用不同浓度的AFG1（1~10,000nM）或AFG2（1~100,000nM）处理B-CYPs细胞24或48h，MTT法检测细胞活性。此外，分别给予B-2A13细胞以下两种处理：①分别给予100nMAFG1和不同浓度尼古丁（1、10和100μM）或8-MOP（0.01、0.1和1μM）共同培养24、48或72h；②先给予100μM尼古丁或1μM8-MOP处理2h，再用1×PBS清洗细胞，最后加100nM AFG1继续处理24、48或72h，然后采用MTT法测定细胞活性。2、AFG1所致B-2A13细胞凋亡作用用0、5、20和80nMAFG1、80nM AFB1、10,000nMAFB2和10,000nMAFG2处理B-CYPs细胞24h，Hoechst33258染色测定细胞凋亡情况；用0、5、20和80nM AFG1、80nM AFB1和10,000nM AFG2处理B-2A13和B-Vector细胞24h，流式细胞仪测定细胞凋亡情况；此外，先用80nM AFG1与100μM尼古丁或1μM8-MOP联合处理B-2A13细胞24h，再用Hoechst33258染色和流式细胞仪检测细胞凋亡。3、AFG1所致B-2A13细胞DNA损伤作用用0、5、20和80nMAFG1、80nM AFB1、10,000nMAFB2和10,000nMAFG2处理B-2A13和B-Vector细胞24h，彗星实验检测细胞DNA损伤作用；此外，用80nM AFG1与100μM尼古丁或1μM8-MOP联合处理B-2A13细胞24h，彗星实验检测细胞DNA损伤作用。4、AFG1对B-2A13细胞周期的影响用0和80nM AFG1处理B-CYPs细胞24h，流式细胞仪测定各细胞周期；然后用0、5、20和80nM AFG1处理B-2A13细胞24h，评价AFG1对B-2A13细胞周期的影响。最后，再用80nMAFG1与100μM尼古丁或1μM8-MOP处理B-2A13细胞24h，进一步验证AFG1对B-2A13细胞周期的影响。5、AFG1所致B-2A13细胞8-OHdG和γH2AX蛋白的表达用80nM AFG1与100μM尼古丁或1μM8-MOP联合处理B-2A13细胞24h，免疫荧光方法检测8-OHdG和γH2AX蛋白，评价AFG1对8-OHdG和γH2AX蛋白表达的影响。（三）结果1、AFG1（或AFG2）所致B-2A13细胞急性毒效应与AFB1的作用类似，AFG1对B-CYPs细胞的毒效应呈现剂量依赖性增加，B-2A13细胞的敏感性要显著强于B-1A2细胞，远高于B-2A6和B-Vector细胞，而AFG2对各细胞的毒性都不明显；随AFG1处理时间的增加，B-2A13细胞活性呈现剂量依赖性降低，且有时间-反应关系；AFG1处理细胞48h，B-2A13、B-1A2和B-2A6细胞的IC50值分别为140nM，4320nM（约为B-2A13的30倍）和6290nM（约为B-2A13的45倍）。尼古丁和8-MOP都可剂量依赖地抑制AFG1所致的B-2A13细胞的毒性作用，100μM尼古丁或0.1μM8-MOP均可完全抑制AFG1所致的B-2A13细胞的毒性作用。结果表明，CYP2A13在AFG1代谢活化所致的细胞毒作用中发挥了重要作用。2、AFG1所致B-2A13细胞凋亡作用不同浓度AFG1处理B-CYPs细胞，B-2A13细胞凋亡率存在剂量依赖性增加，80nM AFG1处理细胞，其细胞凋亡率略低于同样浓度的AFB1，而10μMAFB2或10μM AFG2处理各细胞，基本未见细胞凋亡。流式细胞仪与Hoechst33258染色均显示，AFG1对B-Vector、B-1A2、B-2A6细胞基本无细胞凋亡作用。100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFG1所致的细胞凋亡（P<0.001）。结果提示，AFG1的细胞损伤效应明显强于AFG2，CYP2A13在AFG1所致细胞凋亡中发挥重要作用。3、AFG1所致B-2A13细胞DNA损伤作用不同浓度AFG1处理B-CYPs细胞，B-2A13细胞DNA损伤存在着剂量依赖性增加，而B-Vector细胞基本无DNA损伤。与DMSO处理组相比，80nMAFG1可诱导B-2A13细胞发生DNA损伤(P<0.001），其效应略低于同浓度的AFB1；10μM AFB2或10μM AFG2基本不能诱导细胞发生DNA损伤。此外，100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFG1所致的DNA损伤（P<0.001）。结果提示，AFG1的DNA损伤效应明显强于AFG2，CYP2A13在AFG1所致细胞DNA损伤中发挥重要作用。4、AFG1对B-2A13细胞周期的影响80nM AFG1处理各细胞24h，B-2A13细胞出现S期阻滞（P<0.001），且B-2A13细胞S期阻滞存在剂量-反应关系；100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFG1所致的细胞周期改变（P<0.001）。结果表明，AFG1可引起B-2A13细胞发生以S期阻滞为主的细胞周期变化，CYP2A13在其中发挥了重要作用。4、AFG1所致B-2A13细胞8-OHdG和γH2AX蛋白的表达与DMSO处理组相比，B-2A13细胞核中出现8-OHdG和γH2AX蛋白的显著表达（P<0.001）；100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFG1所致8-OHdG和γH2AX蛋白的表达（P<0.001）。结果表明，CYP2A13在AFG1诱发的细胞氧化损伤和DNA双链断裂中发挥重要作用。（四）小结1．AFG1对B-CYPs细胞的损伤效应与AFB1相近，明显强于AFG2，B-2A13细胞对AFG1的毒作用较B-1A2细胞敏感，远强于B-2A6细胞及空载细胞（B-Vector），结果首次证实了CYP2A13有较强的代谢活化AFG1的能力，可能也是AFG1潜在的优势代谢酶。2．初步证实了AFG1可诱导B-2A13细胞表达8-OHdG和γH2AX蛋白，从而导致细胞氧化损伤并最终发生DNA双链断裂，可能是其导致细胞毒性、细胞凋亡、DNA损伤和细胞周期改变的分子机制。
苏智雄[6]2007年在《氧化损伤与修复机制在黄曲霉毒素相关原发性肝癌的发生与化疗反应性中的作用》文中提出第一部分黄曲霉毒素B1对原发性肝癌患者外周血淋巴细胞氧化损伤的实验研究目的通过低浓度黄曲霉毒素B1处理体外培养外周血淋巴细胞,了解黄曲霉毒素B1对体外培养淋巴细胞氧化损伤及修复机制的影响;同时探讨潜在性功能性DNA修复基因多态性在其中的作用。方法采取10例健康人和20例肝癌患者外周血淋巴细胞作为研究对象,流式细胞技术检测不同剂量黄曲霉毒素B1诱导的DNA氧化损伤水平,同时测定细胞内超氧化物岐化酶(SOD)、脂质过氧化损伤产物-丙二醛(MDA)、羟自由基(OH~-)及活性氧含量,以了解黄曲霉毒素B1对体外培养淋巴细胞抗氧化能力、脂质过氧化损伤及氧化水平的影响。此外,运用RT-PCR检测黄曲霉毒素B1诱导后淋巴的DNA损伤修复酶基因P53、P21、hOGG1、APE、PARP的表达,并对APE、hOGG1基因分型。采用基因组学与毒理学相结合、基因结构和基因功能相结合的方法考察潜在性功能性DNA修复酶多态性。结果1.低浓度黄曲霉毒素B1干预后,淋巴细胞8-羟基鸟嘌呤(8-oxoG)染色阳性率和荧光强度均高于空白组,肝癌组的淋巴细胞8-oxoG染色阳性率和荧光强度均高于对照组(P<0.05)。2.上清液总超氧化物岐化酶T-SOD活力,随着AFB1浓度的增加而降低,各剂量组与空白组相比,T-SOD含量差异有显著性(P<0.01);上清液OH~-含量,随着黄曲霉毒素B1浓度的增加而逐渐增加,最高剂量组与空白组相比,OH~-含量差异有显著性(P<0.05)。经偏相关分析结果,8-oxoG与OH~-成显著正相关,相关系数为0.3812,P=0.038,8-oxoG与T-SOD成显著负相关,相关系数为-0.5539,P=0.001。3.20μg/ml AFB1处理时,P53、P21、hOGG1、APE和PARP的mRNA表达水平最高,与空白组相比有统计学差异(P<0.05)。4.携带APE Glu148Asp位点变异基因型(GC和CC)个体的DNA损伤高于野生型基因型(GG)的个体,两者之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.黄曲霉毒素B1暴露后肝癌患者外周血淋巴细胞的氧化损伤比正常人为高。2.黄曲霉毒素B1暴露后淋巴细胞的损伤主要由黄曲霉毒素B1诱导产生过多的OH~-所致。3.黄曲霉毒素B1暴露后淋巴细胞内8-oxoG水平与修复酶APE基因型相关。携带变异基因型APE 148Asp者黄曲霉毒素B1诱导后淋巴细胞的DNA损伤较重。第二部分DNA修复酶hOGG1和PARP在原发性肝癌和肝硬化组织中差异表达的临床病理意义目的通过检测DNA修复酶hOGG1及PARP在原发性肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)及肝硬化组织中的表达,探讨hOGG1和PARP在HCC和肝硬化组织中的表达特点及其与临床病理因素的关系。方法应用EnVision免疫组化法检测41例非HCC正常肝组织、99例HCC、51例HCC癌旁肝硬化组织中hOGG1和PARP表达情况。结果在HCC组织中hOGG1和PARP在细胞核与细胞质中均可表达,其中hOGG1细胞核阳性分度在正常组、肝硬化组、HCC组之间依次增高(P<0.001),阳性表达率分别为29.3%、52.9%、77.8%;PARP细胞核阳性分度在正常组、肝硬化组、HCC组之间依次降低(P<0.001),阳性表达率分别为70.7%、56.9%、29.3%。多因素分析显示:hOGG1蛋白在细胞核表达与ALT有关(相对危险度为1.022,P=0.041),hOGG1蛋白在细胞浆表达与总胆红素有关(相对危险度为1.155,P=0.018),PARP蛋白在细胞浆表达与外周血白细胞数(相对危险度为0.757,P=0.037)有关。结论在HCC发生过程中hOGG1蛋白在肝细胞核中的表达可能随着病程进展而增强,PARP蛋白在肝细胞核中的表达可能随着病程进展而降低,可能反应了从肝硬化到肝癌进程中肝细胞内氧化应激状态的改变。第三部分术前化疗对DNA修复酶hOGG1及PARP在原发性肝癌组织中表达的影响目的通过检测DNA修复酶hOGG1及PARP在原发性肝癌及癌旁组织中的表达,探讨术前化疗对损伤修复机制的影响。方法应用EnVision免疫组化法检测41例正常肝组织、187例(术前未做化疗患者99例和术前行经肝动脉插管化疗患者88例)原发性肝癌患者的肝癌组织和癌旁组织中hOGG1、PARP的表达。结果正常肝组织、术前化疗组与术前未化疗组的肝癌组织hOGG1蛋白细胞核表达阳性分度依次递增,三者之间差异有统计学意义(均P<0.05);正常肝组织、术前化疗组与术前未化疗组的肝癌组织PARP蛋白细胞核表达阳性分度依次递减,三者之间差异有统计学意义(均P<0.05)。PARP癌旁组织阳性表达强度(P=0.038)、ALT(P=0.001)、病理分级(P=0.040)是肿瘤复发的危险因素,外周血淋巴细胞数(P=0.026)、化疗(P=0.049)是肿瘤复发的保护因素。结论1.术前化疗可以杀伤对氧化损伤敏感的肝癌细胞,表现为未化疗组癌组织hOGG1蛋白表达高于化疗组癌组织,未化疗组癌组织PARP蛋白表达低于化疗组癌组织。2.经过术前化疗药物筛选的DNA损伤修复能力加强的癌细胞如果逃避了手术切除可能成为术后复发的来源。3.PARP癌旁组织阳性表达强度高的患者,肝癌复发的可能性增加,PARP也许可以成为提示肝癌患者预后的新指标。
王武斌[7]2017年在《泛素连接酶RING2对苯并[a]芘导致的BPDE-DNA加合物及ATR-CHK1信号通路的影响》文中认为目的:观察泛素连接酶RING2对苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,B(a)P]导致的人肺来源细胞(16HBE、BEAS-2B、VA13)BPDE-DNA加合物变化及ATR-CHK1-CDC25A-CDK2信号通路中相关蛋白表达及磷酸化水平的影响,初步探讨组蛋白单泛素化关键酶RING2在DNA损伤应答中的作用。方法:通过SiRNA技术降低肺来源细胞中泛素连接酶RING2的表达水平,构建RING2低表达细胞模型。用不同浓度的BaP(0、1、2、4、8、16、32μmol/L)染毒三种肺来源细胞的三型细胞(WT、Si-NC、Si-RING2)24 h,以16μmol/L BaP染毒三种肺来源细胞的三型细胞不同时间(0、1、2、4、8、12、24 h)。使用免疫组化荧光法检测各组细胞中BPDE-DNA加合物的表达情况,采用蛋白免疫印迹法检测细胞总蛋白中共济失调-毛细血管扩张有关激酶(Ataxia telangiectasi and Rad3 related,ATR)、细胞周期检测点激酶1(Checkpoint kinase 1,CHK1)及其Ser345-p、CDC25A(cell division cycle 25 homolog A,细胞分裂周期蛋白25A)及其S76-p、周期素依赖性蛋白激酶2(Cyclin dependent kinase 2,CDK2)及其Y15-p的表达水平。结果:免疫组化荧光检测结果显示,与三种肺源性细胞的WT型对照组相比,各细胞型(WT、Si-NC、Si-RING2)染毒组的荧光强度均增加(P<0.01),其中三种肺源性细胞的Si-RING2型染毒组的荧光强度最强。16μmol/L B(a)P染毒24 h处理组中,16HBE(Si-RING2)染毒组的荧光强度较16HBE(WT)染毒组增加了41.3%,差异有统计学意义(P<0.01);BEAS-2B(Si-RING2)染毒组的荧光强度较BEAS-2B(WT)染毒组增加了31.7%,差异有统计学意义(p<0.01);va13(si-ring2)染毒组的荧光强度较va13(wt)染毒组增加了51.4%,差异有统计学意义(p<0.01)。蛋白免疫印迹法结果显示,随着染毒时间和染毒浓度的增加,三种肺源性细胞wt型的atr,chk1、chk1s345-p、cdc25as76-p和cdk2y15-p的水平逐渐升高,而cdc25a和cdk2的水平逐渐下降(p<0.01);三种肺源性细胞si-ring2型的atr、chk1、chk1s345-p、cdc25as76-p和cdk2y15-p的水平逐渐下降,而cdc25a和cdk2的水平逐渐升高(p<0.01)。(1)、协方差分析控制染毒浓度因素后,16hbe(si-ring2)组atr、chk1、chk1s345-p、cdc25as76-p和cdk2y15-p水平的修正均数(0.804、0.823、0.756、0.728和0.834)较16hbe(wt)组的修正均数(1.473、1.311、1.375、1.387和1.331)明显降低,16hbe(si-ring2)组cdc25a和cdk2水平的修正均数(1.324和1.293)较16hbe(wt)组的修正均数(0.803和0.767)明显升高(p<0.01));beas-2b(si-ring2)组atr、chk1、chk1s345-p、cdc25as76-p和cdk2y15-p水平的修正均数(0.775、0.831、0.726、0.800和0.677)较beas-2b(wt)组的修正均数(1.356、1.334、1.429、1.366和1.270)明显降低,beas-2b(si-ring2)组cdc25a和cdk2水平的修正均数(1.369和1.395)较beas-2b(wt)组的修正均数(0.775和0.811)明显升高(p<0.01);va13(si-ring2)组atr、chk1、chk1s345-p、cdc25as76-p和cdk2y15-p水平的修正均数(0.831、0.863、0.837、0.666和0.838)较va13(wt)组的修正均数(1.322、1.343、1.392、1.450和1.506)明显降低,va13(si-ring2)组cdc25a和cdk2水平的修正均数(1.325和1.324)较va13(wt)组的修正均数(0.830和0.793)明显升高(p<0.01)。(2)、协方差分析控制染毒时间因素后,16hbe(si-ring2)组atr、chk1、chk1s345-p、cdc25as76-p和cdk2y15-p水平的修正均数(0.836、0.751、0.726、0.808和0.796)较16hbe(wt)组的修正均数(1.264、1.309、1.324、1.389和1.430)明显降低,16hbe(si-ring2)组cdc25a和cdk2水平的修正均数(1.255和1.396)较16hbe(wt)组的修正均数(0.791和0.781)明显升高(p<0.01);beas-2b(si-ring2)组atr、chk1、chk1s345-p、cdc25as76-p和cdk2y15-p水平的修正均数(0.715、0.736、0.782、0.800和0.807)较beas-2b(wt)组的修正均数(1.316、1.342、1.536、1.373和1.302)明显降低,beas-2b(si-ring2)组cdc25a和cdk2水平的修正均数(1.323和1.233)较beas-2b(wt)组的修正均数(0.776和0.743)明显升高(p<0.01);VA13(Si-RING2)组ATR、CHK1、CHK1 S345-p、CDC25A S76-p和CDK2 Y15-p水平的修正均数(0.744、0.817、0.784、0.743和0.820)较VA13(WT)组的修正均数(1.399、1.447、1.351、1.369和1.291)明显降低,VA13(Si-RING2)组CDC25A和CDK2水平的修正均数(1.369和1.315)较VA13(WT)组的修正均数(0.819和0.835)明显升高(P<0.01)。结论:1、B(a)P会导致细胞内BPED-DNA加合物增加,RING2低表达的细胞DNA对B(a)P更加敏感,这提示RING2可能会影响DNA的损伤修复;2、B(a)P会导致DNA损伤应答通路ATR-CHK1-CDC25A-CDK2的激活,暴露于B(a)P中的RING2低表达的细胞内该通路被抑制。以上结论提示泛素连接酶RING2可能会通过影响DNA损伤应答通路ATR-CHK1-CDC25A-CDK2的活性来影响受损DNA的修复。
宋秀芳[8]2017年在《四氯苯醌调控MDA-MB-231细胞DNA损伤修复的机制分析》文中研究指明四氯苯醌(TCBQ)由氯酚类化合物五氯酚(PCP)代谢产生。作为持久性有机污染物(POPs)分子中的典型代表,PCP具有“三致”(致癌、致畸、致突变)毒性和环境激素效应,对人类健康危害极大。PCP在自然环境中化学性质稳定,但也能通过电化学反应、光催化反应及生物体内代谢等多种途径降解生成代谢物四氯氢醌(TCHQ)和TCBQ。PCP在体内代谢产生大量活性氧(ROS),破坏机体氧化还原平衡,引起一系列严重的人类疾病如炎症、神经退行性疾病、免疫缺陷、早衰和肿瘤等。DNA双链断裂(DSBs)被公认为是DNA损伤中最为严重的损伤形式,如果不能及时而准确地修复,可能会引起基因突变和染色体断裂,从而导致癌变。真核生物依靠DNA损伤反应(DDR)感受、传递损伤信号到各种效应蛋白,最终激活细胞周期阻滞、DNA损伤修复、程序性死亡(如凋亡、坏死)、衰老等通路来保护细胞。当外界或自身因素引起DSBs时,修复的主要机制有两种:非同源末端链接(NHEJ)和同源重组修复(HR)。HR途径是一种依靠同源DNA、精确度较高的修复途径。RAD51是HR通路中寻找同源序列和进行链交换的关键蛋白,是同源重组介导的DNA双链修复途径必不可少的重组蛋白酶。p53是DDR信号网络中的重要组成部分,对肿瘤形成起重要作用。当细胞DNA受损时,p53被激活,启动DNA修复通路,细胞存活;当细胞受损严重自身不能有效进行修复时,则激活细胞凋亡通路,促进细胞死亡,从而抑制正常细胞转化成癌变细胞。第一部分:本章实验首先用CCK-8法检测了TCBQ在不同浓度、不同时间下对MDA-MB-231细胞的毒性作用,结果表明TCBQ对细胞生长有明显的抑制作用。随后,利用彗星实验检测TCBQ处理后细胞DNA损伤情况,发现随着TCBQ暴露剂量和时间的增加,细胞彗星拖尾严重,olive尾矩逐渐增加,说明TCBQ能够导致细胞DNA双链断裂。采用Western blot和免疫荧光法检测DSBs标志物γ-H2AX和DSBs感应蛋白53BP1的表达情况,免疫荧光实验发现γ-H2AX和53BP1在细胞核内的聚集呈浓度、时间依赖性增多,Western blot法进一步证明TCBQ促进γ-H2AX和53BP1的表达,说明TCBQ能够诱导MAD-MB-231细胞持续性DNA损伤。同时,流式细胞术检测TCBQ刺激后MDA-MB-231细胞凋亡情况,发现细胞凋亡增加,且检测到细胞凋亡关键因子caspase-3的切割水平也明显上升。最后,分析TCBQ对同源重组修复通路关键蛋白RAD51的表达情况的影响。用Western blot法和RT-qPCR分别检测RAD51蛋白和mRNA表达水平,发现与对照组相比,随着TCBQ给药时间的增加,RAD51蛋白和mRNA水平都呈现出先增加后降低的趋势。TCBQ浓度较低时,RAD51表达的峰值出现时间延迟。免疫荧光实验检测RAD51焦点在细胞核内形成情况,RAD51焦点的形成结果与蛋白和mRNA水平类似,呈现先增加后降低的趋势。在本章TCBQ的毒理研究中,发现TCBQ具有遗传毒性,并且高浓度长时间作用时能够诱导MDA-MB-231细胞凋亡,产生DNA双链断裂,并影响DNA修复蛋白RAD51的表达。MDA-MB-231细胞在TCBQ作用下发生DNA损伤后,首先促进RAD51蛋白的表达并聚集在DNA损伤位点,启动了HR通路对相应的损伤进行修复,而细胞长时间暴露于高剂量的TCBQ下,DNA受到持续性的损伤,修复能力被抑制,细胞凋亡增加。第二部分:TCBQ的遗传毒性在第一部分中得到证实,但是TCBQ下调RAD51的机制还待分析。本部分实验首先通过泛素化实验表明,TCBQ作用于细胞6 h后对RAD51泛素化降解影响较小,说明TCBQ不影响RAD51在细胞质内的泛素化降解过程。通过加入蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)和mRNA合成抑制剂放线菌素(ActD)预处理细胞后,证明TCBQ几乎不影响RAD51蛋白的稳定性,但对mRNA的稳定性有较大的影响。针对上述检测结果,我们深入探究影响RAD51表达的上游信号通路。首先,采用Western blot法检测TCBQ作用于细胞后p53和p38 MAPK介导的损伤应激通路相关蛋白的表达,并加入其特异性阻断剂后,检测其对RAD51表达的影响。结果表明,TCBQ能够激活这两条通路,促进相关蛋白的表达,而p53通路主要参与TCBQ对RAD51的下调作用。免疫共沉淀实验结果表明,RAD51与p53蛋白之间存在相互作用,在TCBQ处理3 h后结合作用达到最大,而后随着RAD51蛋白的降低RAD51/p53结合减少。进一步验证p53对RAD51的调节作用,利用p53 siRNA干扰MAD-MB-231细胞p53蛋白的表达后,检测DNA损伤程度、细胞凋亡及RAD51的表达情况,发现降低p53的表达能反转TCBQ对RAD51的下调作用,减弱TCBQ对细胞凋亡和DNA损伤作用。以上实验结果说明,MDA-MB-231细胞在TCBQ作用后激活了p53信号通路,并参与调控RAD51的表达及细胞凋亡通路。证实了p53参与TCBQ对RAD51的下调,且激活细胞凋亡通路,具有介导细胞凋亡和调控DNA损伤修复的双重作用。第三部分:为研究RAD51基因对TCBQ引起细胞毒性作用的影响。我们构建了RAD51过表达质粒pEGFP-N1-RAD51和特异性干扰RAD51表达的siRNA,瞬时转染细胞后,采用彗星实验分析TCBQ导致的DNA双链损伤和CCK-8法检测细胞存活率,并用Western Blot法检测TCBQ诱导p53、DNA损伤蛋白γ-H2AX和凋亡蛋白cleaved-caspase-3的表达情况。结果表明,RAD51蛋白过表达后降低了TCBQ引起的细胞凋亡和DNA损伤,减少了TCBQ的毒性作用。而干扰了RAD51蛋白的表达后,TCBQ的毒性作用增强,细胞凋亡和DNA损伤程度更加严重,细胞存活率进一步受到抑制。同时,结果表明RAD51表达变化对上游调控蛋白p53的表达没有影响。根据以上结果可知,TCBQ可以通过影响RAD51的表达来抑制的同源重组修复,从而达到增强细胞毒性的作用。而p53对RAD51表达的调控对TCBQ引发细胞毒性有着重要意义。
贾效伟[9]2014年在《PARP-1在甲醛诱导的早期健康损害效应中的作用》文中研究表明背景：甲醛属较高毒性化学物,位居我国有毒化学品优先控制名单中的第二位。人体可经呼吸道或皮肤暴露于甲醛而引发多种损害。甲醛因为其污染来源广泛、毒性作用大并且污染时间长等特点,已经成为我国最主要的室内空气污染物之一,也是环境卫生领域和职业卫生领域研究的热点和难点。甲醛的遗传毒性表现为甲醛可以引起DNA损伤(包括DNA链断裂、DNA与DNA和蛋白质等大分子的交联、DNA加合物、RNA-formaldehyde加合物等)、基因突变、染色体断裂、姐妹染色单体互换、细胞转化以及通过破坏基因组抑制DNA的修复。损伤的DNA未被修复或修复不正确,将导致基因突变或染色体畸变,导致细胞坏死/凋亡,或发展为癌细胞。国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)于2004年将甲醛确定为人类Ⅰ类致癌物。大量的流行病学研究显示,人类的许多常见癌症与长期的慢性炎症刺激有关,慢性炎症可导致细胞过度增殖和细胞级联反应活化,进而导致DNA的损伤,持续性刺激和炎症能够促进启动细胞向转移性疾病发展,最终导致肿瘤生长及免疫抑制。DNA损伤修复和炎症应激反应的信号传导网络对肿瘤发生的信号通路的影响,及其所介导的炎症在肿瘤发展中的作用至今还是信号通路研究的热点之一。多聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1, PARP-1)是DNA损伤的感应器及监测分子,在DNA修复中发挥至关重要的作用。除了DNA损伤识别功能,PARP-1还可以通过调控转录因子、细胞因子、粘附因子和炎性介质等方式参与炎症的过程。同时,PARP-1还在调控基因组的甲基化状态的过程中发挥着重要作用。因此,本研究将从DNA损伤修复、免疫调控和甲基化调控三个方面全面评价PARP-1在甲醛诱导的早期健康损害效应中的作用,本研究对预防和监测甲醛的有害健康效应具有重大意义。目的：本研究采用横断面分子流行病学设计,在118例甲醛暴露工人和79例非暴露工人中,主要探讨了不同甲醛暴露水平与工人外周血淋巴细胞遗传损伤和免疫失衡的关系。并进一步以人支气管上皮细胞(Human Bronchial Epithelial Cell Line,16HBE)为研究对象,探讨PARP-1信号通路在低浓度甲醛诱导的遗传损伤修复中的作用。方法：研究中,首先选择监测了山东省某木质板厂不同工作场所的空气甲醛浓度,采用彗星实验、胞质阻断双微核实验、流式细胞术等实验方法分别评价外周血淋巴细胞的DNA链断裂水平(彗星尾部DNA百分含量,Percent of DNA in the Comet Tail, TDNA%)、染色体断裂或丢失水平(胞质阻断双微核率,Percent of Cytokinesis-block Micronucleus, CBMN率)、外周血淋巴细胞亚型分布百分比及Thl (γ-干扰素Interferon γ,IFN-γ)、Th2(白介素-4和10Interleukin-4/10, IL-4和IL-10)和前炎性细胞因子(白介素-6和8Interleukin-6/8, IL-6、IL-8和α-肿瘤坏死因子,Tumor Necrosis Factor, TNF-α)表达水平,同时还用液相质谱检测班后尿中甲酸含量,分析现场甲醛暴露水平与工人外周血淋巴细胞遗传损伤和免疫失衡水平间的关系。进一步采用实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR, QT-PCR)和MassArray质谱技术检测PARP-1和甲基化相关酶基因mRNA的表达及PARP-1基因启动子区甲基化状态,初步探索PARP-1和甲基化相关酶在甲醛引起的表观遗传学改变中的作用。我们选用16HBE细胞为研究对象,同样采用彗星实验、胞质阻断双微核实验、流式细胞术等实验分别检测低浓度甲醛诱导的DNA链断裂水平(TDNA%)、染色体断裂或丢失水平(CBMN率)、活性氧水平及Thl (IFN-γ)、Th2(IL-4和IL-10)和前炎性细胞因子(IL-6、IL-8和TNF-a)。同时采用Western Blot、QT-PCR和AP-1荧光素酶活性检测技术检测DNA损伤修复通路蛋白表达水平或活性,用免疫共沉淀方法检测蛋白之间相互作用情况,用特异化学抑制剂和分子抑制(显性失活突变技术和RNA干扰技术)的方法探索PARP-1通路蛋白在低浓度甲醛诱导的DNA损伤修复中的作用。同时还检测了低浓度甲醛诱导的甲基化酶的表达水平及其与PARP-1蛋白的结合情况,进一步检测PARP-1基因启动子区甲基化状况,阐明PARP-1参与低浓度甲醛引起表观遗传改变的分子机制。结果：1、甲醛暴露致工人遗传损伤生物标志物研究118例甲醛暴露工人按其接触甲醛浓度高低不同分为高暴露组和低暴露组,我们发现甲醛高暴露组和低暴露组尿甲酸含量均显著高于对照组p=0.004和p<0.001)。与对照组相比,甲醛暴露工人PARP-1基因mRNA表达明显减低(p=0.003),而X射线损伤修复交叉互补基因-1(X-ray repair cross-complementing protein-1, XRCC-1) mRNA表达没有显著性改变。本研究在校正了年龄、性别、吸烟和饮酒等可能的影响因素后,甲醛高暴露工人外周血淋巴细胞TDNA%显著高于对照组。对照组、低暴露组和高暴露组TDNA%分别为8.39±0.18%、9.63+0.23%、11.55+0.22%。甲酰胺嘧啶-DNA-糖基化酶(formamidopyrimidine-DNA-glycosylase, FPG)处理后,甲醛低暴露组和高暴露组较对照组TDNA%分别增加21.20%和20.66%,差异具有统计学意义(p<0.05)。对照组、低暴露组和高暴露组的CBMN率分别为2.26±0.16‰,3.04+0.23%o,4.48+0.20‰。与对照组相比,甲醛高暴露组工人外周血淋巴细胞CBMN率显著增高。与对照工人相比,随着甲醛暴露浓度的增加,工人外周血淋巴细胞B细胞亚群(CD19+)百分比逐渐增加(p<0.01)。甲醛低暴露组的NK细胞亚群(CD56+)百分比显著增加(p=0.013),而高暴露组没有发现显著差异。总T细胞(CD3+),抑制性T细胞(CD8+)和辅助性T细胞(CD4+)的百分比没有显著变化。甲醛暴露工人血清IL-10水平显著增高(低暴露组vs.对照,p=0.003；高暴露组vs.对照,p<0.001),并且高暴露组工人血清IL-10水平显著高于低暴露组工人(p=0.04)。与对照组相比,甲醛高暴露组工人血清IL-4水平显著增高(p=0.044),而低γ暴露组无显著差异。相反,随着甲醛暴露浓度增加,血清IFN-γ水平呈减低趋势,与对照组相比,高暴露组血清IFN-γ水平显著减低(p=0.037)。甲醛暴露工人血清IL-8水平显著低于对照组工人(低暴露组vs.对照,p<0.001；高暴露组vs.对照,p=0.007)。IFN-γ/IL-4比值可以反应Th1/Th2细胞发挥作用的一种平衡状态。本研究结果显示甲醛暴露组分泌的细胞因子IFN-γ/IL-4比值较对照组明显减低,差异有显著性。血清IL-6和TNF-α水平在甲醛暴露工人和对照工人之间没有显著差异。进一步分析血清细胞因子水平与尿甲酸之间的相关性发现,血清IL-10(rs=0.465,p<0.001),IL-4(rs=0.203,p=0.045),和IL-8(rs=-0.272,p=0.007)表达水平与尿甲酸含量显著相关,而IFN-γ水平与尿甲酸无显著相关性。与对照组工人相比,甲醛暴露组工人DNA甲基转移酶-1/3a(DNAmethyltransferases-1/3a, DNMT-1和DNMT-3a)基因的mRNA表达水平显著下降了,而DNA甲基转移酶3b(DNA methyltransferases-3b, DNMT-3b)表达水平没有显著差异。PARP-1基因启动子区甲基化检测结果显示,本研究所选的各CPG位点甲基化状况没有随着甲醛暴露而发生改变。2、PARP-1通路在甲醛诱导的人支气管上皮细胞遗传损伤修复中的机制研究甲醛处理16HBE细胞4h,各浓度组细胞间生存率没有明显变化(0、10、20、40、80、160μM)。甲醛处理16HBE细胞24h,随着浓度增高,细胞生存率降低,≥80μM的甲醛处理组,细胞生存率显著降低,和未处理组相比,差异具有统计学意义。用不同浓度甲醛处理细胞4个小时,彗星试验结果显示,甲醛在5μM时就可以引起16HBE细胞的DNA断裂,在10μM时断裂作用达到峰值。用10μM浓度甲醛处理16HBE细胞,与对照组相比,细胞微核率轻度增高,差异不显著。根据上述结果,在后续的实验过程中,我们选择10gM甲醛作为处理浓度。PARP-1通路蛋白表达水平检测结果显示10μM甲醛可使PARP-1、XRCC-1、磷酸化细胞外信号调节激酶(Extracellular Signal-regulated Protein Kinase, ERK)和磷酸化c-JunN端激酶(c-Jun NH2-terminal Amino Kinase, JNK)表达明显增加,而磷酸化P38在各时间点(1,3,6,12,24h)变化均不明显。用10μM甲醛分别处理细胞0、12、24h,观察活化蛋白-1(activator protein-1, AP-1)活性变化,结果显示,与对照相比,AP-1活性在12h和24h时间点轻度增强,但未发现显著性差异。10μM甲醛处理细胞早期,在1和3小时时间点检测到毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白(Ataxia Telangiectasia Mutated, ATM)蛋白表达显著增加。磷酸化P53蛋白随着时间延长,表达量逐渐增加,而总的P53蛋白表达没有明显变化。10μM甲醛刺激细胞,与对照组相比,在1、3和24小时各时间点γ-H2AX蛋白表达均没有改变。我们采用特异化学抑制剂和RNA干扰技术检测PARP-1在甲醛诱导的DNA损伤修复中的作用,用PARP-1的特异化学抑制剂,PJ34,抑制PARP-1后,DNA损伤修复试验发现,甲醛刺激细胞4h后,换新鲜培养基继续培养2h,与HBE组相比,甲醛诱导的彗星尾部DNA百分含量显著增高,撤除甲醛再培养2h后甲醛诱导的DNA损伤没有完全修复,DNA损伤修复率为73.47%。进一步,为检测ATM在甲醛诱导的DNA损伤修复中的作用,采用RNA干扰技术抑制ATM,结果显示抑制ATM后,可部分的抑制磷酸化P53的表达。彗星试验结果显示,抑制ATM后,甲醛诱导的DNA损伤程度没有明显改变,表现为彗星尾部DNA百分含量与对照组相比没有显著差异。抑制ATM后,甲醛诱导的DNA损伤修复率也没有明显改变。进一步的细胞周期检测结果显示,10μM甲醛刺激细胞24h后,S期细胞比例显著增加。抑制ATM后,S期细胞比例的增加没有明显差异,但是G2/M期细胞比例显著增加。RNA干扰技术抑制PARP-1后,甲醛诱导的磷酸化JNK和P53高表达明显受到抑制,而磷酸化ERK的表达没有受到明显影响。抑制JNK和ERK均可以显著降低甲醛诱导的PARP-1和XRCC-1蛋白的高表达。抑制JNK还可以显著减弱甲醛诱导的磷酸化P53的高表达,而抑制ERK没有影响甲醛诱导的磷酸化P53的高表达。采用免疫共沉淀技术检测PARP-1与XRCC-1蛋白的结合情况,甲醛可以诱导PARP-1与XRCC-1蛋白结合增加,抑制JNK后,这种结合显著减低,而抑制ERK没有影响二种蛋白的结合。进一步验证PARP-1信号通路在甲醛诱导的免疫反应中的作用。用10μM甲醛刺激16HBE细胞,在不同时间点分别检测NF-κB的表达,结果发现,总P65蛋白表达在各时间点均没有明显改变。10μM甲醛刺激16HBE细胞24h,检测细胞因子IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α和IFN-γ的表达水平。结果发现,IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ的本底表达非常低。与对照组相比,IL-6和IL-8的表达水平在10μM甲醛刺激的16HBE细胞明显增高,抑制了PARP-1后显著的阻滞了甲醛诱导的IL-6和IL-8的表达水平增高。10μM甲醛刺激16HBE细胞2个小时,检测细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)水平。结果发现10μM甲醛可以诱导活性氧增加,抑制PARP-1后,活性氧水平有所减低,但是差异不显著。提示10μM甲醛诱导的活性氧的增加是由多途径调控的。为了进一步验证甲基化酶和PARP-1通路在10μM甲醛诱导的甲基化改变中的作用,首先检测了甲基化酶表达情况,10μM甲醛暴露可以诱导DNMT-1蛋白表达显著增加。采用免疫共沉淀方法检测PARP-1与DNMT-1蛋白之间结合情况,甲醛可以诱导PARP-1和DNMT-1蛋白之间的结合增加。PARP-1基因启动子区甲基化检测结果显示,本研究所选的各CPG位点甲基化水平并没有随着低浓度甲醛的刺激而发生改变。结论与讨论：甲醛暴露可引起工人外周血淋巴细胞遗传损伤。PARP-1在DNA损伤早期修复中起重要作用,工人长期反复接触甲醛,当DNA损伤比较严重时,PARP-1过多的表达将会反向调节PARP-1自身,DNA修复效能进一步下降,如此恶性循环,导致遗传损伤在外周血淋巴细胞中累计,表现为外周血淋巴细胞彗星TDNA%和微核率均明显增高。此外,当机体的损伤程度超过了机体自身修复能力时,机体会通过自动关闭PARP-1等DNA损伤修复基因,引起PARP-1等基因表达沉默并使其功能丧失,增加机体的容错能力,加重了机体遗传损伤的程度。长期甲醛暴露还可引起工人外周血主要淋巴细胞亚群相对百分含量的改变,细胞因子表现为Th2型优势状态,而Th2细胞因子优势状态与哮喘及肿瘤的免疫逃逸有密切关系,所以对甲醛暴露工人外周血细胞因子的监测有助于了解甲醛暴露工人机体的细胞免疫和体液免疫状态,为职业暴露高危人群的健康保护提供依据。本研究体外实验采用16HBE细胞对PARP-1通路在甲醛诱导的遗传损伤修复中的作用进行了验证。本研究结果提示,在低浓度甲醛暴露的早期,PARP-1通路不仅是DNA损伤修复所必须的重要蛋白,同时它也参与了炎症反应的调控。综合本研究的体内和体外实验结果我们推断,短期和长期甲醛暴露均可以诱导不同类型的遗传损伤和免疫指标改变,不同的甲醛暴露剂量、时间、试验对象以及试验条件都将产生不同的效应。
周维[10]2017年在《DNA甲基化模式异常在PM2.5致肺癌过程中的作用》文中进行了进一步梳理背景和目的:近年来,全国范围内空气细颗粒物(Fine Particulate Mater,PM2.5)污染已严重影响到人们的生产生活,由PM2.5污染所导致的各种公众健康问题已受到政府和人民越来越多的关注。流行病学研究已表明,PM2.5长期暴露可导致人群中肺癌发病风险和因肺癌死亡率不断攀升。仅2015年,在我国因PM2.5污染导致的肺癌死亡人数就占全国肺癌总死亡人数的23.9%。2013年,国际癌症研究机构(IARC)正式将PM2.5列为人类I类致癌物。目前,PM2.5引起肺癌的机制尚未完全清楚。阐明PM2.5的致癌机制将为制定有效的干预措施和进行PM2.5的风险评价与管理提供重要依据。随着表观遗传学研究的不断深入,大量研究发现在肿瘤发生发展过程中常涉及全基因组和/或特定基因的DNA甲基化状态异常。人群流行病学资料亦证实PM2.5持续暴露可导致机体DNA甲基化模式改变。提示PM2.5诱导DNA甲基化模式异常可能是PM2.5致肺癌发生发展过程中的一个重要环节,但其急需机制研究加以证实与补充,同时PM2.5是如何诱导DNA甲基化模式异常仍需进一步研究。由于伦理学限制,现有研究多采用体外动物实验或细胞实验探索PM2.5引发肺癌的相关机制。然而,大多数体外研究在暴露剂量、暴露时间等实验条件的选择上很少基于现实暴露情境,简单地认为PM2.5毒性效应是“量”的累积,常在高浓度急性暴露情境下探讨PM2.5致癌的可能毒性机制,不利于问题的解释和研究结论的外推。因此,基于真实暴露情境进行的机制研究,可真实和全面地反映PM2.5暴露过程中DNA甲基化变化及其在PM2.5致肺癌过程中的作用,有助于揭示PM2.5真实的致病机制。基于上述考虑,本研究利用BEAS-2B细胞,首次通过体外构建两种暴露模型,分别模拟现实生活中高浓度急性暴露和低浓度长期暴露两种常见的暴露情境,系统性对比分析不同暴露情境下PM2.5毒性效应的差异及相关毒性机制。然后选用合适的暴露模型,分析PM2.5持续暴露过程中细胞全基因组甲基化状态和P53基因DNA甲基化水平,探索PM2.5暴露引起DNA甲基化模式异常的相关分子机制,揭示DNA甲基化模式异常在PM2.5致肺癌过程中的作用,旨在为阐明PM2.5致肺癌的表观遗传学机制奠定基础,同时亦为今后开展PM2.5致癌风险评估、修订我国空气质量标准和制定有效的干预措施提供重要实验依据。方法:首先,利用粒度仪、稳定分析仪和透射电子显微镜(TEM)对采集到的PM2.5进行粒径、稳定性和形貌进行分析。然后,通过多路径颗粒沉积模型(MPPD模型)基于现实暴露情境设计高剂量急性暴露(6μg/cm2,12μg/cm2,24μg/cm2,48μg/cm2,96μg/cm2,单次染毒BEAS-2B细胞24h)和低剂量重复暴露(1.5μg/cm2,3μg/cm2,6μg/cm2;重复暴露10d)两种暴露模型。在两种暴露模型中,分别采用CCK-8和LDH漏出率分析PM2.5染毒后的细胞毒性,通过TEM观察PM2.5对细胞超微结构的影响,利用CM-H2DCFDA荧光探针分析细胞内ROS水平,采用彗星实验检测PM2.5对DNA的损伤情况,利用流式细胞术分析细胞周期分布以及细胞凋亡和坏死发生率,采用Western Blot检测PM2.5对细胞DNA损伤修复、自噬、线粒体功能、炎性因子和表观遗传调控等相关蛋白表达的影响,采用化学发光法检测细胞内ATP水平,利用q RT-PCR分析PM2.5暴露后细胞内质网应激和UPR状态、P53 m RNA表达情况,采用比色法检测细胞内全基因组DNA甲基化水平变化,利用BSP分析P53启动子区域DNA甲基化状态,以及采用EMSA分析P53启动子区域DNA与核蛋白结合情况。此外,还通过si RNA干扰、ROS清除、抑制剂等方法进行高剂量急性暴露模型中细胞坏死原因的探讨和分析低剂量暴露模型中细胞内ROS-Akt-DNMT3B信号通路的作用。结果:1.本研究所采用的PM2.5的平均粒径为0.74±0.08μm,在培养基中具有良好的分散性,较少发生聚集沉淀。TEM显示PM2.5组成复杂、形态各异。2.在高剂量急性暴露模型中,高浓度PM2.5(≥24μg/cm2)能明显抑制细胞活力,增加细胞内LDH漏出,诱导细胞内ROS生成急剧增多,造成线粒体肿胀甚至空泡化、内质网扩张等改变,导致细胞DNA严重损伤。同时,随着暴露浓度的增加,PM2.5能磷酸化激活细胞内P53和H2A.X,上调P21、PARP-1表达,但并未引起细胞周期阻滞、细胞凋亡和胞内cleaved Caspase-3明显变化,反而促进细胞坏死的发生率和细胞内的IL-6水平升高。高浓度PM2.5暴露还能剂量依赖性激活m TOR-Beclin1-LC3B信号通路,诱导细胞自噬发生,上调细胞内P62/SQSTM1蛋白水平。进一步分析细胞内线粒体功能和ER-Stress相关分子变化,发现PM2.5虽能激活PGC-1α通路促进线粒体新生和功能,但细胞内ATP水平却随着PM2.5浓度的增加而显著降低,高浓度组(≥24μg/cm2)甚至不到对照组的30%。PM2.5能上调GRP78表达,但不能激活下游的UPR反应。在表观遗传调控方面,高浓度PM2.5短时间暴露可诱导细胞内DNMT1、SIRT1表达增加,抑制细胞内DNMT3B蛋白含量,而对DNMT3A表达无影响3.高浓度PM2.5急性暴露还能剂量依赖性增加细胞内HO-1水平,并促使其富集于线粒体,抑制细胞色素C释放。自噬抑制剂3-MA预处理和HO-1表达沉默后,能相互独立地降低高浓度PM2.5导致的细胞坏死,促进细胞凋亡发生。4.在低剂量重复暴露模型中,≤6μg/cm2的PM2.5重复暴露10d后,不产生明显的细胞毒性,但可诱导细胞内ROS低水平上升,导致部分线粒体轻微肿胀,仅在高剂量组(6μg/cm2)出现明显的DNA损伤。同时,随着PM2.5浓度增加,细胞内除H2A.X磷酸化激活外,cleaved PARP-1增加显著,P53和P21反而剂量依赖性降低。低剂量PM2.5重复暴露可导致细胞发生S期阻滞,促进细胞内cleaved Caspase-3表达增加,诱导细胞凋亡发生和细胞内IL-6低水平增加。PM2.5重复暴露虽未引起m TOR-Beclin1-LC3B信号通路激活和P62/SQSTM1蛋白表达,但细胞内却出现降解性自噬小体和层状小体。低剂量PM2.5重复暴露还能激活ER-Stress和下游的UPR反应,抑制NRF-1蛋白表达,诱导细胞内ATP降低。另外,PM2.5重复暴露可抑制细胞内DNMT1表达,增加DNMT3B细胞内含量,对SIRT1和DNMT3A无影响。5.低剂量PM2.5重复暴露可诱导细胞内ROS持续低水平增加。重复暴露5d后,PM2.5虽未引起明显DNA损伤、细胞周期阻滞和细胞凋亡发生,却能显著减少细胞内DNMT1蛋白表达,造成细胞全基因组甲基化水平降低,同时剂量依赖性上调细胞内DNMT3B蛋白含量和磷酸化Akt水平。重复暴露10d后,随着暴露浓度的增加,PM2.5可导致P53基因启动子区域甲基化胞嘧啶位点逐渐增多,并显著降低细胞内P53 m RNA水平和P53蛋白含量。EMSA结果显示PM2.5诱导的甲基化胞嘧啶碱基可显著抑制核蛋白与DNA结合。通过ROS清除剂(NAC)和Akt抑制剂(LY294002)预处理后发现,NAC和LY294002能显著降低细胞内的Akt磷酸化激活和DNMT3B蛋白表达水平,抑制由PM2.5暴露导致的P53基因启动子甲基化水平增加,最终恢复细胞内P53蛋白表达。结论:1.在两种不同的暴露情境下,PM2.5暴露在的细胞活力、胞内氧化水平、遗传物质损伤、细胞应激修复反应、能量供应、炎性水平、表观遗传调控以及细胞结局等方面产生的毒性效应差异明显。研究结果表明高浓度PM2.5急性暴露,常诱发细胞严重损伤,超出细胞自身应激修复能力,导致细胞稳态破坏,致使细胞出现不可控的“崩塌效应”,最终引起机体出现急性炎性症状发作等结局;而低剂量PM2.5长时间暴露,虽无明显细胞毒性,但反复低氧化、低炎性刺激可促使机体内细胞处于病理性适应状态,触发许多跟低水平氧化应激相关的疾病发生等。因此,本研究结果提示“暴露情境”可能是决定PM2.5毒性效应及相应的致病机制的重要影响因素之一。2.高浓度PM2.5急性暴露,可通过诱发BEAS-2B细胞内HO-1过度表达及线粒体富集,阻止线粒体内细胞色素C的释放,从而抑制细胞凋亡。同时,高浓度的PM2.5在短时间内上调细胞内自噬活动,造成自噬流紊乱,触发细胞自噬相关性坏死。因此,该暴露过程中PM2.5诱导产生的HO-1实则“助攻”细胞坏死的发生,发挥其负面效应。3.低剂量PM2.5重复暴露导致细胞内ROS持续低水平增加,可能通过抑制细胞内DNMT1蛋白表达造成细胞全基因组低甲基化。同时,PM2.5暴露还能通过激活细胞内ROS-Akt-DNMT3B信号通路,诱导P53基因启动子甲基化水平升高,进而导致P53基因转录表达水平降低,引起细胞内P53蛋白水平降低。PM2.5诱导的全基因组低甲基化和P53启动子高甲基化可能诱发并促进肺癌的发生。
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[10]. DNA甲基化模式异常在PM2.5致肺癌过程中的作用[D]. 周维. 中国人民解放军军事医学科学院. 2017
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