陈倩[1]2016年在《抗鸡传染性法氏囊病病毒抗体ELISA检测方法的建立及标准抗原、标准血清的研制》文中研究说明传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)感染引起的一种急性、高度接触性传染病。该病主要侵害3-6周龄雏鸡及青年鸡,使鸡群发病、死亡,同时病毒侵害鸡法氏囊B淋巴细胞,导致机体免疫抑制,诱发鸡群疫苗免疫失败,并对其他疾病的易感性增加,出现继发感染或混合感染。因此,传染性法氏囊病被认为是目前严重危害养鸡业的重要传染病之一。本研究利用分子生物学技术成功获得了GST-VP2和GST-VP3的可溶性重组蛋白,并以此表达产物建立了检测IBDV抗体的ELISA方法；同时,应用IBDV-JS株感染SPF鸡,制备了IBDV抗原和阳性血清,并对抗原和抗体进行了一系列的鉴定和标定,获得了相关标准抗原和标准血清,为IBDV的诊断提供了有效的方法和材料。1.检测IBDV抗体ELISA方法的建立本研究根据IBDV-JS株的序列,分别设计了VP2和VP3基因的特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)方法对VP2和VP3基因的全长进行了扩增,然后将目的片段经双酶切克隆至表达载体pGEX-6p-1,并转化BL21(DE3)感受态细菌,挑取阳性细菌克隆送公司测序鉴定。测序正确的pGEX-6p-1-VP2和pGEX-6p-1-VP3经IPTG诱导表达后,十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析诱导表达产物,结果发现当IPTG终浓度分别为0.75mM和0.25mM时,细菌裂解上清中GST-VP2(约80KDa)和GST-VP3(约52KDa)的表达量最高。蛋白免疫印迹试验(Western-Blot)结果显示GST-VP2和GST-VP3重组蛋白均与IBDV阳性血清反应,表明重组蛋白具有良好的抗原性。将纯化后的重组蛋白GST-VP2和GST-VP3分别作为包被抗原,建立检测IBDV抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。通过实验条件的优化,确定VP2, VP3抗原最佳包被量分别为5μg/ml,0.625μg/ml,待检血清最佳稀释度为1：400,最佳孵育时间为30 min,酶标二抗最佳孵育时间为30min,底物最佳显色时间为15min。用建立的ELISA方法检测50份SPF鸡阴性血清,以确定阳性临界值：对基于VP2重组融合蛋白建立的ELISA方法,当OD650>0.12时,判为阳性；对基于VP3重组融合蛋白建立的ELISA方法,当OD650>0.136时,判为阳性。交叉反应性实验证明本研究建立的抗体ELISA检测方法仅与IBDV阳性血清反应,与IBV、ILTV、MDV、ALV、EDSV、AIV-H9、NDV、REV、GPV等阳性血清均不反应,特异性良好。该方法的批内和批间的变异系数均小于10%,说明该方法可行、重复性好。用已建立的2种IBDV抗体检测ELISA方法检测采集自江苏地区的77份鸡血清样品,并与IDEXX公司以及BioChek公司的IBDV抗体检测试剂盒检测进行比较。结果VP2蛋白建立的ELISA与两种商品化试剂盒的检测符合率分别达到94.8%和96.1%；VP3蛋白建立的ELISA与两种商品化试剂盒的检测符合率仅为58.44%和59.7%。比较结果表明,用VP2蛋白建立的ELISA方法更适用于临床样本的检测。2.鸡传染性法氏囊病病毒标准抗原、标准血清的研制本研究使用IBDV-JS株经泄殖腔、点眼感染28日龄SPF鸡,无菌取病死鸡法氏囊组织进行研磨,通过离心和葡聚糖凝胶层析进行病毒纯化,对纯化的病毒抗原含量进行了标定。纯化后的病毒进行PCR鉴定、纯粹性鉴定、琼扩效价测定以及Western-blot分析,结果显示纯化后的IBDV不含IBV、ALV、REV、GPV、MDV、ILTV、AIV、NDV、EDSV等外源性病毒；琼扩效价为1：16；Western-blot试验结果显示纯化的病毒能与抗VP2蛋白的单抗反应。纯化的病毒经灭活后,分装冻干,检查冻干品物理性状,计算装量差异系数(CV),并进行支原体检验、无菌检验、灭活前后以及冻干前后琼扩效价、稳定性、均一性以及长期保存等一系列特性的标定,最终研制出鸡传染性法氏囊病标准阳性抗原。以低剂量IBDV-JS株免疫接种14日龄SPF鸡,经过两次加强免疫后,再以强毒(经泄殖腔、点眼感染)攻击,攻击后12天,静脉试血,效价合格后心脏采血,分离血清,并对血清的特性进行测定。琼扩试验结果显示制备的多抗血清效价为1：128；Western-blot试验结果显示制备的多抗血清与IBDV-JS株、IBDV-Q株反应时均出现两条特异性条带,分子量分别约为30kD和65kD；试验结果显示制备的抗IBDV血清IFA效价为1：1600、ELISA效价为1：51200；免疫荧光试验(IFA)与血凝抑制试验(HI)证明该多抗血清与ALV、REV、MDV、EDSV、NDV、IBV、AIV等其他禽源病毒无交叉反应,特异性良好。对制备的阳性血清进行标定后,加入万分之一硫柳汞防腐剂,分装冻干,检查冻干品物理性状,计算装量差异系数值(CV),并进行支原体检验、无菌检验、防腐剂添加前后以及冻干前后琼扩效价、稳定性、均一性以及长期保存等一系列特性的标定,最终研制出鸡传染性法氏囊病标准阳性血清。
白如念[2]2004年在《鸡传染性法氏囊病间接ELISA抗体检测试剂盒的研究》文中研究表明本研究将IBDV(CJ801)囊毒在鸡胚上盲传4代而后在鸡胚成纤维细胞上连传7代得到了CEF适应毒，大量繁殖细胞毒，经0.1％甲醛灭活，经蔗糖梯度密度离心法将其纯化。用纯化的IBDV作为包被抗原，建立了一种检测血清中IBDV抗体的间接ELISA方法。 通过对ELISA反应条件的系列摸索，确定了各组分的最适工作条件，并初步组装成试剂盒。试验结果表明，Costar公司生产的酶标板的变异系数为3.7％，达到ELISA的要求；IBD抗原最适包被浓度为0.0128微克／微升，最适包被条件为4℃过夜，血清稀释度为1：200，HRP-兔抗鸡IgG的最适工作浓度为1：800，待检血清和酶标二抗的反应时间均为37℃1小时，底物在室温显色20分钟。根据已经建立的ELISA方法及反应条件，确定阴阳性临界值为0.17。用本试剂盒检测已知的IBDV的BJ836、CJ801、2512、Cu和Harbin株单因子血清呈阳性反应。而与已知的SPF鸡血清呈阴性反应。用本试剂盒检测IBV，EDS’76，ND lasota，H9亚型AIV等单因子血清无交叉反应，说明建立的ELISA具有很好的特异性。本试剂盒与西班牙HIPRA公司IBDV抗体检测试剂盒的比较结果表明：两者共同检测60份血清，阴阳符合率达到96％；平行检测44份血清样品，两者检测结果呈线性关系，且相关系数为0.900。对包被好的反应板、酶标二抗、阴阳性血清和试剂盒的保存条件进行摸索，由于时间关系，只做到3个月。通过引入质控血清进行试剂盒的批内、批间重复性测试的方法，达到了试剂盒质量控制的目的。 本研究建立了一种快速、准确的检测方法，为我国IBD的免疫监测和血清学调查提供了行之有效的技术手段。
马飞[3]2005年在《鸡传染性法氏囊病间接ELISA抗体检测试剂盒的研制》文中指出传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病毒引起的危害幼鸡的一种急性高度接触性传染病,主要侵害鸡体内起体液免疫作用的法氏囊等淋巴组织,因此该病的危害不仅表现在疫病本身,更重要的是引起鸡体的免疫机能障碍,影响各种疫苗的免疫应答,甚至导致免疫失败〔1〕。由于免疫抑制,
马秀丽, 崔言顺, 张秀美, 黄兵, 崔治中[4]2003年在《鸡传染性法氏囊病间接ELISA诊断试剂盒的研制及初步应用》文中认为采用 vero细胞增殖的 IBDV抗原建立了间接 EL ISA,用于定量检测 IBDV抗体。对该方法进行了标准化研究 ,确立了该方法的最佳工作条件。在此基础上研制了相应的诊断试剂盒 ,并对盒内各组分的性状、保存、质量控制以及诊断试剂盒的特异性、敏感性、可重复性、符合率、与国外同类产品的比较、保存期等进行了全面、详细的研究。结果表明 ,研制的试剂盒在 - 2 0℃保存至 6个月时各项性能都很好。该试剂盒与进口试剂盒对同样血清样品检测 ,符合率为86 .7%。间接 EL ISA试剂盒与琼扩试验的符合率为 92 .5 %。该试剂盒可对大量血清样品进行检测 ,操作简单方便、结果特异性强、敏感性高、快速 ,更适合于大型鸡场 IBD免疫抗体水平的监测及现地疫病诊断等需要。
马秀丽[5]2002年在《鸡传染性法氏囊病ELISA监测方法的标准化研究》文中认为本课题对IBD免疫监测的间接ELISA方法进行了标准化研究，并制备了相应的诊断试剂盒。 在酶标抗体的制备方面，本研究对几种提纯IgG的方法(硫酸铵法、盐酸-硫酸铵法、醋酸-硫酸铵法、辛酸-硫酸铵法和硫酸铵-辛酸法)作了比较。SDS-PAGE电泳和蛋白含量测定分析表明，辛酸-硫酸铵法和硫酸铵-辛酸法提取的IgG纯度均较高，且硫酸铵-辛酸法提取的蛋白含量高于辛酸硫酸铵法。采用改良过碘酸钠法将提纯的兔抗IBDV IgG和兔抗鸡IgG进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，效果比较理想，二者工作浓度分别为1：1000，1：1200。 本研究探讨了MTT比色法用于检测病料中IBDV在细胞培养物中增殖情况的应用，结果表明，MTT可用作细胞培养物中病毒是否增殖的指示系统，可用于IBDV在CEF上初次增殖时的检测。通过对IBDV(D_(78)和Hb株)在3种宿主系统(vero细胞、CEF、鸡胚)中的增殖情况的比较，结果发现，IBDV在vero细胞(非洲绿猴肾细胞)的增殖周期较CEF长(一般为4～5天)；但vero细胞增殖的病毒，其毒价和蛋白含量均高于CEF和鸡胚增殖的相应病毒。因此选用异源的咖细胞大量增殖IBDV，并采用不同的方法进行纯化比较。纯化结果表明经Sephadox G-200分子筛层析可部分纯化抗原，但操作烦琐，费时费力；而氯仿抽提和聚乙二醇(PEG)6000沉淀法制备浓缩ELISA抗原，简单易行，更适于基层单位的应用。 经反复试验，本研究确立了间接ELISA检测IBD抗体的最佳反应条件，即：抗原包被浓度2.8μg/孔，用含0.5％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(内含0.05％吐温-20)作为封闭液，待检血清最佳稀释度为1：100，孵育条件均以37℃ 60min为佳。对不同日龄免疫鸡群24份血清样品进行了检测，从而确立了ELISA效价(ET)的对数值(10gET)与血清P／N值的线性回归分析，得直线方程y=10.1029-3.0461x(r=0.9404)，进而可通过血清单一稀释度的P／N值来计算样品的效价。根据对32份SPF鸡阴性血清检测结果的平均值制定了间接ELISA判定标准。在此基础上研制出IBD间接ELISA快速诊断试剂盒，并对盒内各组分的性状、保存、质量控制以及诊断试剂盒的特异性、敏感性、可重复性、符合率、与国外同类产品的比较、保存期等进行了全面、详细的研究。结果表明研制的试剂盒在-20℃保存至6个月时各项性能都很好。该试剂盒与进口试剂盒对同样血清样品检测，符合率为86.7％。间接ELISA试剂盒与琼扩试验的符合率为92.5％。该试剂盒可对大量血清样品进行检测，操作简单方便、结果特异性强、敏感性高、快速，更适合于大型鸡场IBD免疫抗体水平的监测及现地疫病诊断等需要。
张文通[6]2008年在《鸡传染性法氏囊病抗体快速检测试纸条的研制及初步应用》文中研究说明鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)引起的一种鸡的急性、高度接触性传染病,给世界各国的家禽养殖业带来了巨大损失。自IBDV发现至今,新的变异株及超强毒株的出现,使得传统疫苗已不能控制其流行,这进一步增加了该病的防制难度。开展血清抗体检测是防制该病的重要措施之一,目前IBD血清抗体检测方法主要有琼脂凝胶扩散法、微量血清中和试验法及酶联免疫吸附试验法。但这些方法由于费时或成本高等因素的制约,主要用于实验室检测,不适合基层检测。因此,研制一种适合基层兽医或养殖个体进行快速检测IBD血清抗体的方法,对防制IBD是必要的。本研究运用胶体金免疫层析技术,建立一种快速检测鸡传染性法氏囊病血清抗体的胶体金免疫层析方法,取得了如下成果:1.IBDV结构蛋白(VP2)基因的原核表达及表达蛋白的纯化和免疫活性鉴定携带IBDV-VP2基因的pKG-VP2表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)plys S中进行表达,并对表达条件进行优化,结果显示pKG-VP2在30℃条件下诱导6h后表达量最佳,表达物分子量约为66KDa。Western-blot证实重组蛋白具有较好的免疫学活性。经GST标签蛋白亲和层析柱纯化,我们获得高纯度的表达蛋白,浓度为1.01mg/mL,为IBDV抗体检测试纸条奠定了物质基础。2.快速检测IBD血清抗体胶体金免疫层析试纸条的研制(1)复苏和增殖抗鸡IgG Fc段杂交瘤细胞株,注射小鼠,产生腹水,通过辛酸-硫酸铵法纯化,获得了高纯度的抗鸡IgG Fc段单克隆抗体。(2)采用柠檬酸叁钠还原法,成功确立了20nm胶体金的制备条件:利用制备好的胶体金,对抗鸡IgG Fc单克隆抗体的胶体金标记条件的摸索,成功确立了最适标记条件:每ml胶体金最适添加7μL 0.1mol/L K_2CO_3和8μg抗鸡IgG Fc段单克隆抗体。(3)用胶体金标记抗鸡IgG Fc段单克隆抗体作为探针,用纯化的VP2蛋白和兔抗鼠IgG分别作为检测线试剂和质控线试剂,研制了一种快速检测IBD血清抗体试纸条,并对其特异性和敏感性进行了测试。特异性结果显示,试纸条检测IBDV阳性血清时,检测线出现明显的紫红色条带,呈阳性反应;而鸡的其它疾病阳性血清如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和SPF鸡血清、生理盐水均显示阴性反应。用琼脂凝胶扩散试验检测临床血清样品获得20份阳性样品,然后分别用试纸条和琼脂凝胶扩散试验检测这20份血清样品的效价,结果显示试纸条较琼脂凝胶扩散试验敏感8倍。3.快速检测IBD血清抗体胶体金免疫层析试纸条的临床初步应用在建立的快速检测方法的基础上,我们研制出鸡传染性法氏囊病血清抗体快速检测试剂盒。用该试剂盒检测临床采集的216份血清样品,阳性检出率为60.19%,与琼脂凝胶扩散法符合率为68.52%。
王晓丽, 王永山, 欧阳伟, 夏兴霞, 潘群兴[7]2018年在《传染性法氏囊病病毒VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法的建立》文中研究表明为建立敏感、特异、稳定的传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法,本试验以杆状病毒表达系统表达的重组IBDV-VP2结构蛋白为抗原,通过包被VP2单克隆抗体捕捉VP2结构蛋白的形式,建立鸡血清VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法(VP2-ELISA)。条件优化结果显示:单克隆抗体最适包被质量浓度为3mg/L,VP2最佳稀释度为1∶20,夹心ELISA效价1∶12.8,被捡血清的稀释度为1∶400。该方法与禽流感、鸡新城疫、鸡马立克氏病、鸡传染性喉气管炎病毒及杆状病毒阳性血清无交叉反应,对琼扩效价为1∶32的IBDV阳性血清的最低检出量为1∶12 800,ROC曲线确定的D450nm临界值为0.236,组内、组间重复性试验变异系数均小于10%。用本试验建立的VP2-ELISA方法与进口IBDV-ELISA抗体试剂盒平行检测100份背景已知的临床鸡血清样品,总符合率VP2-ELISA(97%)高于进口ELISA试剂盒(96%)。本试验为进一步研制鸡传染性法氏囊病病毒VP2结构蛋白抗体ELISA检测试剂盒奠定基础。
刘华洁[8]2015年在《传染性法氏囊病病毒高产细胞株的构建和VP3蛋白的抗原反应性分析》文中研究表明传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一种急性传染病,主要易感动物为3-6周龄雏鸡,病毒感染后主要在法氏囊内增殖。该病不但能使感染动物死亡,还能产生免疫抑制,降低感染动物抵抗力,使其受其他病毒感染的风险增加。而且IBDV易变异,动物发病之后又难以根除,加上多种禽鸟类可带毒传播,给养禽业造成重大损失。及早进行疫苗免疫接种,及时了解鸡群IBDV抗体水平是防控该病的有效手段。因此本研究旨在从两个方向对IBD的防控进行研究,一方面利用慢病毒表达系统构建过表达gga-miR-9基因的DF-EGFP-miR-9细胞并进行纯化,检测细胞内IBDV表达的效率,探究其用于病毒生产的可能;另一方面利用昆虫细胞表达系统表达IBDVVP3蛋白,并对VP3蛋白的ELISA抗原反应性进行研究,探究VP3-ELISA用于检测鸡群IBDV抗体水平的能力。实验一:过表达gga-miR-9基因的DF-1细胞株的构建及纯化为研究过表达gga-miR-9基因的DF-1细胞对病毒复制的影响,本研究利用PCR方法从鸡的基因组中扩增出pri-gga-miR-9基因,插入到慢病毒载体质粒pL-EGFP中,构建重组表达质粒pL-EGFP-miR-9,并与pC-GP、pR-Rev和pVSVG叁个包转质粒共转染293FT细胞,制备含gga-miR-9基因的重组慢病毒VL-EGFP-miR-9。将VL-EGFP-miR-9感染DF-1细胞,经杀稻瘟菌素筛选、流式细胞仪分选纯化获得过表达gga-miR-9的DF-EGFP-miR-9细胞。荧光显微镜下观察,分选后DF-EGFP-miR-9细胞形态正常,细胞荧光强度和密度显着提升。用MTT法测定并绘制细胞的生长曲线,分选后DF-EGFP-miR-9细胞生长状态与正常DF-1无差异。qRT-PCR检测细胞中gga-miR-9的表达,结果表明分选后的DF-EGFP-miR-9细胞中gga-miR-9的表达量比未分选的gga-miR-9高40倍,比正常DF-1细胞高500倍。将IBDV接种于已分选的DF-EGFP-miR-9细胞,72h后收取上清检测病毒滴度,结果显示病毒滴度(109.25 TCID50/0.1mL)高于未分选细胞(108 TCID50/0.1mL)和正常 DF-1 细胞(106.875 TCID50/0.1mL)。本实验结果表明:经流式细胞术分选的DF-EGFP-miR-9细胞能稳定过表达gga-miR-9,还能显着提高培养产生的病毒滴度。实验二:传染性法氏囊病病毒vp3基因在昆虫细胞中的表达及其ELISA抗原反应性的分析为分析传染性法氏囊病病毒(IBDV)重组VP3蛋白的ELISA抗原反应性,将IBDV vp3基因插入杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-vp3并转化大肠杆菌DH10Bac感受态细菌,经抗性筛选获得重组杆状病毒表达质粒pBac-vp3。用pBac-vp3转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒vBac-vp3。对重组杆状病毒感染的Sf9细胞用Western-blot检测,在33ku处存在一条特异的蛋白条带;用间接免疫荧光试验检测时可见特异性荧光。以纯化的重组VP3蛋白为包被抗原建立了检测IBDV抗体的间接ELISA(VP3-ELISA),并与重组VP2蛋白包被抗原建立的VP2-ELISA和全病毒抗原ELISA(IDEXX-ELISA)进行了比较。对42份不同鸡血清中IBDV抗体检测结果显示,VP3-ELISA的区分度低于VP2-ELISA和IDEXX-ELISA;VP3-ELISA 阳性检出率低于 VP2-ELISA 和 IDEXX-ELISA;VP3-ELISA 与 IDEXX-ELISA 的相关系数低于 VP2-ELISA 与 IDEXX-ELISA 的相关系数。结果表明,在昆虫细胞中表达的重组VP3蛋白具有良好的特异性和抗原反应性,用它建立的ELISA抗原反应性弱于重组VP2蛋白和IBDV全病毒抗原建立的ELISA抗原反应性。
朱彩霞[9]2009年在《鸡传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白的克隆与表达》文中研究表明传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的一种急性、高度接触性传染病,是危害世界养禽业的主要传染病之一,该病主要侵害雏鸡的中枢免疫器官―法氏囊,造成免疫抑制,给养鸡企业带来了巨大的经济损失。IBD于1957年首次在美国特拉华州甘布罗镇(Gumboro)的肉鸡群中发现,于20世纪80年代在欧洲国家首先报道有超强毒株(vvIBDV)和变异株的出现,于90年代初vvIBDV传至中国及亚洲其它国家和地区。随着变异株、超强毒株的出现,该病的发生与流行不断出现新的特点,给该病的诊断与防治带来了更多的困难,引起了人们的高度关注。近年来,IBDV的分子生物学研究己取得了较大进展,但在分子水平对鸡传染性法氏囊病病毒的免疫机理、致病机制、病毒分子结构与功能方面仍然有许多问题有待于进一步深入研究,鉴定IBDV主要结构蛋白的功能有助于揭示病毒与机体相互作用的本质,从而了解IBDV的致病机制和免疫机理;表达的主要结构蛋白为进一步制备单克隆抗体,进而研制快速诊断试剂盒以及多表位疫苗打下了基础。本研究共分叁个部分:试验一免疫鸡群中IBDV山东地方株的分离鉴定从山东地区采集已免疫过IBDV疫苗,但又表现出IBD临床症状的病鸡病料,根据病鸡发病的流行特点和临床症状,结合病毒分离、组织病理学观察、琼脂免疫扩散试验、分子生物学诊断、动物回归试验、IBDV VP2基因的序列同源性分析等结果,确定鸡场的疫情是由感染IBDV野毒引起,该分离株命名为IBDV SD株。试验二IBDV SD株主要结构蛋白VP2基因在BL21(DE3)plysS中的表达及免疫血清的制备IBDV主要结构蛋白VP2基因既是主要保护性蛋白,又与病毒的致病性相关,本研究利用RT-PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白VP2基因,并将其克隆到原核表达载体PGEX-4T-3中,获得重组质粒命名为PGEX-VP2,经PCR、酶切和序列分析鉴定表明:插入的位置、大小和读码框均正确。SDS- PAGE电泳检测表明,经重组质粒PGEX-VP2转化、诱导的受体菌E.coli BL21(DE3)plysS能表达结构蛋白VP2基因,约69KDa,表达的蛋白经纯化后免疫6周龄BALB/c小鼠,ELISA分析表明制备的抗血清效价在1:5120以上,Western blot分析表明VP2表达产物能与IBDV抗血清发生反应,具有良好的免疫原性,为单克隆抗体的制备及快速诊断试剂盒的制备奠定了基础。试验叁IBDV SD株主要结构蛋白VP3基因的克隆表达与生物学活性的鉴定为研究IBDV SD株主要结构蛋白VP3基因与致病性及免疫原性的相关性,本研究利用RT-PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白VP3基因,将其克隆到原核表达载体pET32a中,获得重组质粒,命名为pET-VP3,经PCR、酶切和序列分析鉴定表明:插入的位置、大小和读码框均正确。SDS-PAGE检测表明,经重组质粒pET-VP3转化、诱导的受体菌BL21(DE3)能表达结构蛋白VP3基因,并以包涵体形式存在,蛋白约为57KDa,经Western blot等检测表明,诱导表达的蛋白能与IBDV阳性血清发生特异性反应。通过切胶纯化蛋白,并将纯化的蛋白免疫SPF鸡,然后以点眼滴鼻的形式攻毒,结果表明:注射VP3表达蛋白的鸡能抵御IBDV强毒的攻击,说明IBDV VP3基因不但具有很好的免疫原性,而且还具有一定的免疫保护作用,为血清学诊断和下一步基因工程疫苗的制备提供了依据。
宇文延青[10]2008年在《我国部分地区传染性法氏囊病分子流行病学研究》文中研究说明本研究针对近年来我国鸡传染性法氏囊病防制过程中出现的免疫失败现象,对该病的分子流行病学进行了研究。从我国11个省(市、自治区)采集法氏囊病料68份,分离鉴定鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)21株。运用RT-PCR方法对VP2基因进行了扩增、测序、序列分析和遗传进化分析,结果表明:除SH-h株外,其余20株均具有IBDV超强毒株的分子特征,即222A、256I、294I和299S。核苷酸同源性比较表明:分离毒株与欧洲超强毒株UK661和我国超强毒株Gx株核苷酸同源率均在97.5%～99.4%;推导氨基酸同源在98.9%～100%。分离毒株间核苷酸同源率在96.7%～99.9%;推导氨基酸的同源率在98.2%～100%。以UK661为参考毒株,对分离毒株第一亲水区和第二亲水区推导氨基酸比较发现:SH-h株在222位发生A→P替换;HLJ-1、HLJ-2、HLJ-3和HLJ-4在第一亲水区的212位发生D→N替换,HLJ-3和HLJ-4株在第二亲水区321位氨基酸发生A→V替换,且血清I型IBDV均起源于同一祖先序列,所有分离毒株均位于vvIBDV进化群内。遗传距离表明:进化顺序为经典毒株、变异株,最后出现的是vvIBDV。以7株抗IBDV VP2单克隆抗体介导的间接ELISA方法对Gx、HLJ-2株和HLJ-4株3株病毒的抗原性进行分析,结果表明:HLJ-2、HLJ-4和Gx在抗原上存在着一定差异。在此基础上,用HLJ-4株和Gx株对传染性法氏囊活疫苗(Gt株)的免疫保护力进行检验,结果表明:传染性法氏囊活疫苗(Gt株)免疫SPF鸡群能抵抗超强毒株Gx和HLJ-4的攻击,SPF鸡保护率达100%。从山东、甘肃、江苏和辽宁等地的7个鸡场采集349份血清,对禽类叁种重要的能引起免疫抑制的病毒(CAV、ALV-J和REV)进行了血清学调查,结果显示:CAV的血清阳性率高达81.4%,表明CAV在我国的一些鸡场普遍存在。为进一步研究CAV感染对传染性法氏囊病疫苗的影响,将80羽1日龄SPF雏鸡随机分为5组,即Gx攻毒对照组(A组)、感染组(B组)、Gt株免疫组(C)、感染-法氏囊活株疫苗(Gt株)免疫组(D组)和空白对照组(E组),每组16羽,B组和D组在1日龄人工肌注感染病毒CAV-M9905株;7日龄,用鸡传染性法氏囊病活疫苗(Gt株)口服免疫C组和D组雏鸡;14日龄、20日龄和28日龄翅静脉采集分离血清,用ELISA试剂盒检测IBDV抗体水平,在28日龄对A、B、C和D组通过滴鼻点、点眼途径攻IBDV超强毒株Gx(ELD50=102.72/0.1ml),0.1ml/羽,攻毒后连续观察2周。结果表明:CAV感染使IBDV活疫苗(Gt株)的免疫保护率降低,抗体滴度上升缓慢。
参考文献：
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