四川福森特司法鉴定所 610041
【摘要】目的：分析法医学组织病理切片STR分型影响因素。方法：取20例尸检新鲜组织样本，取出心、肝、脑、肾、脾、肺、肠七个部位组织做组织病理切片，保存切片时间分别在7d、14d、30d、90d、180d、360d、720d，提取切片DNA，并以STR分型，对比新鲜尸体DNA样本基因型。结果：保存时间越长，STR等位基因检出率越低，肺部STR基因检测率较其他部位检出率较高，数据有统计学意义，P<0.05。结论：时间是影响STR分型的主要因素，保存时间越长，STR分型成功率降低显著。
【关键词】法医学；组织病理切片；STR分型；影响因素
近年来法医学实验室在DNA物证提取中，多是应用组织病理学及细胞形态学。在病理切片检测中，各种案件均需检测组织切片DNA，并确定组织切片真实来源。而在组织切片保存检测时，甲醛固定及染色等操作步骤均会破坏组织切片DNA，使细胞含量降低，进而降低了细胞STR分型准确性。因此需明确组织病理切片STR分型影响因素，进而提高实验检测准确性。本文就分析法医学组织病理切片STR分型影响因素，其结果分析如下。
1 材料与方法
1.1 样本与分组
取20例尸检的新鲜组织样本，均为本鉴定中心尸检心、肝、脑、肾、脾、肺、肠七个部位组织样本，脑保存7d，为0-3个月婴儿；心保存14d，为4个月-3岁幼儿；肝保存30d，为3-6岁少儿；肺保存90d，为7-17岁少年；脾保存180d，为18-35岁青年；肾保存360d，为36-60岁中年；肠保存720d，为>60岁老年。
1.2 检测方法
分别取心、肝、脑、肾、脾、肺、肠七个部位组织样本，以10%甲醛固定2d，制成石蜡包埋组织，HE染色，作5μm组织切片厚度，分别保存7d、14d、30d、90d、180d、360d、720d。组织切片以二甲苯脱蜡，无水乙醇洗，自然晾干切片后，刮取组织置入离心管 ，以去离子纯净水洗涤，离心去上清。以硅珠法提取组织切片DNA，取70μLTNE、10%SDS 10μL、PK10μL置入离心管，振荡混匀后以56℃环境内保存半小时后，置入99℃加热12min。随后取硫氰酸胍150μL振荡混匀，离心，去上清置入离心管。随后取硅珠悬液10μL振荡混匀后置入室温，振荡混匀5s，离心，弃上清。以70%乙醇150μL洗涤，60℃烘干。取TE100μL置入，振荡混匀，56℃环境内保存20min，离心，制备成DNA模板，在4℃环境内保存。
1.3 STR基因分型
STR基因座分型：取ABI Identifiler试剂盒行STR基因座荧光扩增，以10μL Hi-Di甲酰胺、1.5μL PCR产物、0.2μL分子量内标GS-500 LIZ 振荡混匀，采取毛细管电泳，时间10s。
1.4 统计学方法
研究数据采取SPSS20.0统计学软件处理。组间计数数据样本以x2检验，当数据检验P<0.05时，说明数据存在统计学意义。
2 结果
STR检测分型结果分析
以新鲜尸体STR基因型为阳性对照，不同年龄 STR等位基因检测分型差异无统计学意义，P>0.05，组织类型、保存时间STR等位基因检出率比较，而在保存90d后肺、脾两部位STR基因型检测率较高，而肠STR检出率较低，数据有统计学意义P<0.05。见表1所示。
3 讨论
当前法医学在识别个体及判定身源时，多是采用组织病理切片，也是低拷贝模板DNA分型的主要检测方法。等位基因脱扣（ADO）、杂合基因座丢失（LOH）是导致STR基因分型错误的主要原因，当DNA模板浓度不足PCR体系有效阈值时，易出现ADO或LOH；DNA模板溶液存在扩增抑制物，致PCR扩增效果降低，进而出现ADO或LOH，并会影响STR等位基因分型[2]。另外单细胞等位基因片段越长，则越容易出现ADO。本次研究结果显示，肺部STR基因型检测率较高，而肠STR检出率较低，数据有统计学意义P<0.05。究其原因是脑组织、肠组织切片DNA检测中，浓度较低，则会出现ADO、LOH等情况，致STR基因检测率降低，影响STR分型结果。在个体识别STR等位基因时，若组织切片DNA模板检测的STR基因超过12个，则个体STR等位基因个数累计就能满足统计学要求。有研究资料[3]显示，当各类组织细胞DNA切片保存时间不足一个月，STR等位基因型就能检出超过12个；若切片保存时间超过3个月，保存DNA模板的细胞含量显著降低，基因组拷贝数也会随之减少，且扩增抑制物会影响PCR扩增影响度，进而会出现ADO情况，致STR等位基因型降低，检出率也随之减少。若组织切片保存时间超过6个月，STR基因座较容易出现ADO、LOH等情况，若组织切片保存时间越长，也更容易出现杂峰，致LOH出现数量增多，使STR等位基因型数量降低，且个数检出个数不足10个。若组织切片保存时间超过1年，随机扩增效应明显，STR等位基因型检出个数不超过5个，而保存时间超过2年，细胞组织切片基因组含量随之降低，进而容易出现LOH现象，因此STR等位基因分型难以检测。本次结果显示保存时间越长，STR等位基因检出率越低，数据差异有统计学意义，P<0.05。因此组织切片保存时间越长，则会影响STR分型检出率。保存时间越长，组织切片DNA也会随之降低，进而STR基因分型检测成功率也随之下降。
总而言之，时间是影响STR分型的主要因素，保存时间越长，STR基因分型检测成功率降低显著。一般组织切片保存时间在3个月内，能准备行本源认定。而通过肺组织切片检测，可作为STR基因分型检测的理想样本。
参考文献：
[1]冯杏玲，陈晓晖，陈玲，等.六色荧光标记同步检测27个STR基因座的法医学应用评估[J].基础医学与临床，2016,36（7）：969-975.
[2]张文琼，刘宇轩，黄代新.Y-STR突变及快速突变Y-STR的法医学应用价值[J].中国法医学杂志，2015,30（4）：380-383.
[3]陈勇，王瑛，彭珊，等．三个STR分型体系在法医学中的应用[J]．中山大学学报（医学科学版），2014，35(5)：685-689.
论文作者:陈梅君 钟倩 代瑶
论文发表刊物:《医师在线》2018年4月上第7期
论文发表时间:2018/7/5
标签：切片论文; 组织论文; 检出论文; 时间论文; 法医学论文; 基因论文; 统计学论文; 《医师在线》2018年4月上第7期论文;