赵智君[1]2010年在《藻酸钙复合自体软骨细胞修复兔关节软骨缺损实验研究》文中提出目的通过藻酸钙复合自体软骨细胞移植修复兔膝关节关节软骨缺损,观察缺损近期修复情况。方法1.取34-37周新西兰大白兔左膝关节软骨,酶消化后得到高纯度软骨细胞体外单层培养。2.将体外培养软骨细胞行台盼蓝活性检测,传代扩增,并对其形态学进行观察,绘制细胞生长曲线。在第叁代软骨细胞爬片后,行Mallory染色、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化以鉴定软骨细胞；3.分析纯低粘度藻酸钠(sigama公司)溶于NaCl的溶液中制备藻酸钠凝胶,并滴入CaCl2溶液中交联形成空白藻酸钙凝珠,行大体观察及HE染色观察。4.藻酸钠凝胶与消化后第叁代软骨细胞混合后制成细胞凝胶悬液滴入CaCl2溶液中交联形成藻酸钙-软骨细胞凝珠后,置于高糖DMEM完全培养液中行叁维培养4周。5.将培养4周后的藻酸钙-软骨细胞凝珠行大体形态观察,倒置相差显微镜下观察,苏木素-伊红(HE)染色,及Ⅱ型胶原免疫组化染色观察。6.制作兔膝关节软骨缺损模型,分为3组,实验组植入自体软骨细胞—载体复合物,实验对照组植入单一培养基浸泡的藻酸钙凝珠,空白对照组不植入任何材料,单一缺损模型。各组术后分别于第8周、第12周取材行大体观察、HE染色、和Ⅱ型胶原免疫组化染色观察,并用Wakitani法进行组织学评分。结果1.(1)前叁代软骨细胞生长增殖迅速,形态呈多边形,短梭形,叁角形,融合时呈铺路石状卵圆形,相反四代以后的软骨细胞形态不规则,呈长梭形,第六代软骨细胞类似成纤维细胞。(2)第叁代软骨细胞Mallory、甲苯胺兰异染反应及Ⅱ型胶原免疫组化强阳性。2.(1)空白藻酸钙载体及藻酸钙-软骨细胞凝珠HE染色可见凝珠内部呈丝网状,空隙比较均匀,具有良好的空间结构,细胞在凝珠孔隙内呈圆形或梭形均匀分布,生长良好；(2)藻酸钙-软骨细胞复合物Ⅱ型胶原免疫组化染色可见细胞胞浆及细胞周围大量Ⅱ型胶原表达。3.动物模型术后第8、12周时,实验组缺损为透明软骨样修复,实验对照组为纤维软骨样修复,空白对照组为纤维性修复。在同一时间点,实验组修复效果优于实验对照组。其中Wakitani组织学评分结果显示实验组与实验对照组有显着差异,且两组均优于空白对照组,同时各组第12周评分结果均优于第8周。结论1第叁代自体软骨细胞可以作为软骨组织工程移植用的种子细胞,软骨细胞在藻酸钙载体内的叁维培养有助于维持软骨细胞形态及表型。2藻酸钙-自体软骨细胞复合物对关节软骨缺损有修复作用,修复效果优于支架对照组,差异有统计学意义,且两组结果均优于空白对照组。
刘松波[2]2001年在《藻酸钙载体制备及复合软骨细胞修复关节软骨缺损的研究》文中指出关节软骨损伤后有限的自身修复能力及其对人体功能的严重影响，使其成为骨科基础和临床研究中的热点和难点课题。近十几年来，组织工程方法为软骨修复提供了新的途径，并已取得了一定进展，但仍有很多问题亟待解决。本课题就是根据这种需求，在软骨细胞培养的基础上，制备柱形藻酸钙载体并复合兔关节软骨细胞进行体外培养、体内异位成软骨及修复兔膝关节软骨缺损的实验研究，为软骨组织工程的进一步研究提供实验依据。 1．兔关节软骨细胞体外培养 目的：掌握细胞培养方法，观察兔关节软骨细胞体外生长情况，为组织工程软骨的研究提供种子细胞和相关技术支持。方法：酶消化法分离幼兔关节软骨细胞，进行原代及传代培养，观察细胞形态变化及体外生长增殖情况。结果：原代细胞经培养3天后进入对数生长期，6代之内细胞形态及功能良好，以3～5代细胞生长活力最为旺盛。未经传代连续培养3wk的细胞，形态趋向于成纤维细胞，但胞外基质分泌明显，甲苯胺蓝染色阳性。结论：兔关节软骨细胞增殖快，生长稳定，可作为软骨组织工程的种子细胞。 2．藻酸钙柱形载体的制备及复合细胞前后的结构观察 目的：制备新型细胞载体，为组织工程研究提供材料支持。方法：藻酸钠溶液与葡萄糖酸钙溶液以不同比例混合均匀，置特殊模具中，经冷冻、脱水等 第四罕医大学博士学位 文 处圳获得杜形藻酸钙载体村料。以其复合兔片竹软忖驯胞，斤对衬本IV介汕胞 前后的结构进行纵织学和扫描电镜观察。结果：藻酸钙具何厂放0W网抢状g．‘巾J， 网眼呛上1！。＂j见人小小等的微几，网！IR中IIJ吸咐·定贝JIu兔片u软刀邻fi地。f．’i 论：经初步观察，藻酸钙DZ形材料可试用作兔关曹软骨驯胞的8划个，Q介则胞 进行软骨组织＿卜程的研究。 3．藻酸钙－软骨细胞复合物植入兔背肌成软骨的实验研究 R的：通过观察关节软骨纲胞复合干载体后莉下州叼J物休内刑）十卜］的州 及成软骨惰况，为组织丁程方法修复关节软骨缺损的研究捉供进 步的实验伙 排。方法：将藻酸钙载体复合兔关节软骨细胞，手术植入兔背剖汕KQ内，汁训 厂术后 ZWk、4Wb 时取材进行组织学观察。结果：软骨绷胞n｛FjJ种动物f个内进 ·步’卜长增殖，4W卜卜1可见新生软骨织织形成。结论：藻酸例－－软们哪！胞V介物 Illl‘异体动物休内形成软骨组织，可川厂软骨织织卜程的研4乙 4．藻酸钙载体复合软骨细胞修复兔关节软骨缺损 目的：观察藻酸钙－软骨细胞复合物在兔股骨滑车关节币i个层软竹缺损修 复中的作用。方法：新西兰白兔共26只，取其中以）只，】’骸股关V们股竹附 车面造成直径0．3cm的全厚层关节软骨缺损，人侧为藻酸钙复合软什圳胞川， 植入藻酸钙－软骨细胞细胞复合物，右侧为单纯藻酸钙纠，枪入＜丫I藻刑叭5划A、 作为对照。另外6只，缺损处不加任何处理，作为标准宁门组。术们4wk、Hwk、 12Wb、24Wb、28Wb分别取材行组织学观察。结果：藻酸钙复合软骨绷胞纲形成 软骨组织修复：单纯藻酸钙组获得部分纤维性修复，完全空白织没行修复，缺 损底部方少V纤雏红织，医骁组
郭全义[3]2006年在《自体软骨细胞—藻酸钙复合物修复羊膝关节负重区全层软骨缺损的实验研究》文中研究表明研究背景:虽然骨科基础、临床研究有了很大的进步和发展,但是关节软骨损伤的治疗仍然是一个难以解决的问题。众所周知,部分软骨损伤不能自行修复,而全层骨软骨损伤能够由纤维软骨修复,但是这种修复组织缺乏正常软骨组织所具有的生物学、生物化学、和生物力学特性,因此在关节活动过程中,压力的刺激下,很容易退变。为此,各种各样的手术(如转孔术、关节成形术、微骨折等),被应用于临床,试图刺激骨髓干细胞,产生具有接近透明软骨特性的软骨来修复软骨缺损,但事实证明,这些修复组织在压力刺激下很快发生退变。本研究试图以接近人类膝关节解剖结构的中国山羊为动物模型,研究它的软骨细胞在体外分离、培养、快速扩增的方法;在藻酸钙培养中的特性;观察自体软骨细胞复合藻酸钙修复山羊膝关节负重区软骨缺损的结果,以及修复过程中CPM(continuous passive motion,持续被动活动仪)对修复结果的影响。 方法:(1)取肩关节软骨组织,体外分离、培养软骨细胞、对培养的软骨细胞进行蕃红“O”、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化染色等表型鉴定。(2)将鉴定证实为具有正常表型的软骨细胞和cyteodex-3放入RCCS(rotary cell culture system,旋转细胞培养系统)培养,和单层培养做对比,观察微载体表面细胞的生长情况,用DNA的变化定量,观察两种培养方式细胞扩增的情况,并对RCCS培养的软骨细胞进行表型鉴定。(3)将鉴定证实为具有正常表型的软骨细胞和藻酸钙凝胶复合,观察藻酸钙凝胶内细胞的生长情况,用荧光分光光度计和紫外分光光度计观察DNA及GAG的量的变化,同时对藻酸钙凝胶培养的软骨细胞进行表型鉴定。(4)收集经藻酸钙培养的软骨细胞和基质,体外培养组织工程化软骨并对其进行组织学和免疫组化鉴定。(5)于山羊股骨髁负重面行直径6mm全层软骨缺损,分别以空白(缺损内未植入任何组织);骨膜覆盖;藻酸钙凝胶填充缺损+骨膜覆盖;复合自体软骨细胞
扶晓明[4]2012年在《BMSCs-庆大霉素—藻酸钙叁维缓释微球修复兔膝关节软骨缺损的实验研究》文中进行了进一步梳理科技发展，社会进步，人们生活质量和平均寿命不断提高，人类已经步入老龄化社会。老龄化社会给我们带来一系列的挑战，其中，关节软骨的磨损、退变，甚至关节软骨的剥脱、缺损，是运动医学亟待解决的热点问题。此外，工业革命使我们的生活更趋便捷，各种交通事故等高能量损伤也日益增加，临床中常见到膝髋等关节软骨大面积缺损，甚至合并开放性损伤，给关节外科带来发展的机遇。关节软骨存在先天不足，其不受神经支配，缺乏血液供应，软骨细胞自身增殖能力很低，以致损伤软骨的自身修复能力非常有限；一旦关节软骨损伤，难以自行修复；此外，关节软骨生存在一个相对封闭的关节腔内，主要靠滑膜维持关节腔内环境的稳定，受外周循环的影响极低；一旦污染，难以快速清除。对于关节疾病，常需要更大剂量更长疗程的全身应用抗生素等药物，疗效不确切的同时药物副作用成为最大威胁；虽然关节腔内注射抗生素等药物能提高局部药物浓度，减少静脉给药的副作用，但是常需要反复穿刺和严格无菌操作，有潜在关节腔内感染的高风险，因此，关节软骨损伤在修复过程中难以维持自身微环境的稳定和自我修复，若合并关节感染更是灾难性病症！本课题通过体外构建BMSCs-庆大霉素-藻酸钙叁维缓释微球培养体系，了解该缓释微球的药物缓释情况，观察庆大霉素对BMSCs软骨细胞分化的影响；并建立动物模型验证该缓释微球修复软骨的短期效果，为临床开放性软骨缺损，或伴关节内感染的修复研究建立实验基础。目的1．掌握体外BMSCs-庆大霉素-藻酸钙叁维缓释微球构建的技术；掌握建立关节软骨缺损的动物模型和自体骨膜覆盖组织工程软骨移植修复技术。2．观察庆大霉素在体外叁维缓释微球中的释放情况；及其对BMSCs软骨分化的影响。3．在兔膝关节软骨缺损模型中，植入BMSCs-庆大霉素-藻酸钙叁维缓释微球，观察其对关节软骨缺损的短期修复效果。4．为开放性或感染性软骨缺损的修复提供实验基础，为进一的步临床软骨修复提供基础性研究。方法1．BMSCs的来源严格无菌条件下，自四周龄新西兰兔的髂后上嵴各抽取骨髓1-1.5ml，采用密度梯度离心法并结合贴壁筛选法分离、纯化BMSCs，并进行体外平面培养扩增，对细胞表型、纯度进行鉴定。2．制备庆大霉素-藻酸钙叁维缓释微球准确称取3.0g庆大霉素，溶于10ml双蒸水中，在酸碱测试仪上，用4mol/L氢氧化钠液滴定溶液的PH值至7.4，依次加入10μl的HEPES缓冲液、0.0875g的氯化钠、叁倍标准浓度藻酸钠液20ml，即配制成含庆大霉素3.0的庆大霉素-藻酸钠凝胶30ml，其中藻酸钠为二倍标准浓度；抽取不同组别藻酸钠凝胶10ml，滴到装有氯化钙溶液40ml、5mmol/L的HEPES缓冲液，PH为7.4的培养皿中，凝珠聚化呈乳白色或透明淡黄色。将装有检测样本的透析袋放置在已加入100ml0.9%氯化钠溶液的密闭容器中，置于摇床，设定各个时间段，精确抽取10ml浸泡液作为检测样品，取样送金黄色葡萄球菌抑菌检测，计算凝珠的包封率、药物释放率，并立即向容器中补加0.9%氯化钠液10ml，始终保持容积不变。3．BMSCs-庆大霉素-藻酸钙叁维缓释凝珠的构建精确称取3.0g庆大霉素，溶解于10ml的双蒸水中；在酸碱度测试仪上，用4mol/L氢氧化钠滴定至溶液PH值至7.4，加入HEPES缓冲液10μl，0.0875g氯化钠，搅拌使其混匀；再加入叁倍标准浓度的藻酸钠液20ml，即配制成含庆大霉素3.0g的庆大藻酸钠凝胶30ml。取0.5ml兔第二代BMSCs悬液，滴入2ml的庆大霉素-藻酸钠凝胶，充分混匀后，即成BMSCs-庆大霉素-藻酸钠凝胶。与BMSCs-藻酸钙叁维凝珠培养进行比较。观察BMSCs的形态、生长增殖及其表型变化。4．叁维缓释微球的移植将BMSCs-庆大霉素-藻酸钙凝珠填塞在兔膝关节软骨缺损处，采用自体同侧胫骨上段内侧骨膜缝合固定。5．建立兔膝关节软骨缺损模型和实验分组选12只健康新西兰兔，用直径5mm钻头钻直径为5.0mm的全层软骨缺损创面，深度约5mm。分成实验组（BMSCs-庆大霉素-藻酸钙叁维缓释微球移植组）；实验对照组（BMSCs–藻酸钙叁维微球移植组）；单纯骨膜覆盖组；空白对照组（不做任何处理）共四组。术后12周处理实验动物，切取实验侧股骨髁以远骨质，对软骨缺损处修复组织进行大体和光镜观察，对组织切片行HE染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果1．传代的BMSCs贴壁能力很强，经体外平面扩增的细胞大小、形态相似，多呈纺锤形或短梭形；免疫组织化学检测结果显示：第1-3代BMSCs不表达CD34，而表达CD44、CD105；Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阴性，提示是未分化的BMSCs。2．本实验中使用金黄色葡萄球菌菌株及培养皿均是按标准严格控制，所得结果具有明显的可比性，为实验的准确性提供肯定性依据。各组庆大霉素-藻酸钙缓释微球在30天的检测期内均能到达金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）>2μg/ml，其中，U组庆大霉素的包封率较高，30天释放庆大霉素的累计释放总量较大。3．在BMSCs-庆大霉素-藻酸盐叁维缓释微球中，BMSCs的生物学活性表现良好。大体观察和倒置显微镜观察结果均显示，BMSCs生长状态较好，生长曲线比较正常；叁维缓释微球培育2周后，Ⅱ型胶原染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性，为软骨细胞表型。这与BMSCs-藻酸钙叁维微球的培育结果一致。4．成功建立兔膝关节股骨髁关节面软骨缺损的动物模型。12只健康新西兰兔术后12周均成活。实验组软骨缺损面由乳白色组织填充，与周边组织色泽相近，界限清晰，无明显间隙。组织切片可见两侧都与周围软骨组织愈合，未见载体材料的残留，细胞呈圆形，周围已形成软骨陷窝；但细胞数目明显多于正常组织，且排列紊乱。Ⅱ型胶原抗体免疫组化染色为阳性；实验对照组与实验组结果一样；单纯骨膜覆盖组修复组织呈白色，表面凹陷，与周围组织境界清晰，细胞呈成纤维细胞样改变，表面粗糙凹陷，与周围组织愈合差，底部少量骨组织形成。Ⅱ型胶原免疫组化染色阴性；空白对照组缺损区明显凹陷，底部可见粉红色肉芽组织增生，未见明显软骨组织充填。结论1．BMSCs存在于骨髓组织，取材方便，细胞贴壁能力很强，通过密度梯度离心法，并结合贴壁筛选法，分离、纯化兔骨髓间充质干细胞。经检测，CD44、CD105抗体免疫组化染色均呈阳性，Ⅱ型胶原抗体免疫组化染色呈现阴性，这些生物学特征与BMSCs一致。通过该混合方法能成功获取更高纯度、未分化的BMSCs。2．藻酸钙缓释微球是良好的抗生素缓释载体，叁组庆大霉素藻酸钙缓释微球，在大部分30天各检测时间段中，庆大霉素的释放浓度都高于金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（2μg/ml）。含10%庆大霉素的U组缓释微球具有相对最好的包封率和最大的药物释放量，与庆大霉素骨水泥相似，是BMSCs-庆大霉素-藻酸钙叁维缓释凝珠的最佳叁维载体支架。由于该支架的组织降解性，庆大霉素的早期释放情况比抗生素骨水泥好。3．在庆大霉素缓慢释放的状态下，BMSCs-庆大霉素-藻酸钙叁维缓释微球使BMSCs保持较好的生物学形态，生长增殖正常，培养至第7-21天，BMSCs增殖最明显，最后分化为软骨细胞；Ⅱ型胶原抗体免疫组化和甲苯胺蓝染色结果均呈阳性改变，且与BMSCs-藻酸钙叁维微球培育结果一致。该叁维微球体外培育具有良好的组织相容性，能达到BMSCs软骨化的需要。4．在体内，BMSCs-庆大霉素-藻酸钙叁维缓释微球移植组和BMSCs-藻酸钙叁维微球移植组能得到相同的软骨缺损修复效果。进而说明，在体内复杂的环境下，BMSCs-庆大霉素-藻酸钙叁维缓释凝珠的各成分之间具有良好的组织相容性，能给BMSCs的增殖和其向软骨细胞的分化提供良好的内在微环境；藻酸钙具有良好的可降解性，无任何残留。体外培养的BMSCs-庆大霉素-藻酸钙叁维缓释凝珠，对关节软骨损伤动物模型的短期修复效果良好。
吴迪, 赵智君, 朱晓松, 杨浩, 李青[5]2010年在《藻酸钙凝珠复合自体软骨细胞修复成年兔关节软骨缺损》文中指出背景:软骨缺损的修复一直是骨科界的难题之一,近几年发展起来的应用组织工程学技术修复软骨缺损的方法,逐渐被认为是一种有希望治疗关节软骨缺损的手段。目的:应用藻酸钙凝珠-自体软骨细胞移植修复兔膝关节软骨缺损,观察损伤近期修复情况。方法:成年新西兰大白兔30只,左膝取软骨细胞,右膝造模。采用体外培养后的第3代自体软骨细胞复合海藻酸钠凝胶,混入CaCl2溶液中制成串珠状凝珠,体外培养4周。实验组植入海藻酸钙凝珠-自体软骨细胞复合物,对照组植入不含细胞的海藻酸钙凝珠,空白组不做任何处理。结果与结论:纳入新西兰大白兔30只,除其中1只术后单侧膝关节僵硬强直外,其余均未见手术后关节活动障碍,所有动物术后无感染,无死亡。苏木精-伊红染色可见,实验组修复组织以透明软骨为主,对照组以纤维软骨修复为主,空白组修复不明显,以纤维软组织修复为主。免疫组织化学染色可见实验组修复组织以表达Ⅱ型胶原为主,对照组Ⅱ型胶原免疫组化着色较淡,Ⅱ型胶原表达量少。空白组修复组织不表达Ⅱ型胶原。结果提示藻酸钙凝珠-自体软骨细胞修复软骨缺损有较好效果,表明自体软骨细胞复合藻酸钙凝珠能为软骨组织工程提供一种很好的思路。
于灏[6]2007年在《自体骨髓间充质干细胞藻酸钙载体复合物对兔膝关节软骨缺损修复影响的实验研究》文中研究指明目的软骨组织多处于人体骨骼的重要部位，其缺损修复一直为临床急待解决的难题，用组织工程方法修复关节软骨缺损是近年来正在研究的新途径。其中无论是软骨细胞或干细胞与载体材料制成复合物抑或MSCs经体外诱导培养成软骨后与支架材料制成复合物再植入缺损，几乎均着重体外培养条件的研究，而忽略了对于改善局部微环境的探讨。为此，本实验试图在载体复合物植入软骨缺损微环境内时，增加能促进MSCs分裂、增殖、分化及血管新生的bFGF及参与并促进成软骨细胞合成软骨基质及纤维的维生素C等，从而达到提高软骨缺损修复疗效的目的。实验方法从24只3月龄新西兰大耳白兔髂骨处抽取骨髓，以密度梯度离心法分离出骨髓间充质干细胞(MSCs)作为种子细胞进行扩增培养至第叁代，制成细胞悬液，而后在自制模具中与藻酸钙制备成与兔膝关节软骨全层缺损(直径4mm、深度4mm)相一致的载体复合物同时加入bFGF和维生素C，将该载体复合物植入兔左膝关节软骨全层缺损处作为A组，而右膝关节的关节软骨全层缺损处则植入MSCs与藻酸钙的载体复合物作为B组。另取兔6只，左膝按上述方法作一缺损植入单纯藻酸钙载体作为C组；右膝缺损则作空白对照D组。待术后不同时间点(30天、60天及90天)取材，常规石蜡包埋后制成切片，分别用于HE、Masson、番红O、透射电镜、免疫组化等指标以观察软骨缺损修复效果。实验结果A、B、C叁组软骨缺损均被透明软骨和纤维组织充填，只是A组的透明软骨组织较B组多，C组最少。随植入时间后移，A组几乎均被透明软骨样组织填平并且充填组织与周边正常关节软骨的交界逐渐分辨不出，并与深层软骨下骨相连接，软骨细胞间质的胶原纤维从表层向深层呈放射状排列于软骨细胞基质中。而B组的缺损处表面尚有较多的纤维组织且充填组织与周边正常关节软骨的分界较A组清晰，C组缺损处表面可见有较多纤维组织和未降解的藻酸钙，与周边正常关节软骨分界较A、B组清晰。A组填充的软骨细胞具有明显陷窝的，互相距离较远的3-5个细胞排列呈柱状的成熟软骨细胞明显较B组多，C组则很难观察到成行排列的软骨细胞。功能旺盛的软骨细胞(Ⅱ型胶原阳性细胞，胞质粗面内质网扩张等)则属A组最多，C组最少。D组术后90天时缺损处为大量纤维组织填充且与周边正常关节软骨和软骨下骨整合较差。结论用自体MSC藻酸钙载体复合物植入膝关节软骨缺损同时向该缺损微环境内加bFGF和维生素C有利于软骨修复，能提高软骨缺损修复效果。
沈锋[7]2011年在《构建BMSCs-庆大霉素—藻酸钙叁维缓释微球的实验研究》文中研究指明随着医学科学发展,人们对生活质量期望值的提高,关节感染是许多关节外科医生亟需解决的问题,特别是严重的关节感染,同时合并有大量的关节软骨损伤或是大面积软骨剥脱伤。关节感染以及软骨损伤修复的难度在于:关节腔是存在极低循环的密闭腔室,全身应用抗生素的血药浓度对于关节腔内细菌的作用是微乎其微,局部注射抗生素也存在导致外源性感染的可能性以及细菌耐药,反复的注射疼痛也让病人望而生畏;由于关节软骨具有无神经支配、缺乏血液供应、软骨细胞增殖迁移能力低等组织学特点,关节软骨自身修复能力非常有限。关节面软骨组织损伤后之所以难以自行修复,是因为软骨细胞在体内缺乏增殖能力。因此本课题通过构建BMSCs–庆大霉素-藻酸盐叁维共培养体系,通过大体观察,H-E染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原染色、微生物法等检测方法,了解叁维凝珠庆大霉素的缓释情况,观察BMSCs的细胞形态、增殖能力及表型的变化,以及庆大霉素对BMSCs细胞和软骨细胞增殖及分化的影响。目的:构建BMSCs–庆大霉素-藻酸盐叁维共培养体系,检测叁维缓释凝珠庆大霉素的释放情况,观察BMSCs的细胞形态、增殖能力及表型的变化,以及庆大霉素对BMSCs细胞和软骨细胞增殖及分化的影响。方法:1、采用贴壁筛选法从兔骨髓组织中分离、纯化BMSCs,进行体外平面培养扩增,应用H-E染色、免疫组化CD34、CD44、CD105抗体染色等方法对细胞表型、纯度进行鉴定。2、采用藻酸盐凝胶与BMSCs构建叁维共培养体系,通过细胞计数、绘制生长曲线、H-E染色、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色等观察藻酸盐叁维凝胶中细胞生物学性状的变化。3、构建庆大霉素-藻酸钙叁维缓释凝珠U、S、T共3组,通过紫外分光光度法及微生物法检测释放的药物浓度及持续时间,计算药物累积释放量与各时间段的点释放量,并与含庆大霉素的骨水泥Y组作比较,寻找合适的浓度配比,使庆大霉素的释放更加稳定持久。4、构建BMSCs–庆大霉素-藻酸盐叁维缓释共培养体系,通过细胞计数、绘制生长曲线、H-E染色、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色等观察BMSCs的细胞形态、增殖能力及表型的变化,以及庆大霉素对BMSCs细胞和软骨细胞增殖及分化的影响。结果:1、培养的BMSCs贴壁能力很强,细胞形态为短梭形或纺锤形,细胞形态、大小相近;采用免疫细胞化学检查发现培养的第1-3代细胞表达细胞表面抗原CD44、CD105,不表达CD34;同时,Ⅱ型胶原免疫组化染色阴性,显示所培养的细胞为未分化的BMSCs。2、藻酸盐凝胶具有一定的弹性和强度及良好的组织相容性,BMSCs在藻酸盐凝珠中具有良好的生物学活性;经过2周以上的藻酸盐叁维凝珠培养,免疫组化鉴定发现支架细胞的Ⅱ型胶原染色阳性、甲苯胺蓝染色也呈阳性改变,说明藻酸盐叁维培养微环境可诱导BMSCs定向分化成软骨细胞。3、U组庆大霉素-藻酸钙叁维缓释凝珠的庆大霉素累积释放量与庆大霉素骨水泥Y组没有显着性差异,与S、T组有显着性差异,释放情况优于S、T组,S、T组间无显着性差异。U组各时间段的点释放量与Y组有显着性差异,与S、T组有显着性差异,S、T组间无显着性差异。从各时间段的点释放量与时间的曲线图可以看出U、Y组整体释放较为接近,而U组早期(前24h)的药物释放要大于Y组和S、T组。各组在30天的检测时间里都能检测出药物的释放,且大于最小抑菌浓度。4、BMSCs在构建BMSCs–庆大霉素-藻酸盐叁维缓释共培养体系中具有良好的生物学活性;经过大体观察,倒置显微镜观察BMSCs的生长情况良好,细胞生长曲线基本正常,经过2周以上的藻酸盐叁维凝珠培养,免疫组化鉴定发现细胞的Ⅱ型胶原染色阳性,甲苯胺蓝染色也呈阳性改变,呈软骨细胞表型。结论:1.实验采用贴壁筛选法分离、纯化兔骨髓间充质干细胞,经免疫组化检测CD34、CD44、CD105抗体免疫组化染色阳性,Ⅱ型胶原抗体免疫组化染色阴性,符合BMSCs的特点,证明通过该方法可以成功获取到高纯度、未分化的骨髓间充质干细胞。2.构建BMSCs-藻酸盐天然支架材料叁维立体培养体系,经过大体观察,倒置显微镜观察BMSCs的生长情况,细胞生长曲线的绘制,证实BMSCs在该支架材料叁维立体生长增殖良好,培养第7-21天细胞增殖明显,较平面培养获得更多的细胞量,为BMSCs提供良好的生长微环境,并且BMSCs可以保持良好的生物学形态,于培养2周时能够分化为软骨细胞,经免疫组化检测Ⅱ型胶原抗体免疫组化染色阳性,甲苯胺蓝染色呈阳性改变。3、庆大霉素-藻酸钙叁维缓释凝珠能够长期持久的释放庆大霉素,并在局部达到最小抑菌浓度。在30天的检测时间里,按U组配制方案获得的藻酸钙凝珠包封率达53.99%,释放庆大霉素的速度及总量比较理想,超过最小抑菌浓度,与庆大霉素骨水泥的释放情况相当。由于藻酸钙的可降解性,其早期释放庆大霉素的量要高于庆大霉素骨水泥。4、BMSCs-庆大霉素-藻酸钙叁维缓释凝珠能够在缓释庆大霉素的情况下保持BMSCs的生物学形态, BMSCs在该支架材料叁维立体生长增殖良好,培养第7-21天细胞增殖明显,并最终向软骨细胞分化,经免疫组化检测Ⅱ型胶原抗体免疫组化染色阳性,甲苯胺蓝染色呈阳性改变。
刘松波, 胡蕴玉, 徐虎, 吕荣, 徐建强[8]2001年在《柱形藻酸钙载体制备及复合兔膝关节软骨细胞的初步观察》文中研究表明目的 构建用于软骨组织工程研究的新型细胞载体 .方法 通过向一定浓度的藻酸钠中加入二价阳离子并置入特殊模具中 ,经冷冻、脱水等处理 ,获得圆柱形藻酸钙载体 ,并复合软骨细胞观察 .结果 制备的藻酸钙载体具有网眼状结构 ,孔隙为 6 0～ 16 0μm,嵴上并可见 10～ 2 0μm的小洞 .复合细胞组可见网眼中有数目不等的软骨细胞 .结论 柱形藻酸钙载体初步具备作为软骨细胞载体的条件 ,可用于软骨组织工程的研究
杨万波[9]2004年在《胰岛素样生长因子对软骨细胞复合物体外成软骨能力的影响》文中进行了进一步梳理目的：探讨一种修复关节软骨的有效途径；方法：自制藻酸钙载体复合软骨细胞置入DMEM培养基中，实验组加入胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF-I)，体外培养4周；结果：两周内开始出现软骨样物质，以后体积增大，数量增多，质地变硬。实验组与对照组差别显着；结论：藻酸钙与软骨细胞具有良好的相容性，软骨细胞在藻酸钙载体中保持了原有特性和成软骨能力，IGF-I能够促进软骨细胞的分化增殖，并维持软骨细胞的原有表型。
汤旭日[10]2005年在《胰岛素样生长因子-I、碱性成纤维细胞生长因子和透明质酸钠对藻酸钙载体—关节软骨细胞复合物的生物学效应》文中指出目的:研究胰岛素样生长因子-Ⅰ、碱性成纤维细胞生长因子和透明质酸钠对叁维培养条件下软骨细胞表型及增殖能力等生物学行为的影响。方法:构建关节软骨细胞与藻酸钙载体的复合物,培养基中添加IGF-Ⅰ、bFGF和SH,观察软骨细胞的生物学特性的变化。结果:bFGF、IGF-Ⅰ均促进细胞增殖及增加胞外基质中GAG含量,bFGF促细胞增殖作用更明显,而IGF-1对稳定细胞表型及促进GAG合成的影响更显着,两种因子的协同作用主要表现在对细胞的增殖作用上。SH与bFGF、IGF-Ⅰ联合应用,有助于保持透明软骨细胞表型的稳定。结论:最佳生长因子组合可稳定软骨细胞表型,促进细胞增殖及基质合成,为组织工程软骨研究提供一种有效的途径。
参考文献：
[1]. 藻酸钙复合自体软骨细胞修复兔关节软骨缺损实验研究[D]. 赵智君. 昆明医学院. 2010
[2]. 藻酸钙载体制备及复合软骨细胞修复关节软骨缺损的研究[D]. 刘松波. 第四军医大学. 2001
[3]. 自体软骨细胞—藻酸钙复合物修复羊膝关节负重区全层软骨缺损的实验研究[D]. 郭全义. 中国人民解放军军医进修学院. 2006
[4]. BMSCs-庆大霉素—藻酸钙叁维缓释微球修复兔膝关节软骨缺损的实验研究[D]. 扶晓明. 第二军医大学. 2012
[5]. 藻酸钙凝珠复合自体软骨细胞修复成年兔关节软骨缺损[J]. 吴迪, 赵智君, 朱晓松, 杨浩, 李青. 中国组织工程研究与临床康复. 2010
[6]. 自体骨髓间充质干细胞藻酸钙载体复合物对兔膝关节软骨缺损修复影响的实验研究[D]. 于灏. 中国医科大学. 2007
[7]. 构建BMSCs-庆大霉素—藻酸钙叁维缓释微球的实验研究[D]. 沈锋. 第二军医大学. 2011
[8]. 柱形藻酸钙载体制备及复合兔膝关节软骨细胞的初步观察[J]. 刘松波, 胡蕴玉, 徐虎, 吕荣, 徐建强. 第四军医大学学报. 2001
[9]. 胰岛素样生长因子对软骨细胞复合物体外成软骨能力的影响[D]. 杨万波. 武汉大学. 2004
[10]. 胰岛素样生长因子-I、碱性成纤维细胞生长因子和透明质酸钠对藻酸钙载体—关节软骨细胞复合物的生物学效应[D]. 汤旭日. 第二军医大学. 2005
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