1佳木斯市中心医院 154002；2鹤岗市人民医院 154101
摘要：目的：研究分析雷公藤内酯醇对实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）大鼠外用血清SIL－2R表选的影响。方法：模型组采用豚鼠髓鞘蛋白匀浆和福氏完全佐剂诱发大鼠急性EAE，治疗组在模型组基础上予以不同剂量雷公藤内酯醇[0.2me/（kg·d），0.4mg/（kg·d）]，观察临床表现并评分；HE染色和Loyez氏髓鞘染色观察病理和髓鞘改变；ELISA法测定血清的SIL－2R水平。结果：高剂量组未出现临床症状；低剂量组EAE临床症状较模型组轻。高剂量组SIL－2R浓度为（36.43±5.43）mg/mL，与模型组和低剂量Tri组比较P<0.01和p<0.05；脑和脊髓小血管周围炎症细胞浸润明显减少；髓鞘结构完整。结论：雷公藤内酯醇对EAE的治疗有剂量相关性。其作用机制与抑制SIL－2R表达有关。
关键词：实验性变态反应性脑脊髓炎；雷公藤内酯醇；可溶性白介素2受体
Abstract：Objective：To study the effect of triptolide on the SIL - 2R expression in the serum of rats with experimental allergic encephalomyelitis（EAE）.Methods：the model group using guinea pig myelin protein homogenate and complete Freund's adjuvant induced acute EAE rats in treatment group were given different dose of triptolide in the model group on the basis of [0.2me/（kg - D），0.4mg/（kg - D）]，observe the clinical manifestations and pathological score；to observe the changes of HE and myelin staining and Loyez's myelin staining；Determination of serum SIL-2R level ELISA method.Results：the clinical symptoms were not found in the high dose group，and the clinical symptoms of EAE in the low dose group were lighter than that in the model group.In high dose group，the concentration of SIL（+ 5.43）was mg/mL，P<0.01 and p<0.05 were compared with the model group and low dose Tri group，the inflammatory cell infiltration around the small vessels of brain and spinal cord was significantly reduced，and the structure of myelin sheath was higher than that of 2R.Conclusion：triptolide has dose dependence in the treatment of EAE.The mechanism is related to inhibiting the expression of soluble interleukin-2 receptor.
Keywords：experimental allergic encephalomyelitis；triptolide；soluble interleukin 2 receptor
临床上对多发性硬化（multiple sclerosis，MS）主要采用抑制免疫治疗，但由于免疫抑制剂副作用大，治疗后复发率高，因此MS的临床治疗效果不佳。实验性变态反应性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）因与MS有共同的免疫及病理特征，故公认为研究MS的理想动物模型。应用中药多靶点作用抑制免疫反应也是一种特异的免疫治疗手段，国内多采用有免疫抑制、抗炎作用的中药或其制剂干预EAE来研究其发病机制。雷公藤内酯醇（Triptolide，Tri）对EAE的研究国内外报道少。本实验旨在探讨Tri对EAE大鼠外周血SIL－2R表达的影响，为Tri临床治疗MS提供试验依据。
1 材料与方法
1.1实验动物与分组
Wistar大鼠38只，雌性，6－8周，体重（200±20）g，购自第三军医大学大坪医院动物中心，清洁级，动物中心许可证号：SCXK（渝）20020003。豚鼠6只雌雄不拘，体重450－500g，购于遵义医学院实验动物中心。大鼠随机分为：正常组，生理盐水和福氏完全佐剂（complete freund's adjuvant，CFA）对照组（NS/CFA组），左旋咪唑对照组（levamisole，LMS），Tri对照组，低剂量Tri组（LTri组），高剂量Tri组（HTri组），每组5只；模型组8只。
1.2 主要药物及试剂
雷公藤内酯醇由福建省医学科学研究所提供；福氏完全佐剂和左旋咪唑均购自Sigma公司；SIL－2R检测试剂盒购自晶美生物工程（北京）公司。
1.3 动物模型制作
动物适应性喂养1周，采用笔者以往报道的方法制作模型。即将豚鼠脊髓与等体积NS研匀，反复多次冰冻，研磨，制成无黏性匀浆，与等体积CFA混合抽打成油包水样乳剂。模型组和治疗组每只大鼠双后足掌皮下和尾近端注入0.4mL和0.1mL乳剂。注入后即刻、24、48h腹腔注射LMS10mg/kg。在免疫同时及每间隔24h连续16天经腹腔注射2％丙二醇溶解的Tri0.2mg/（kg·d）（LTri组）和0.4me/（kg·d）（HTri组）。NS/CFA组、LMS和Tri对照组分别注入等量NS/CFA、LMS和Tri，用法同模型组。
1.3.1 临床表现将注射日定为第0天，出现临床症状开始评分，2次/日。每组大鼠每日临床积分值由当日该组大鼠临床积分总和除以该组大鼠数目获得。各组大鼠临床总积分均值，均指在出现临床症状到第16天。按Koh报道的评分标准记录：无症状为0分，尾部远端肌张力丧失为0.25分，全尾张力丧失为0.5分，共济失调步态为1.0分，单后肢麻痹为2.0分，双后肢麻痹为3.0分。
1.3.2 取材所有大鼠于免疫后第16天，10％水合氯醛麻醉后心内取血3mL，离心留取血清－20℃待检，用NS及pH7.4的4％甲醛灌注固定，冠状切取大脑视交叉、小脑皮层、脑干、颈膨大、胸髓和腰膨大等部位组织，石蜡包埋，制成5μ.m厚脑和脊髓切片，进行HE染色、Loyez氏髓鞘染色。
1.3.3 SIL－2R检测采用ELISA法，在遵义医学院免疫学教研室检测，检测过程严格按说明书操作。
1.4 统计学方法
数据以均数（x）±标准差（s）表示，输入SPSS12.0软件包进行统计学处理。
2 结果
2.1 临床表现
正常组、NS/CFA组、Tri对照组、LMS组和HTri组均未出现症状，临床评分均为0分，但LMS组有少食、萎靡、活动度差等。LTfi组于第14天出现症状，临床评分为（O.34±0.24）分；模型组于第13天出现症状，临床评分为（3.27±1.70）分，明显高于HTri和LTfi组（P＜0.01）。
2.2 病理改变
正常组、NS/CFA组、Tri组、LMS对照组和HTfi组HE染色及Loyez氏髓鞘染色未见异常。模型组HE染色见脑和脊髓白质内小血管周围有大量淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润，形成“袖套”样改变，有胶质细胞结节形成；Loyez氏髓鞘染色见髓鞘结构疏松、部分髓鞘脱失。LTri组HE染色见脑和脊髓白质内小血管周围亦有淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润，但较模型组明显减少；loyez氏髓鞘染色见部分髓鞘脱失。
2.3 Tri对SIL－2R的影响
3 讨论
EAE发病机制主要是免疫损伤，研究发现，在EAE和MS的发病中细胞因子对疾病的预后产生决定性影响，Th1表型的细胞因子如IL－2、IL－12、TNF－α、IFN－γ正向调节细胞免疫，使病情加重，而Th2表型的细胞因子-IL－10、转移生长因子－β、IL－4负向调节细胞免疫，使病情缓解。在IL－2存在的情况下，MBP特异性Th细胞产生，针对MBP的特异性和非特异性免疫反应起动，介导免疫反应和免疫病理损伤。对EAE的发生，IL－2发挥关键作用。
近年研究认为，在某些诱因的作用下，自身髓鞘成分MBP被免疫系统识别，抗原提呈细胞捕捉和处理抗原，分泌IL－1，Th1细胞接受抗原信息，表达IL－2受体，分泌IL－2；T细胞本身还可通过自身分泌的细胞因子调节作用，如T细胞产生的IL－2反过来刺激T细胞本身IL－2受体表达和进一步分泌IL－2。鉴于在EAE对照组动物以及非中枢神经组织中很难检测到IL－2，但可以通过检测外周血清中SIL－2R表达的水平来反应IL－2。
IL－2和IL－2R系统在淋巴细胞活化增殖过程中居于举足轻重的地位，因此监测IL－2R的变化对自身免疫病MS辅助诊断、病情转归及预后判断有重要的参考价值，本实验通过检测EAE大鼠外周血清中SIL－2R发现：模型组SIL－2R为（52.84±3.98）mg/mL，较正常组、NS/CFA和Tfi对照组明显增高，有统计学意义。SIL－2R表达增高对EAE的发生和发展起着重要作用。
Tri是雷公藤二萜化合物中免疫抑制作用最强的单体，具有免疫抑制、抗炎等作用，广泛用于治疗多种自身免疫性疾病及移植排异反应。邹小明等，研究结果：不同浓度的Tfi对ConA诱导的小鼠脾脏淋巴细胞合成和分泌IL－2的功能没有明显的影响，但Tri对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞表面IL－2R表达却有明显的抑制，随着Tfi浓度的增加，小鼠脾脏淋巴细胞中IL－2R+细胞数呈递减趋势，Tri发挥抗排斥效应，主要是通过抑制IL－2R的表达，从而使IL－2与IL－2R的相互作用受到影响，最终抑制了淋巴细胞增殖。本实验应用Tri干预EAE发现：高剂量Tri治疗组未出现症状，HE染色和Loyez氏髓鞘染色无异常，其外周血清SIL－2R表达水平较模型组和低剂量Tri组明显降低，差异有显著性；低剂量组出现症状日期比模型组延迟、临床症状轻、病情没有进展。
本研究结论：外周血清的SIL－2R水平增高在大鼠急性EAE中发挥重要作用；高剂量Tri能预防大鼠急性EkE发生，低剂量Tri能减轻EAE病情；Tri的治疗作用机制主要是通过抑制了外周血清的SIL－2R的表达，避免了EAE发生或减轻病情。且这种作用有剂量相关性。
另外，LMS有时可使正常的免疫功能上调并超越正常水平。本实验采用LMS作为免疫增强剂，发现LMS对照组与正常对照组和NS/CFA组比较，外周血清的SIL－2R表达明显增高，但与模型组比较明显降低，HE染色及Loyez氏髓鞘染色未见髓鞘明显脱失。表明LMS对大鼠的免疫功能有影响，但由于没有MBP刺激的，大鼠未出现临床症状。说明LMS增强了机体的免疫反应，是诱导EAE发生的重要免疫调节剂。
论文作者:魏键楠1（通讯作者）钟福刚2
论文发表刊物:《健康世界》2017年第1期
论文发表时间:2017/2/28
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