中山大学附属第六医院 广州 510655
【摘 要】目的 制备汉方已甲素（tetrandrine，Tet）聚乳酸纳米微粒，为抑制翼状胬肉术后血管增生研究奠定实验基础。方法 采用复乳法，以天然中药Tet作为试验药物，以聚乳酸（polyactic acid，PLA）为包封材料，制备Tet聚乳酸纳米微粒。观察其表面形态、结构、粒径及Zeta电位。结果 成功制备出了Tet聚乳酸纳米微粒，微粒的表征：类圆形囊泡，均质，粒径大小约为200-230nm，Zeta电位为-7.7mv。结论 通过聚乳酸为包封材料，可成功制备出载药纳米微粒PLA（Tet）-NP（纳米微粒nanoparticles，NP），观察该纳米微粒作为药物载体的可行性。为今后进一步开展抑制翼状胬肉术后血管增生的研究奠定了基础。
【关键词】汉方已甲素（Tet）；聚乳酸；纳米微粒
[Abstract]Objective Preparation of tetrandrine（Tet）polylactic acid nanoparticles，as a basis for study of vascular proliferation after pterygium surgery.Methods Using double emulsion method，with natural Chinese herbal medicine Tet as experimental drug，using polylactic acid（PLA）as embedding materials，preparation of Tet polylactic acid nanoparticles.To observe the surface morphology，structure，particle size and Zeta potential.Results Tet polylactic acid nanoparticles was prepared successfully，particle characterization：round vesicles，
homogeneous，the particle size is about 200-230nm，the Zeta potential of -7.7mv.Conclusion The polylactic acid as embedding materials，can be successfully prepared drug loaded PLA（Tet）-NP（nanoparticles，NP），to investigate the feasibility of the nanoparticles as drug carrier.For further inhibit angiogenesis after pterygium surgery research foundation.
[keywords]Tetrandrine（Tet）；Polylactic Acid；NanoparticlesR779.6
翼状胬肉是以睑裂部球结膜血管组织增生并向角膜侵入为特点的眼表疾病之一，是眼科和老年人的常见病和多发病，变性是其突出的病理特征，具有较高的复发率。手术是治疗翼状胬肉最常见的方法，但术后复发也一直是困扰广大临床医生的难题。多数学者认为单纯胬肉切除后的复发与手术创伤加快了成纤维细胞的增生有关[1，2]，因此，如何彻底清除翼状胬肉深层增生的纤维血管组织以及抑制成纤维细胞是降低术后复发的重要措施。研究表明汉方已甲素（tetrandrine，Tet）体外可明显抑制内皮细胞的增殖、迁移及小管形成，已经具备抑制血管生成的条件，并且在体外具有明显抗血管生成效应[3，4]。因此，如何选择一种延长Tet药物作用时间的给药途径，减少药物对眼部其他组织的毒副作用，是防治翼状胬肉术后复发的关键。我们希望能寻找到一种药物载体，既可有效与抗体结合，又可以保存或提高药物疗效，本研究依循该思路尝试制备载药纳米微粒PLA（Tet）-NP（纳米微粒nanoparticles，NP）以解决上述问题。
1.资料与方法
1.1实验材料
选用我国独特的天然中药汉防已甲素（tetrandrine，Tet）作为试验药物，以聚乳酸（polyactic acid，PLA）为包封材料。
1.2主要试剂和设备仪器
1.试剂：聚乳酸；乙酸乙酯；汉防已甲素原料药（西安山川生物技术有限公司）；汉防已甲素标准品（中国药品生物制品检定所）蒸馏水；去离子水；PBS（Ph=7.5）缓冲液。
2.设备、仪器：85-2型恒温磁力搅拌器（金坛中大仪器厂）；离心机；超声仪；扫描电镜；铜网；JEM-100CX型透射电子显微镜（日本电子株式会社）；激光粒度仪；ZD-2A型自动电位滴定仪（上海大学仪器有限公司）。
1.3方法
1.汉防已甲素储备液的配置 精密称取汉防已甲素标准品10.02mg于25ml容量器中，加甲醇适量超声使其溶解，用甲醇定容至刻度，混匀，得到400.8μg.ml-1的汉防已甲素储备液（Tet）。
2.PLA（Tet）-NP的制备 将聚乳酸充分溶于乙酸乙酯配成5%溶液。在超声分散下逐滴加入4×10-5mol/L的Tet溶液，形成水/油/水复乳。电磁棒搅拌下挥发4h，离心分离，超声分散后蒸馏水洗涤3遍，冷冻干燥，所得白色粉末状固体即为PLA（Tet）-NP。制备过程中不加入Tet即得空载聚乳酸纳米毫微粒。
3.毫微粒表征 将PLA（Tet）-NP放在去离子水中进行超声波分散，悬浮液于洁净的载玻片上滴样，待其干燥后，真空条件将试样表面喷金处理，置于扫描电镜下观察载药毫微粒的表面形态并拍照。将悬浮液滴到载膜的铜网上，用滤纸吸去多余的液体，晾干后数分钟制成样品放入透射电镜内观察载药毫微粒的结构。将液体样品加入专用的测试皿中，用激光粒度仪、表面电位分析仪纳米毫微粒的粒径及Zeta电位。
2.结 果
2.1采用复乳法制备出了Tet聚乳酸纳米毫微粒
以聚乳酸（polyactic acid，PLA）为包封材料可以成功制备出Tet聚乳酸纳米毫微粒，
PLA（Tet）-NP为白色粉末状固体，见图1。制备过程中不加入Tet即得空载聚乳酸纳米毫微粒。
2.2毫微粒表征
在透射电子显微镜下观粒子表面形态为白色粉末状固体，类圆形囊泡，界面清晰。电镜下观中央密度略小，边界密度略大，微粒大致表现出均质性，汉防已甲素均匀分布于微粒中。粒径大小约为200-230nm，Zeta电位为-7.7mv。
3.讨论
翼状胬肉是以睑裂部球结膜血管组织增生并向角膜侵入为特点的眼表疾病之一，是眼科和老年人的常见病和多发病，变性是其突出的病理特征，具有较高的复发率。目前认为发病机制可能是紫外线或其它环境因素造成鼻颞侧角膜缘干细胞损伤，导致干细胞屏障功能破坏，局部结膜下纤维组织增生长入角膜，引起上皮前弹力层甚至基质层变性混浊[5]。此外，受损的干细胞还可能释放血管增生因子，加速胬肉的形成[6]。手术是治疗翼状胬肉最常见的方法，但术后复发也一直是困扰广大临床医生的难题。多数学者认为单纯胬肉切除后的复发与手术创伤加快了成纤维细胞的增生有关[1]，角膜表面及结膜下翼状胬肉残存组织是导致翼状胬肉术后复发的基础，而巩膜表面的新生血管进入角膜创面是复发的根本原因[2]。另外，手术部位造成角膜上皮缺损，相应创面的角膜浅层组织受到破坏，失去正常的生理屏障作用，使结膜上皮细胞增生过快，创面角膜上皮结膜化，角膜上形成新生血管，也易导致胬肉的复发。
因此，如何彻底清除翼状胬肉深层增生的纤维血管组织以及抑制成纤维细胞是降低术后复发的重要措施。
翼状胬肉的形成及向角膜浸润是多步骤、多阶段的复杂过程，尽管目前翼状胬肉发病机理不清，但已知它的形成和发展依靠新生化血管[7]。而丰富血管床的产生及细胞外基底膜的突破是翼状胬肉细胞进行浸润最初和最关键的阶段。
汉防已甲素（tetrandrine，Tet）是从中药防已、粉防己或千金藤中分离出来的一种生物碱，为双苄基异喹衍生物，近年来发现其具有消炎、镇痛、解热、抗过敏、抗自由基、抗癌和耐药逆转等多种药理作用[4]。已有学者将其应用于肿瘤的抗血管生成研究中，结果显示Tet对人脐静脉血管内皮细胞小管形成及迁移能力有抑制作用，其抑制作用呈剂量依赖性；作用于人脐静脉血管内皮细胞后，其G0-G1期细胞比率增多，而S期、G2-M期细胞比率减少，表明Tet可抑制人脐静脉血管内皮细胞DNA的合成，对G2-M期细胞的抑制呈剂量依赖性[3]。可见Tet可诱导人脐静脉血管内皮细胞凋亡，阻止其DNA的合成，从而抑制血管生成。
Miller等[8]于2001年提出了以下四项抗血管生成药物筛选标准。（1）差异细胞毒性：抗血管生成药物应该是其杀伤或抑制内皮细胞的药物剂量低于对肿瘤细胞的毒性剂量。（2）干扰内皮细胞功能：抗血管生成药物应该是在尚未引起内皮细胞死亡的情况下能够干扰内皮细胞的功能。（3）明确的作用机制：迄今血管生成的基本过程已较明确，药物被认为具有抗血管生成效应之前，尚需确定该药是通过抑制血管生成的哪一个具体环节而发挥作用的。（4）体内抑制血管生成。研究表明Tet作用于人脐静脉血管内皮细胞，发现Tet在体外可明显抑制内皮细胞的增殖、迁移及小管形成，已经具备抑制血管生成的几个条件，并且在体外具有明显抗血管生成效应。
目前国内外临床不乏有效的抗血管生成药物，但现有的血管生成抑制剂，例如Avastin，Endostatin，因其成本极高，价格昂贵，我国绝大多数患者无法承受使用该药所带来的经济负担，使这些抗血管生成疗法无法得到广泛的临床应用。中药是我国独特的天然药物宝库。我们的研究目的就在于克服上述缺陷，研究汉防已甲素抗血管生成作用及其作用机理。
因此，如何选择一种延长Tet药物作用时间的给药途径，减少药物对眼部其他组织的毒副作用，是防治翼状胬肉术后复发的关键。
随着纳米技术对医学领域的不断渗透，具有生物相容性的纳米微球很快成为治疗各种疾病的新型载体，在眼表和眼内疾病的诊断和治疗研究中起到越来越重要的作用。将载药或载DNA的纳米微球与单克隆抗体结合，既利用了单克隆抗体的靶向性，又利用了纳米微球的缓释和稳定性，提高药物的疗效和作用时间，成为目前药物治疗和基因治疗的研究热点[9，10]。药物载体输送系统-纳米毫微粒（nanoparticles，NP）因其具有载药量大、缓释药物、药物无需化学偶联而以游离形式被包封等多重优点，与其相关的研究已成为药剂学研究中非常活跃的领域。
纳米粒直径在10~1000nm，是一种典型的介观系统，具有比表面积大、表面反应活性高、表面活性中心多、吸附力强等优良品质。纳米药物载体技术以纳米颗粒作为传递载体，将药物等治疗分子包裹其中或吸附其表面，运送到需要治疗的部位，同时也可在颗粒表面偶联特异性的靶向制剂，如单克隆抗体等，实现有效的主动靶向性。在肿瘤生物治疗领域，将单抗分子直接或间接与载药纳米毫微粒交联，已经取得了成功经验。在眼科也有学者制备了阿霉素纳米毫微粒、维甲酸纳米毫微粒，并证实了其可在眼部持续稳定释放，有效抑制青光眼滤过术后成纤维细胞的增生和增殖性玻璃体视网膜病变的发展[11，12]。
本试验使用了聚乳酸，是聚合物体系的代表物质之一。聚乳酸是白色的半结晶体，pH值为中性，不含肽键，无抗原性及免疫性，机体异物排斥反应小，有良好的生物相容性。在体内水解脱脂生成乳酸单体，并在乳酸脱氢酶的作用下氧化，作为能量物质参加体内三羧酸循环，最终降解产物为水和二氧化碳排出体外。已广泛用于手术缝线、骨折固定、药物载体及细胞工程。
本课题选取我国独特的天然中药汉防已甲素作为试验药物，以聚乳酸为包封材料，成功制备成汉防已甲素聚乳酸纳米毫微球PLA（Tet）-NP，观察了该纳米毫微球作为药物载体的可行性。进一步观察了该载体的表征，为进一步研究及PLA（Tet）-NP对翼状胬肉中VEGF（已证实VEGF参与了翼状胬肉新生血管形成的过程）的抑制作用，为防御翼状胬肉复发奠定了实验基础。
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通讯作者：
夏朝霞，女，1971年出生，现工作于中山大学附属第六医院眼科，眼科学博士，任眼科主任，副主任医师。学术兼职：担任国家二级心理咨询师，广东省眼科医师协会会员等。主要研究方向：老年疾病的防治，包括白内障、翼状胬肉等疾病的防治。
资助基金项目：广东省科技计划项目（2012B031800047）；第二个基金项目：广东省自然科学基金（2014A030310085）
论文作者:夏朝霞,杨筱曦,冯志贞,陈向华,屈蕾,马演玲
论文发表刊物:《航空军医》2016年第8期
论文发表时间:2016/6/22
标签：微粒论文; 血管论文; 纳米论文; 药物论文; 细胞论文; 内皮论文; 抑制论文; 《航空军医》2016年第8期论文;