邵阳市医学高等专科学校 湖南 422000
摘要：目的：探讨煅烧骨载体在骨髓基质细胞（BMSC）修复骨缺损中的作用。方法：实验动物采用的是山羊，提取2毫升骨髓细胞支撑悬浮液，在体外培养2周。采用手术的方法在羊两侧的桡骨1.5cm处形成骨膜—骨缺损，并将培养过2周的骨髓基质细胞注入到煅烧骨载体并植入骨髓缺陷的地方，在移植后的1、2、3、4周末，需要用钼靶X线检查双侧桡骨的缺损骨情况，并且取4周末的骨痂进行组织检查。结果：移植后实验侧的骨痂的形成速度对照侧愈伤组织的速度要快；第4周末，实验侧缺陷处全部为骨痂的连接，对照侧缺损处还没有形成骨痂进行连接。结论：煅烧骨载体能够帮助BMSC有效促进骨缺损的修复。
关键词：煅烧骨载体；骨缺损；修复
1.材料与方法
1.1主要材料
选择雌性山羊10只，其来自邵阳医学高等专科学校医学实验动物中心，动物都是经过检测合格；DMEM培养液，其来自于美国Gibco公司，胎牛血清来自于美国Gibco公司，钠青霉素、链霉素都是取自于哈尔滨制药厂，β—甘油磷酸钠、地塞米松、钼靶x光机、马弗炉都是取自于上海医疗器械厂，二氧化碳细胞培养箱取自于德国Heraeus公司。
1.2骨髓基质细胞的培养和观察
使用文献中描述的方法来培养BMSC。在无菌条件下，在双边髂前上棘在提取骨髓5ml，并且需要采用Ficoll密度梯度离心法来分离出单个核细胞，需要计算细胞存活率，并且需要收集界面细胞，采用10%胎牛血清（fetal calf serum，FCS）的DMEM稀释到每毫升105个细胞培养基培养瓶（培养液中加地塞米松为1.0×10－7 mol ／ L、β－磷酸甘油钠7 × 10－3 mol ／ L 和抗坏血酸10 × 10－7 mol ／ L），在37℃和5%二氧化碳的饱和湿度进行培养，细胞生长至80%就会进行融合，并且需要用0.25%胰蛋白酶溶液进行消化，根据1瓶的分成3瓶的比例进行配置，开始传代培养。
1.3载体的制备
在进行实验的过程中，需要制备载体，取小羊松质骨使用沙埋法经30天脱蛋白、脱脂，清洗后用马弗炉高温煅烧。第一次煅烧温度500°30分钟后冷却至常温后再次 800°30分钟后无菌条件下干燥箱保管备用。
1.4 实验动物分组和动物模型的制备
随机将10只雌性山羊分成二组，实验组命名为E组，对照组命名为C组。在骨髓细胞培养11 d时麻醉实验组山羊，并且在无菌的条件下将单侧桡骨干用线锯形成1.5cm的骨膜和骨缺损。骨缺损的远心端距离腕关节有2厘米。取BMSC，并吸收营养液，制成细胞密度为2× 108 每毫升的悬浮液体。
实验组山羊用1毫升注射器取0.5毫升细胞悬浮液注入煅烧骨载体后移植到骨缺损处。
对照组山羊采用同样的方法形成骨缺损，直接在骨缺损处注入0.5毫升的培养液。
术后需要缝合肌肉和皮肤，肌注庆大霉素20000单位，2次/天，连续3天。
1.6新骨痂X射线观察
在移植以后的第1、2、3、4周末分别需要用钼靶X线机拍摄双侧桡骨侧位片和观察愈伤组织的形成条件。拍摄时选用的参数为柯达X射线胶片，球管—物距为35厘米，32千伏电压和电流30 mA，0.16秒的曝光时间。采用Lane-sandhu 法对骨痂的X 线的成像速率进行，对骨痂的形成量也要进行计算。
1.7组织学观察
在移植后的第四周末处死实验羊，取骨缺损出的骨痂（包含载体），在10%的中性福尔马林溶液中进行固定、脱钙，对石蜡包埋进行切片，染色后进行观察。
1.8统计学处理
采用SPSS 10.0统计软件包的Wilcoxon检测法对评分结果进行检验。
2.结果
2.1细胞培养观察
骨髓细胞培养后的48 h内，培养瓶底部就能够显示一些大型圆形贴壁细胞，形成细胞的集落。在第6、7天贴壁细胞就会形成椭圆形，梭形，三角形的细胞群体进行扩大。在第10、12天，梭形、多角形细胞数量占到细胞总数的80% ~ 85%，，细胞呈复式进行排列，分界线并不清楚，集落处的细胞比较密集。在第14天时，细胞的形状没有发生明显的变化，只是细胞的安排更加密集，瓶子底部被复层的BMSC完全覆盖了。
2.2骨缺损骨痂形成
通过钼靶X线进行检查，骨痂的形成情况如图1所示。
第1周：实验侧和对照侧没有出现明显的差异，实验侧的点密度开始增加。
第2周：高密度阴影两端的骨缺损是明显可见的，这就会形成新的骨痂，这个时候实验组的大多数骨痂影会比对照组要长，高密度阴影没有形成有效的连接。
第3周：缺损处两端的骨痂朝着中间进行生长，有4例实验侧缺陷愈伤组织连接，对照组没有出现骨痂的连接。
2.3骨痂的组织学表现
实验侧：新生骨痂的一般视图会出现局部扩大，用刀片进行切割感觉其硬度远远小于正常愈伤组织骨干的硬度；镜头下见骨痂的横断切片，看到大松质骨，骨小梁周边还有许多骨母细胞，骨小梁中间的细胞核比较大，在骨小梁处可以看见骨沉积线，骨小梁之间的纤维组织和小血管，说明存在骨痂。如图2所示。
对照组：骨痂中除了能够看到大片的松质骨片，还存在成片的软骨、软骨周围还有松质骨，骨缺损的空隙处为空白纤维结缔组织。如图3所示。
2.4骨痂形成量评分和统计分析
对骨痂的图像分数结果如表1所示。通过Wilcoxon方法进行统计分析，在第2、3、4周，实验侧的新骨痂量比对照侧要多，实验侧骨痂形成量和对照侧的骨痂形成量之间存在明显的统计学差异性（P < 0.05）。
3.讨论
BMSC是骨髓中的一种间充质细胞，具有多向分化的潜能，这也是唯一能够同时含有丰富的骨祖细胞的定向性和诱导骨细胞的细胞系。特别是细胞因子在一些特定的物理和化学条件下，可以有针对性化为成骨细胞。近年来，随着深化骨髓成骨潜力的研究不断深入，证实BMSC能够在体外转化为成骨细胞，可以在条件培养液中生成骨。BMSC分化的过程中除了受到培养条件的控制以外，已知多种生长因子能够调节BMSC成软骨或成骨。如BMP、基本成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、血小板源生长因子等所有都能够诱导BMSC向成骨细胞或成软骨细胞进行分化，如在骨髓、骨断端部分都存在这些影响因子。本研究的体外培养BMSC加煅烧骨载体治疗骨缺损，实验侧骨缺损的两端都能形成骨痂，可能和骨断端中BMP等因子存在一定的关系。本研究实验侧和对照侧实验条件的差别就是是否使用了煅烧骨载体，实验侧骨缺损愈合的速度更快，能够有效促进骨缺损的修复。使用煅烧骨载体以后可以有效的促进骨缺损的愈合速率。
4.总结
本实验通过对骨髓基质细胞以煅烧股为载体对骨缺损的作用研究，我们能够发现在骨缺损出移植基于载体的BMSC，实验侧的骨痂生长速率比对照侧的骨痂生长速率要快得多，其能够促进骨缺损部位的愈合。因此，我们可以发现在骨缺损处移植煅烧骨载体和BMSC，其能够促进骨缺损的愈合，值得在临床上进行推广应用。
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论文作者:曾铁功
论文发表刊物:《健康世界》2015年18期
论文发表时间:2016/3/1
标签：细胞论文; 骨髓论文; 载体论文; 基质论文; 实验组论文; 桡骨论文; 培养液论文; 《健康世界》2015年18期论文;