抗人卵巢癌×抗人CD3双特异性单链抗体BHL-1的生物活性研究

抗人卵巢癌×抗人CD3双特异性单链抗体BHL-1的生物活性研究

赵瑞[1]2003年在《抗人卵巢癌×抗人CD3双特异性单链抗体BHL-1的生物活性研究》文中指出卵巢癌死亡率居妇科恶性肿瘤之首位,五年存活率仅在30%,常规治疗方法难以提高其五年存活率。由于深居盆腔,起病隐匿,且易复发,临床发现多属晚期,因此,特异的早期诊断方法和残余病灶的及时清除是改善预后的关键环节。对人卵巢癌细胞相关抗原特异的双特异性抗体(Bispecific antibody,BsAb)在临床上有着广阔的应用前景。其优点是副作用小,特异性强,制备简单。基因工程法制备BsAb是随着基因工程抗体技术的发展,在小分子抗体的基础上发展起来的。作为手术、放疗、化疗等传统方法的补充,其作用在于消除亚临床病灶,减少乃至消灭肿瘤的复发和转移。 本实验室已利用基因工程技术成功构建了抗人卵巢癌×抗人CD3双特异性单链抗体(命名为BHL-I),并在大肠杆菌中得到了高效表达。本文则在此基础上对该双特异性抗体的生物学活性进行了研究,这将为其进入临床研究提供必要的前提和保证。 在获得纯化、复性的BHL-I样品后,首先采用ELISA方法对其抗原结合活性进行了测定,以OD490值比阴性对照高出2.5倍为活性合格的标准,在此基础上对活性合格样品进行了一系列实验研究其生物学活性。 通过流式细胞术进一步验证了BHL-I与两种相应抗原的结合活性,以及激活T细胞发挥效应功能的作用。结果显示,BHL-I能够有效激活T细胞,能够刺激T细胞分泌IL-2,其培养上清用于培养IL-2依赖细胞株CTLL-2能够使其增值。另外,BHL-I不仅与T细胞及卵巢癌细胞(SKOV3)具有良好的结合活性,而且与其它无关肿瘤细胞的结合活性明显低于与SKOV3细胞的结合活性,说明它具有较好的靶向性及特异性。进一步通过体外杀伤试验验证了BHL-I介导的效应细胞裂解靶细胞的能力,结果也非常理想。杀伤活性与抗体的浓度、作用时间及效靶比有关,在最适条件下,杀伤率最高可达87%。另外,IL-2、CD28单克隆抗体等联合应用能有效提高杀伤活性。 通过荷卵巢癌裸鼠的放射免疫显像试验研究了BHL-I的体内分布及全身清除情况,结果表明,放射性标记的抗体在肿瘤组织中有特异性摄取。初步的体内试验也验证了双特异性抗体具有抑制肿瘤生长的作用。 总之,研究结果对于BHL-I的生物学及药效学活性进行了评价,对其临床研究奠定了基础。

朱琳琳[2]2006年在《全合成人源抗体库的构建及抗BHL-1单链抗体的初步筛选》文中研究说明通过抗体库筛选针对特异抗原的噬菌体展示技术是目前获得人源性抗体最有效的方法,抗体库依据基因序列来源的不同,又可分为免疫库和天然库。利用全合成的方法可以获得序列随机分布的DNA文库,利用Kabat数据库公布的人抗体序列信息并结合已发表体骨架区序列,我们设计了全合成抗体库的骨架序列和CDR3随机区序列。根据统计和归纳,现有的人抗体的可变区基因可按重链和轻链分组,分别代表人抗体序列的七个胚系基因。其中重链分为VH1A、VH1B、VH2、VH3、VH4、VH5和VH6;轻链则按Kappa链和Lamda链的不同,将Kappa链和Lamda链各分为四个组和叁个组,通过轻、重链的组合构成的单链抗体库可以涵盖超过95%的抗体胚系序列。在随机化过程中,利用DNA组合固相合成法来实现各位点氨基酸种类和频率的控制,以PCR的原理,无引物或低引物浓度来控制库冗余度,降低差错,经电击转化大肠杆菌最终建成了1.5×109库容的噬菌体展示文库,该抗体库的阳性率超过85%,正确序列超过50%,符合预期的目标。全合成抗体库的设计特征、构建方法和质控标准都可以保证其实用性。为进一步鉴定此抗体库的效率,我们以BHL-1(抗人卵巢癌×抗人CD3双特异抗体)蛋白为抗原,经生物淘选获得了数个具有较高亲和力的克隆,对其中C8进行亚克隆,转入表达载体进行表达,表达产物以包含体为主,经复性后进行活性检测,对靶抗原的ELISA测定具有特异的结合能力(OD490=0.727),推测其结合位点在抗卵巢癌单链抗体部分,表明获得了有意义的“人源化”抗体,此抗体经进一步优化可用于测定BHL-1蛋白的样品浓度和残留。理论上,此抗体成库可针对任意抗原筛选单链抗体,有望成为科研用抗体制备、抗体人源化的工具,经序列优化还可以用来制备诊断试剂或治疗性中和抗体。

张众, 方敏, 赵瑞, 张雪涛, 黄开瑜[3]2004年在《导向治疗卵巢癌的基因工程双特异抗体》文中进行了进一步梳理目的:研究抗人卵巢癌×抗人CD3双特异性单链抗体(BHL-1)的体外活性以及初步的抗肿瘤作用。方法:以大肠杆菌为表达系统表达BHL-1,得到包涵体,经过包涵体变性、复性和纯化得到纯度大于95%的目的蛋白。应用ELISA及流式细胞计数术(FACS)测定经纯化复性的BHL-I的抗原结合活性及其结合特异性。应用PRISM软件测定BHL-I与两种相应抗原的结合亲和力常数(Kd)。应用用丝裂霉素C处理过的卵巢癌细胞株SKOV3细胞

参考文献:

[1]. 抗人卵巢癌×抗人CD3双特异性单链抗体BHL-1的生物活性研究[D]. 赵瑞. 西北农林科技大学. 2003

[2]. 全合成人源抗体库的构建及抗BHL-1单链抗体的初步筛选[D]. 朱琳琳. 吉林大学. 2006

[3]. 导向治疗卵巢癌的基因工程双特异抗体[C]. 张众, 方敏, 赵瑞, 张雪涛, 黄开瑜. 第八届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集. 2004

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