·技术与应用·
运用18S rDNA克隆文库检测滇池硅藻种群多样性
胡蝶1，皮之云2，张志荣3，陈燕祥4，邢豫明2，4，程宝文2，4
（1.中国人民解放军陆军军医大学，重庆 400038；2.昆明医科大学，云南 昆明 650500；3.中国科学院昆明植物研究所，云南 昆明 650204；4.云南省公安厅，云南 昆明 650228）
摘 要： 目的 构建18S rDNA克隆文库检测滇池硅藻种群的多样性。方法 用硅藻18S rDNA特异性引物对滇池6个采集点水样的硅藻进行DNA扩增，构建硅藻18S rDNA克隆文库，随机挑取克隆子进行测序，通过BLAST进行序列比对，分析滇池硅藻种群分布，运用MEGA v7.0.14软件构建滇池水域硅藻18S rDNA系统发育树。结果 240个克隆子测序获得167条硅藻序列，包括冠盘藻属、等片藻属、直链藻属等11个硅藻种属，6个采集点间硅藻种群分布存在一定差异。结论 滇池硅藻种群分布具有一定特征，硅藻18S rDNA序列分析对法医学溺死地点推断有一定参考价值。
关键词： 法医病理学；法医遗传学；硅藻；溺死；18S rDNA；滇池
硅藻因其细胞壁由不易被破坏的含水硅酸盐构成，在溺水过程中，硅藻可随溺液吸入肺组织并通过血液循环播散至其他组织器官中，因此硅藻检验在法医学溺死诊断中具有重要的意义[1-4]。滇池是云南省最大的淡水湖泊，目前对滇池水域硅藻种群的研究报道较少，主要采用光学显微镜或扫描电镜下形态学特征进行种属鉴定与分类[5-7]。本研究应用分子生物学方法对滇池水域硅藻种群分布进行初步研究，以期为当地溺死的法医学鉴定提供参考以及为滇池水域的生物多样性研究提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 样品采集
2017年3月22日在滇池6个水样采集点［草海1个（图1A）、外海5个（图1B～F）］水面下0.1～0.5m处采集6份水样，各500mL，静置过夜，弃250mL上层水样，于4℃保存备用。
图1 滇池水样采集点分布
A：海埂北侧的草海；B：海埂南侧的外海；C：观音山；D：东大河湿地公园；E：捞鱼河湿地公园；F：海东湿地公园。
1.2 总DNA制备
各取2 mL水样置于微量离心管中，以离心半径10cm，12000r/min，离心20min，弃上清液，再加入水样离心，弃上清液，反复6次，管底得到沉淀物。沉淀物用PowerSoil® DNA Isolation试剂盒（美国Mobio公司）提取DNA，操作步骤按试剂盒说明书进行。
1.3 PCR扩增
采用Primer Premier 5.0软件（美国Premier Biosoft公司）设计硅藻18S rDNA特异性引物605F：5′-CTGCGAACGCTCATTAT-3′；605R：5′-AGGCCCGG CATTGTTATT-3′。PCR反应总体积为20μL：去离子水 12.3 μL，10×PCR 缓冲液 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L正反引物各0.2 μL，Taq DNA聚合酶0.3μL，DNA模板1μL。反应条件：95℃ 3min；94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 5 min。扩增产物用Good ViewTM核酸染料（北京赛百盛基因技术有限公司）染色，通过2%琼脂糖凝胶电泳显带，数据用相机拍照固定。
1.4 克隆文库构建
PCR产物用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］纯化，纯化产物运用pLB零背景快速连接试剂盒［VT205，天根生化科技（北京）有限公司］克隆。随机挑取阳性菌斑直接进行载体引物PCR扩增检测，阳性扩增产物用Product Pre-Sequencing试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）纯化。纯化体系：虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）1.5μL，Exo-1 0.15μL，去离子水1.35 μL，扩增产物5 μL。反应条件：37℃ 60 min，85℃ 15min。测序反应体系：去离子水4μL，测序缓冲液 1 μL，测序反应试剂 0.3 μL，10 μmol/L 载体正向引物 0.25 μL，DNA 模板 0.5 μL。测序反应条件：95℃ 30 s；96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 3 min；32个循环。测序产物用葡聚糖凝胶G-50（中DNA级，美国GE Healthcare公司）纯化，3500基因分析仪（美国AB公司）测序。
1.5 系统发育树构建
6个硅藻18S rDNA克隆文库各挑取40个克隆子载体引物扩增测序，共获得196个DNA序列（表1），通过BLAST比对，196个序列中有167个硅藻序列，包括冠盘藻属、等片藻属、直链藻属、菱形藻属、小环藻属、海链藻属、脆杆藻属、舟形藻属、异极藻属、曲壳藻属、楔形藻属11个硅藻种属（表2）。
采用PowerSoil®DNA Isolation试剂盒分别提取6份水样硅藻的DNA，并运用滇池硅藻18S rDNA特异性引物605F和605R进行PCR扩增得到预期目标片段，片段大小约400bp（图2）。
196个序列中有20个为金藻序列（表3），包括囊胞藻属、鱼鳞藻属、棕鞭藻属、黄群藻属，其余9个序列主要包括细菌、真菌等。
2 结 果
2.1 DNA扩增结果
如:3CO2↑,因反应生成了Al(OH)3沉淀和CO2气体,两种生成物都离开了反应的体系,相当于降低了生成物的浓度,致使反应可以进行到底。是不是所有水解呈碱性的离子和水解呈酸性的离子都不能大量共存呢?其实并不都是这样,如就可以和大量共存,虽然两者也可以相互促进水解发生如下反应:
图2 滇池6个水样采集点硅藻18S rDNA扩增结果
A：海埂北侧的草海；B：海埂南侧的外海；C：观音山；D：东大河湿地公园；E：捞鱼河湿地公园；F：海东湿地公园。
2.2 滇池硅藻种群多样性
扩增序列通过BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对以确定序列种属，运用MEGA v7.0.14软件（分子进化遗传学研究所，Institute of Molecular Evolutionary Genetics）以距离矩阵邻接法构建滇池水域硅藻18S rDNA系统发育树。
本研究所获得的11类硅藻18S rDNA序列和4类金藻18S rDNA序列通过BLAST进行相似性比对，部分序列与硅藻18S rDNA序列具有较高同源性，将相似性较高的序列作为标准序列，利用MEGA v7.0.14软件采用邻接法聚类分析[8]构建系统发育树，结果显示，滇池水域所检出的硅藻与金藻关系较近。
6个采集点间检出硅藻种群数量不一致，海埂北侧的草海水样检出冠盘藻、小环藻、海链藻、舟形藻、菱形藻、脆杆藻6类硅藻，海埂南侧的外海水样检出冠盘藻、小环藻、菱形藻、等片藻、直链藻5类硅藻，观音山水样检出冠盘藻、菱形藻2类硅藻，东大河湿地公园水样检出冠盘藻、小环藻、海链藻、菱形藻、曲壳藻5类硅藻，捞鱼河湿地公园水样检出冠盘藻、小环藻、海链藻、舟形藻、菱形藻、等片藻、异极藻7类硅藻，海东湿地公园水样检出小环藻、直链藻、楔形藻3类硅藻。
与分级分块的课程体系相呼应，教研室组织编写一套符合我院实际的大学物理教材，既保留普通物理的经典知识，又精选例题贴近学校的专业特色，在教材的后半部精心设计若干物理专题，从当今物理发展前沿和物理与其他专业学科的交叉领域精心选题，在物理教学的第二个学期，改变传统课堂讲授而代之以类似学术报告的形式进行教学，选择贴近学生专业的物理专题，适当增加固体物理、半导体物理、纳米科技、量子理论等方面的内容，让学生体会到物理与前沿科技、各专业工程实践之间的联系，激发学生学习的主动性和积极性[3]。
表1 各水样的测序情况 （个）
表2 各水样硅藻种属和数量 （个）
表3 各水样金藻种属和数量 （个）
2.3 滇池水域硅藻、金藻18S rDNA系统发育树
双端预制光缆指光缆的两端均采用预制接口，现场施工免熔接，可实现光缆连接“即插即用”，但由于双端预制光缆长度现场无法调节，因此对于光缆长度的精确度要求很高。对于双端均不具备良好熔接环境的预制光缆，建议采用双端预制光缆。
3 讨 论
硅藻广泛分布于海洋、淡水或陆地湿润土壤中，种类繁多，大小不一，从几微米至数毫米，且形态各异[9]。传统的硅藻分类研究是借助显微镜观察硅藻的形态学特征鉴定种属，这就需要研究人员具有非常丰富的分类学经验，且工作量大，耗时长，结果易受人为主观因素干扰，检测标准化难度较大[10]。有文献[6-7]报道用传统方法对滇池浮游生物进行多样性监测，滇池硅藻有小环藻属、冠盘藻属、直链藻属、脆杆藻属、平板藻属、针杆藻属、等片藻属、舟形藻属、羽纹藻属、异极藻属、菱形藻属11个属。本研究运用分子技术从硅藻18S rDNA序列的分析对滇池水域硅藻进行鉴定和分类，检出冠盘藻属、等片藻属、直链藻属、菱形藻属、小环藻属、海链藻属、脆杆藻属、舟形藻属、异极藻属、曲壳藻属、楔形藻属11个属。但未检出传统方法可检出的平板藻、针杆藻、羽纹藻3类硅藻，却检出海链藻、曲壳藻和楔形藻。其原因可能与以下4个方面有关：（1）采样时间不同，滇池水质状况不同，硅藻种群结构会有所差异；（2）与本研究所用引物的敏感性和偏好性有关；（3）本研究所检测的硅藻18S rDNA序列分辨率有限；（4）传统方法具有一定的局限性。因此，本研究结果是对以往研究的验证与补充，使得滇池水域硅藻种群数据更加完善。
滇池6个采集点间硅藻种群结构存在差异，首先，草海检出6类硅藻，外海检出10类硅藻，只有草海检出脆杆藻，外海的5个采集点水样均未检出脆杆藻。海埂两侧水域的硅藻群落有明显差异，草海与外海之间有一航道相通，航道最南端修有人工闸门限制湖水流通是形成海埂两侧水域硅藻群落差异的主要原因，其次是草海底泥清淤相对较为彻底，湖滨湿地修复效果较好，形成了良好的湖滨湿地生态系统，水质较前有所好转[7，11]。滇池外海硅藻种群丰富，包括除脆杆藻之外的10类硅藻。东西两岸采水点水域硅藻种群结构差异明显，西岸观音山水域硅藻种群结构最为单一；东岸的捞鱼河湿地公园水域的硅藻种群结构最为丰富。外海东岸的捞鱼河湿地公园水域与海东湿地公园水域间也有一定的差异，海东湿地公园水域硅藻种群相对单一。外海面积较大，湖流缓慢，湖面常年以西南风为主，外海北岸蓝藻堆积，水质较差[11]，硅藻种群相对单一，东岸沿线湖滨湿地生态系统的建设较完善，光照充足，西南边出水口通畅，硅藻种群相对丰富。不同水域的硅藻种群差异对于法医学溺水地点的推断具有一定的意义。
滇池面积广阔，本研究的水样采集点未能涉及湖泊中央区域以及季节交替所致种群差异，如果建立滇池水域硅藻种群数据库，还需进一步扩大取样范围以及更深入地研究分析积累数据，才能更全面、准确地反映出滇池水域的硅藻分布情况。
我国的产融结合呈现三大特点：一是结合方向单向性，因现行金融法规限制，我国都是产业资本向金融资本单向流动；二是结合方式多样性，受各地市场发展不平衡、企业发展阶段不一致影响，我国从初级的产融结合到系统的金融控股公司均存在；三是运作主体规范性，我国几乎是大型企业、龙头企业、优势企业先行开展产融结合业务。
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Application of 18S rDNA Clone Library to Detect Diatom Population Diversity in Dianchi
HU Die1,PI Zhi-yun2,ZHANG Zhi-rong3,CHEN Yan-xiang4,XING Yu-ming2,4,CHENG Bao-wen2,4
（1.Army Medical University,Chongqing 400038,China；2.Kunming Medical University,Kunming 650500,China；3.Kunming Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Kunming 650204,China；4.Yunnan Provincial Public Security Department,Kunming 650228,China）
Abstract： Objective To detect the diatom population diversity in Dianchi by constructing a 18S rDNA clone library.Methods DNA from diatoms in 6 water samples of Dianchi was amplified with diatom 18S rDNA specific primer.The 18S rDNA clone library was constructed,and clones were randomly selected for sequence.Sequence alignment was performed by BLAST.The diatom population distribution in Dianchi was analyzed and the phylogenetic tree of diatom 18S rDNA in Dianchi waters was established with the MEGA v7.0.14 software.Results Two hundred and forty clones were sequenced,with 167 diatom sequences obtained,including 11 diatom species such as Stephanodiscus,Diatoma,and Melosira.There were certain differences in diatom population distribution among the 6 samples.Conclusion The population distribution of diatom species in Dianchi shows unique features and the sequence analysis of diatom 18S rDNA has a certain reference value to the inference of forensic drowning sites.
Keywords： forensic pathology；forensic genetics；diatom；drowning；18S rDNA；Dianchi
中图分类号： DF795.1
文献标志码： A
doi： 10.12116/j.issn.1004-5619.2019.04.013
文章编号： 1004-5619（2019）04-0444-04
作者简介： 胡蝶（1987—），女，硕士研究生，主要从事法医病理学研究；E-mail：532726a00qg.cdb@sina.cn
通信作者： 程宝文，男，博士，主任法医师，硕士研究生导师，主要从事法医物证学、群体遗传学研究；E-mail：ggcbw@vip.sina.com
（收稿日期 ：2017-09-28）
（本文编辑：张建华）
标签：法医病理学论文; 法医遗传学论文; 硅藻论文; 溺死论文; 18S论文; rDNA论文; 滇池论文; 中国人民解放军陆军军医大学论文; 昆明医科大学论文; 中国科学院昆明植物研究所论文; 云南省公安厅论文;