何泉[1]1997年在《MLC_2-糜酶融合基因克隆、细胞表达及转基因小鼠的产生》文中研究指明糜酶是一种丝氨酸蛋白酶，它能高效特异地将血管紧张素Ⅰ转换为血管紧张素Ⅱ。已报道体外实验观察到在人心脏左心室中75％以上的血管紧张素Ⅱ形成酶活性不能被血管紧张素转换酶抑制剂抑制，而能被丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制(大部分为糜酶活性)，糜酶在人心脏中可能起着重要的作用。而在小鼠心脏中糜酶所形成的血管紧张素Ⅱ不足15％，因此可以选择小鼠作为比较理想的实验动物，建立人心脏糜酶转基因小鼠以便在整体动物体内研究糜酶的结构、功能以及基因表达调控与高血压、心肌肥厚等心血管疾病的关系。 肌球蛋白轻链(myosin light chain-2，MLC2)在心脏中是一种可调控蛋白，通过磷酸化和去磷酸化作用而进行调控。MLC2启动子可通过α-肾上腺素能激动剂诱导使其在心脏组织中特异性过量表达，因此能够有效地调控拼接于MLC2下游的糜酶基因的表达。 一．MLC_2-糜酶融合基因克隆 用BstEⅡ线性化质粒pCHⅠ(含6kb人心脏糜酶基因)DNA，核酸酶BAL31作不同程度双向删切，建立糜酶结构基因系列克隆。通过测序，从97个克隆中筛选出四个合适的糜酶结构基因克隆，以次为P81、P85、P87和P88。以SpeⅠ和KpnⅠ酶解糜酶结构基因克隆质粒DNA，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收3.2kb的糜酶结构基因片段，连入经SpeⅠ和KpnⅠ酶解处理的质粒MLCSVOA(含250bp的大鼠心脏MLC2启动子序列)载体中，建立MLC_2-糜酶融合基因克隆，通过酶解分析，筛选出合适的MLC_2-糜酶融合基因克隆M81、M85、M87和M88用于下一步实验研究。 二．人心脏糜酶基因在分离培养的乳鼠心脏组织细胞中的表达 1．人心脏糜酶基因在培养的Wistar乳鼠心脏组织细胞中的表达：经超速离心纯化的质粒DNA pCHⅠ、pCHⅡ(含11kb人心脏糜酶基因，和pCHⅠ相比，糜酶基因下游多出5kb的序列)和pBS-KS(空载体质粒，作为阴性对照)用改良的磷酸钙共沉淀转化分离培养的Wistar乳鼠心肌细胞和非心肌细胞(包括心内膜细胞，内皮细胞，成纤维细胞以及血管平滑肌细胞等)，通过总RNA Dot-blot杂交(以人心脏糜酶基因cDNA作探针)检测人心脏糜酶基因的表达。结果显示，人心脏糜酶基因仅在非心肌细胞中表达，在心肌细胞中不表达，而且人心脏糜酶基因cDNA探针和大鼠心脏糜酶转录产物不产生杂交信号，说明人心脏糜酶基因表达具有强的非心肌细胞特异性。该方面的研究目前还未见文献报
何泉, 陈兰英, 戴蕴平, 陈永福, 刘力生[2]1998年在《MLC_2-糜酶融合基因克隆及转基因小鼠的产生》文中认为为研究糜酶基因在体内的结构与功能以及与心肌肥厚的关系，并提高糜酶基因在小鼠心脏中的表达，构建肌球蛋白轻链－２启动子（ｍｙｏｓｉｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ－２ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ＭＬＣ２）－糜酶融合基因并产生转基因小鼠．通过删除糜酶基因启动子序列，构建结构基因克隆，然后与大鼠心脏肌球蛋白轻链－２启动子序列相拼接，构建ＭＬＣ２－糜酶融合基因克隆，回收并纯化融合基因片段，显微注射入小鼠受精卵产生转基因小鼠，经ＰＣＲ扩增、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交和ＰＣＲ扩增产物的测序，筛选和确定转基因鼠．在新出生的４６只小鼠中有２只为转基因阳性鼠，且外源基因能稳定遗传给后代，从而获得了可用于研究糜酶基因在体内的结构与功能以及与心肌肥厚的关系的转基因小鼠模型．
何泉, 陈兰英, 田小利, 赵淑华, 姜立群[3]1997年在《原核注射产生转基因小鼠中的缺失整合》文中研究说明用心脏特异性启动子肌球蛋白轻链－２（ｍｙｏｓｉｏｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ－２）ＭＬＣ２和糜酶结构基因相拼接构建ＭＬＣ２－糜酶融合基因，通过原核注射法产生转基因小鼠。用特异性引物对新生鼠鼠尾ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增初选，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交确定整合有外源基因的阳性鼠。低熔点琼脂糖凝胶电泳回收阳性鼠ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段，经测序后，与所转外源基因序列比较，发现缺失整合现象。
李鹏, 陈兰英[4]2000年在《转基因小鼠中糜酶在心脏血管紧张素Ⅱ形成中的作用》文中进行了进一步梳理为研究人心糜酶(hChymase)在心脏血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)形成中的作用及在心肌重塑过程中的意义, 建立了MLC2-人心糜酶转基因小鼠. 用RT-PCR方法分析了糜酶基因的组织特异性表达和心脏中Ⅰ, Ⅲ型胶原基因的转录表达, 并用放射免疫法检测了心脏糜酶及血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme, ACE)活力以及心脏和血浆的AngⅡ含量, 用明胶酶谱法检测了心脏基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)活力; 并对糜酶转基因小鼠的心脏肥大表型用生理学和形态学方法进行了初步观察. 和非转基因小鼠(对照组)比较, 结果表明: (1) 糜酶转基因可在小鼠心脏中特异表达; (2) 糜酶转基因小鼠心脏糜酶活力较对照((0.27±0.07) U/mg vs (0.15±0.02) U/mg, P<0.05)显著升高, 而ACE活力不变((0.17±0.03) U/mg vs (0.18±0.02) U/mg); (3) 糜酶转基因小鼠心脏AngⅡ含量升高, 约为对照的3倍((1984±184) pg/g vs (568±88) pg/g, P<0.05), 而血浆AngⅡ含量不变((218±106) pg/mL vs (234±66) pg/mL); (4) 糜酶转基因小鼠心脏基质金属蛋白酶-9(MMP-9)活力及Ⅰ型胶原mRNA水平也显著升高(P<0.05), 而Ⅲ型胶原mRNA水平及Ⅰ/Ⅲ型胶原的mRNA比值变化不明显; (5) 糜酶转基因小鼠的血压、心率、心重/体
杨凤萍[5]2006年在《我国部分鹅品种（类群）Myostatin基因SNPs及遗传多样性研究》文中进行了进一步梳理本研究首次获得家鹅Myostatin基因3′-调控区部分序列(GenBank登录号为DQ291134)以及内含子1全序列(GenBank登录号为DQ355160),分析了两序列结构特点,并利用GenBank中不同物种Myostatin基因相关的序列信息,初步研明了Myostatin基因cDNA、3′-调控区以及内含子等核苷酸序列对分析物种进化的贡献;在测序的基础上,利用Oligo 6.0和Primer Premier V5.0引物设计软件设计了15对PCR-SSCP引物,首次获得了3个品种鹅Myostatin基因不同区段单核苷酸多态(SNP)特点,初步分析了不同SNPs与扬州鹅(80日龄)、皖西白鹅(110日龄)和五龙鹅(110日龄)的屠体重、胸肌重、胸肌率、腿肌重、腿肌率、全净膛重、全净膛率等屠体性状之间的关系;利用多态性丰富的6个微卫星基因座对雁鹅、皖西白鹅、五龙鹅、扬州鹅、浙东白鹅、兴国灰鹅、四季鹅以及引进品种莱茵鹅等8个家鹅品种(类群)的遗传多样性以及亲缘关系进行了探索。研究结果如下:(1)家鹅Myostatin基因不同区域序列特征为:5′-调控区核苷酸序列的碱基组成中,A+T的比例为63.32%,G+C为36.44%;转录起始点位于第1外显子上游117bp处;转录起始点上游﹣73bp处为CCAAT盒,﹣27bp处有一TATA盒;与GenBank中登录的鹅同一序列的同源性高达99%。同时比对结果发现,在﹣386bp处(T→A)、﹣371bp处(T→G)、﹣176bp处(A→T)、﹣154b处(A→T)、﹣72bp处(C→T)具有待检测的单碱基突变位点。
参考文献：
[1]. MLC_2-糜酶融合基因克隆、细胞表达及转基因小鼠的产生[D]. 何泉. 中国协和医科大学. 1997
[2]. MLC_2-糜酶融合基因克隆及转基因小鼠的产生[J]. 何泉, 陈兰英, 戴蕴平, 陈永福, 刘力生. 中国生物化学与分子生物学报. 1998
[3]. 原核注射产生转基因小鼠中的缺失整合[J]. 何泉, 陈兰英, 田小利, 赵淑华, 姜立群. 基础医学与临床. 1997
[4]. 转基因小鼠中糜酶在心脏血管紧张素Ⅱ形成中的作用[J]. 李鹏, 陈兰英. 科学通报. 2000
[5]. 我国部分鹅品种（类群）Myostatin基因SNPs及遗传多样性研究[D]. 杨凤萍. 扬州大学. 2006