刘亮明 文宪奎 唐大柳 张超 张洪哲
（贵州医科大学第三附属医院，心血管内科；贵州都匀558000）
[摘要] 目的：采用人体羊膜间充质干细胞（AMMSCS）移植对野百合碱（MCT））诱发的肺动脉高压（PAH）的大鼠模型中，探讨肺动脉高压引起损伤的肺血管内皮细胞修复作用机理。方法：雄性SD大鼠18只，分为正常对照组、PAH组和AMMSCS组。右心导管法测定大鼠的平均肺动脉压（MPAP）；称重法测定右心室肥厚指素（RVHI）；分别用RT-PCR法测定大鼠肺动脉血管中eNOS，ICAMP-1，IL-8和VEGF等mRNA表达水平。结果：MCT注射4周后，与对照组相比，PAH组大鼠MPAP和RVHI均显著升高（p<0.01）; AMMSCs移植2周后，与PAH组相比较，MPAP和RVHI均明显降低（p<0.01)。在AMMSCs治疗组中eNOS，ICAM-1和IL-8等MRNA表达水平明显高于PAH组（p<0.01）。结论：AMMSCs能有效地降低MCT诱发的PAH大鼠肺动脉压力和右心室肥厚，可能与促内皮细胞生长因子修复肺血管内皮分化和修复。
[关键词] 人羊膜间充质干细胞；肺动脉高压；促血管内皮细胞生长因子
Effect of amniotic mesenchymal stem cells on of pulmonary arterial in monocrotaline induced pulmonary hypertension rats
Abstract
Endothelial dysfunction contribute to the pathogenesis and development of pulmonary arterial hypertension (PAH). This study was to investigate the effect on monocrotaline (MCT) induced PAH rat models after human amniotic mesenchymal stem cells transfer. METHODS: By use a rat model of PAH, produced by injecting MCT after 2 weeks. The rats were randomly assigned to phosphate buffered saline control group, injected MCT group, and AMMSCs treatment group. Post 2 weeks, measured mean pulmonary artery pressure (mPAP), weight ratio of the RV to the LV plus septum. The expression of eNOS,ICAM-1, IL-8 and VEGF factor was determined by RT-PCR,respectively. RESULTS: MPAP and RVHI were higher in PAH group than control group,while those in AMMSCs group were significantly decreased as compared with PAH group. The expression of eNOS, ICAM-1 and IL-8 at mRNA levels was significantly increased AMMSCs group than PAH group, but VEGF levers not significant in two groups. CONCLUSION: Our results showed that transfer human amniotic mesenchymal stem cells increased vascular endothelial growth factor , decreased pulmonary vascular wall damage in PAH.
Keyword
AMMSCs, MCT, PAH, endothelial growth factor
肺动脉高压（pulmonary artery hypertension，PAH）是一组以肺血管阻力持续增加为主要特征的临床综合征，其病因和发病机制未明，临床治疗困难、预后较差。近些年特别是干细胞的研究，给PAH的治疗带来的新的曙光，研究表明干细胞的移植治疗有助于改善肺血管的内皮细胞功能，降低肺动脉压力并且改善肺小血管功能3。2004年研究者首次从人羊膜分离出间充质干细胞，经鉴定后发现从羊膜中胚层分化而来，具有向三胚层分化的多潜能性，人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells,AMMSC)从健康产妇正常分娩后废弃的胎盘组织中分离培养，羊膜组织来源充足，不受伦理学限制，且羊膜不含有血管、神经、肌肉等组织，分离提纯过程相对简单、分离细胞纯度高3。经免疫表型鉴定，hAMSC 不仅表达间充质干细胞的表面抗原、还表达干细胞相关表面抗原。近年来，人羊膜干细胞已经在角膜修复、烧伤性疾病、骨科疾病、脊髓损伤等相关疾病的临床研究和治疗取得的疗效3。但是对羊膜间充质干细胞在肺动脉高压引起损伤的血管内皮修复机理尚无报告，我们研究小组前期采用野百合碱成功诱发肺动脉高压模型，并且在肺动脉高压模型大鼠体内移植转染肝细胞生长因子的脂肪间充质干细胞修复肺小血管功能，研究表明转染人体肝细胞生长因子的脂肪间充质干细胞可以防止肺小血管的重构4。基于此，我们研究小组首次采用人体羊膜间充质干细胞移植于野百合碱诱发的大鼠肺动脉高压模型中，探讨肺动脉高压引起损伤的肺血管内皮细胞修复作用机理。
材料和方法
1.人羊膜间充质干细胞的分离和培养
通过人体和动物伦理委员会同意，并经患者同意后，无菌采集健康足月剖宫产胎盘2份，1小时内进入实验流程。
（1）主要试剂 LG-DMEM、胎牛血清（Gibico 公司）；胰蛋白酶（Amerseo公司）；鼠抗人CK19抗体、EnvisionTM Detection Kit (包含HPR-rabbit/mouse抗体，底物缓冲液，DAB-吃肉摩根（Gene Tech公司）；CD44-PE、CD29-PE、CD34-PE/CD90-FITCmouse anti-human和羊抗鼠IgG-FITC（BD公司）、流式细胞仪（FACS Calibur,BD公司）。
（2）人羊膜间充质干细胞的分离和培养
按Kim等5的报道，在无菌条件下，将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-hank’s液冲洗数次以清除残留血迹，将羊膜剪成碎片，用含0.02%EDTA的0.05%胰蛋白酶消化2次。D-hank’s液体冲洗未消化的组织碎片，加入含有0.075mg/mlDNase I的0.75mg/ml的胶原酶，于37℃,200r/min旋转消化约2小时，300目钢网过滤，收集细胞滤液，2000rpm 离心10分钟。细胞沉淀重新悬浮于LG-DMEM培养基中（含10%FBS，2mmol/L L-谷氨酰胺），以3X105/ml细胞密度接种于15cm培养皿，置于37℃,5%CO2培养箱培养。第3天更换培养液，待细胞汇合度达80-90%后，用0.25%胰蛋白酶EDTA溶液于37℃消化2-3分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1200RPM，离心10分钟，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，以1X107/L的密度传代。
（3）人羊膜间充质干细胞的鉴定
按Kim等5的报道,流式细胞仪分析 收集原代培养的hAMSCs，调整细胞密度1X106/ml,取200μL细胞悬液，加入荧光标记单抗CD44-PE、CD29-PE，CD34-PE和CD90-FITC各20μL,混匀，室温避光孵育25分钟，每管加2毫升含1g/LNaN3的磷酸盐缓冲液，混匀，1000RPM离心5分钟，弃上清，震荡悬浮细胞。每管加入10g/L多聚甲醛300μL，混匀，用流式细胞仪检测CD44,CD29，CD34和CD90的表达。每一样品采集细胞》20000个，用Cell Quest软件进行采集分析。用小鼠IgG-FITC或IgG-PE作为同行对照。
2.动物分组及肺动脉高压模型建立
雄性SD大鼠18只（200g左右，上海斯莱克实验动物有限公司），随机分组3组，每组6只：正常对照组，MCT诱导组（PAH组），和AMMSC治疗组。PAH制作按Chen等4报道的方法配制MCT（Sigma），予腹腔一次性注射40mg/kg,正常对照组给予的体积的生理盐水治疗。
3.人羊膜间充质干细胞移植
MCT注射后2周后，将调整细胞悬液密度为1X106cells/L，经颈外静脉移植人羊膜间充质干细胞。对照组和PAH组给予同体积的生理盐水注射。
4.血流动力学检测
按Chen等报道4，在实验室建立测定大鼠平均肺动脉压（MPAP）的方法，MCT注射后4周后测量各组MPAP。
5.肺组织HE染色切片制作
血流动力学检测后，打开胸腔取出整个心肺，肺动脉干保存在液氮灌内，右肺中叶组织块以10%甲醛溶液固定24小时。常规石蜡包埋，沿右肺门水平横切，片后5μm。切片进行HE染色，制成病理切片。光镜下观察肺小动脉病变。
6.右心室肥厚指数（RVHI）的测定
取出整个心脏，沿着房室沟剪去心房及大血管根部，用剪刀沿着后室壁间沟将右心室切下，滤纸洗水后称右心室游离壁及左心室+室间隔的重量（LVS），并计算RVHI=RV/(LVS)。
7.RT-PCR检测
从液氮中取出肺动脉干，采用Invitrogen公司Trizol试剂盒提取总RNA，752-C紫外分光光度计测定其纯度及含量。按照Promega公司试剂盒说明书进行cDNA 第一链的合成，采用primer3.0软件设计PCR引物，进行扩增（MyGene32Thermal Block PCR 仪）。以大鼠GAPDH mRNA为内参照，进行半定量分析，比值表示其相对含量，详细看Kim et al5。
8.统计学处理
数据以均数±标准差表示。采用SPSS12.0统计软件分析。组间均数比较采用One-way ANOVA检验。以p<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.人羊膜间充质干细胞的生长与增值特点
AMMSCs培养3天后，贴壁细胞迅速增多，细胞形态多样，呈多角形，梭性等，培养1周后，细胞排列紧密，胞体拉伸，多呈旋涡状生长（图1）。
2.人羊膜间充质干细胞的表型特征
流式细胞术（flow cytometry）分析显示，培养的AMMSCs高表达CD29（87%），CD44（86%）和CD90（98%），低表达CD34（图2）。
3.人羊膜间充质干细胞治疗对MCT诱发的PAH大鼠血流动力学的影响
与对照组相比较，PAH组的MPAP及RVHI均明显升高（p<0.01）;与PAH组相比，AMMSCs组MPAP及RVHI均显著降低（p<0.01）,见表1。
4.肺小动脉显微镜观察
对照组大鼠肺小动脉管壁厚薄一致，管腔内膜结构完整，血管周围仅有少量结缔组织，见图3；PAH组大鼠肺小动脉管壁增厚、管腔缩小，管腔内膜结构不完整或断裂，血管周围有大量的结缔组织增生，管壁有大量细胞浸润；AMMSCs组大鼠肺小动脉壁厚度轻度增加，较均匀，管腔缩小不明显。
5.人羊膜充质干细胞对PAH大鼠肺动脉血管内皮生长因子表达的影响。
与PAH组相比，AMMSCs组中血管内皮生长因子-eNOS,ICAM-1和IL-8等基因表达明显高于PAH组（p<0.01 & p<0.05）但是VEGF基因表达含量无统计学差异，见图4.
讨论
本研究采用MCT成功诱导了PAH模型，PAH组MPAP和RVHI均高于对照组，HE染色可见肺小动脉管壁增厚、管腔缩小，血管内膜结构破坏，血管周围结缔组织增生。本研究第一次使用异种异体来源的AMMSCs在肺动脉高压诱导2周后移植于大鼠体内，结果显示，AMMSCs可以改善受损的肺小动脉血管内皮，具有修复功能。研究中发现AMMSCs移植后，发现MPAP和RVHI较PAH组明显降低，而且血管壁结构得到改善，说明AMMSCs可能通过旁分泌eNOS、ICAM-1和IL-8等促血管内皮生长因子，促进肺血管内皮细胞的分化和修复血管内皮，减轻肺动脉高压。
研究发现，临床上使用的靶向治疗药物虽然在一定程度上改善了肺动脉高压患者的临床症状，但是仍不能逆转肺血管重塑及防治肺动脉高压得进展。因此，寻找、探索新的生物活性因子和信号通路作为肺动脉高压治疗的新靶点，是肺动脉高压治疗的必然趋势。近年来，MSCs移植具有独特的优势，其有可能成为治疗PAH的新手段。MSC是一种具有高度增值和分化能力的成体干细胞1，具有向成骨细胞、成软骨细胞及成脂肪细胞等间质组织细胞分化能力，可形成新生血管。AMMSCs不仅具有MSC的共性，即自我更新及多向分化的能力，并且取材方便，来源丰富而备受关注。虽然脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞已经被证实可以分化成内皮细胞和平滑肌细胞，促进血管新生，分化形成侧枝循环，增加肺血管的横截面积，降低肺血管阻力6-8。但是，目前国内外尚未见使用AMMSCs通过修复损伤的肺小血管内皮细胞，减轻肺动脉高压的报告。本研究首次采用AMMSCs治疗实验性PAH，评估AMMSCs治疗PAH的效果，以期为临床上治疗严重的PAH提供实验依据。
AMMSCs具有间充质干细胞表面标志物：CD90、CD105、CD166、SH3和SH4，除此还表达胚胎干细胞类的标志物Oct-3/4、SSEA-3/SSEA-4,Rex-1和BMP-4。这些因子的阳性表达说明AMMSCs可能是介于胚胎干细胞和成体干细胞质检单一个中间等级的干细胞，而这些胚胎杆细胞因子表明人羊膜间充质干细胞比成体干细胞增值能力更强5,9-11。人羊膜间充质干细胞表达黏附分子CD44，但不表达造血干细胞标志CD34、CD45、CD133，还不表达免疫因子HLA-DR，CD14,同时不表达共刺激分子CD80，CD83、CD86等，这些表明羊膜来源的间充质干细胞免疫原性很低，这在干细胞移植中具有重要意义10,11。本研究团队，第一次证实异种异体的AMMSCs可以在MCT诱导的PAH大鼠肺小动脉血管中，可能通过改善和修复损伤的内皮细胞减缓肺动脉高压的发生。
近年来研究发现，肺动脉高压与内皮损伤和功能障碍、炎症、平滑肌细胞大量增生、肺血管收缩和重塑等密切相关12-14。内皮细胞功能障碍是肺动脉高压发展早期重要组成部分，从而引发肺血管平滑肌细胞过度增值、肺成纤维细胞活化，诱发血栓形成因子及炎症因子释放至肺血管阻力和肺动脉压力的增高。AMMSCs具有很好的内皮细胞修复能力，本项研究表明，AMMSCs具有很强的旁分泌能力，移植治疗PAH过程中可能通过旁分泌机制分泌一些促血管形成物质，如eNOS，ICAM-1和IL-8，血管内皮生长因子（VEGF）等，促进血管生成。实验证明[]eNOS、ICAMP1和IL8等促血管形成物质表达增强，通过调节肺血管张力，肺血管床数量增加，肺血管阻力改善15-16。由于肺动脉高压发病机制的复杂性，AMMSCs移植后改善肺动脉高压大鼠肺循环血流动力学及肺小动脉功能可能通过多种途径的共同作用，而不是单一的途径完成，可能包括：AMMSCs能分化为新生血管内皮，修复和恢复受损内皮的功能，分泌舒血管物质，恢复血管效应器的功能。本项研究证实了，AMMSCs移植后直接或间接的促进血管的再生，增加肺血管数量，降低肺循环的阻力。
总之，本研究团队证实，AMMSCs可以有效修复野百合碱诱导PAH大鼠肺小动脉病变血管功能和降低肺动脉压力，该研究结果为治疗PAH提供了新的思路。而且研究表明，AMMSCs具有免疫耐受机制，它的抗原性较弱，本实验选用来源于人体羊膜间充质干细胞在异种异体种进行了实验。因此，本研究证实AMMSCs移植是一个极具应用前景的治疗PAH的新途径。
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基金项目：贵州省卫计委科学技术基金项目（gzwjkj2016-1-021)
贵州省科技支撑计划基金项目（黔科合支撑【2018】2758）
国家自然科学基金地区科学基金项目（81760046/H0203)
论文作者:刘亮明,文宪奎,唐大柳,张超,张洪哲
论文发表刊物:《医师在线》2019年6月11期
论文发表时间:2019/9/23
标签：肺动脉论文; 干细胞论文; 羊膜论文; 血管论文; 内皮论文; 细胞论文; 高压论文; 《医师在线》2019年6月11期论文;