杨鹏华[1]2004年在《羊附红细胞体生物学特性研究及其PCR和ELISA检测方法的建立》文中研究指明为了研究附红细胞体在体外生长变化的规律，为附红细胞体的体外培养提供依据，在羊附红细胞体感染的血液中分别加入叁种抗凝剂，试找出对羊附红细胞体(Epervthrozoon ovis)体外生长影响最大的一种抗凝剂。结果表明，柠檬酸钠溶液能使附红细胞体在体外血液中维持一定的数量。在柠檬酸钠溶液中加入葡萄糖和NaHCO_3，研究了营养成分的添加对羊附红细胞体的影响。结果表明，在抗凝剂中添加葡萄糖和NaHCO_3能显着地提高附红细胞体的数量。故在其后的试验中，采用添加葡萄糖和NaHCO_3的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂。根据附红细胞体在离体后12h内保持增殖活性的特性，血样必须在采后12h内处理。 2002年1月～2002年12月，用镜检法对羊附红细胞体病的流行病学进行了调查。对附红细胞体的流行病学调查表明，附红细胞体对羊的感染率有一定的季节性，与吸血昆虫有一定的关系。寒冷季节，附红细胞体的感染率非常低，温暖潮湿的春夏季节，感染率呈上升趋势，在炎热的季节，附红细胞体的感染率非常高，常常达到80％以上。 对附红细胞体进行分子水平上的研究始见于20世纪80年代，随着基因工程技术的迅猛发展，对该病的研究也逐渐深入到分子水平上。本试验根据羊附红细胞体的16S rRNA基因参考序列的保守区，设计一对特异性引物(p1／p2)，对羊附红细胞体基因组DNA进行了PCR检测，扩增出一段1000多bp的DNA序列，用EcoRI酶切，得到两条500bp以上的条带，与预期结果一致，说明PCR方法扩增出了羊附红细胞体的特异条带。并经交叉性和灵敏性试验证明，该方法特异、灵敏、快速，可从分子水平上对附红细胞体病进行早期快速诊断和流行病学调查，是一种理想的精确检测该病的方法，能及时掌握该病的流行情况并迅速准确地对可疑病例作出诊断，杜绝该病的大规模爆发，对控制该病的大范围流行具有重要意义。 附红细胞体病的诊断一直以来都是以镜检法作为标准，然而由于附红细胞体个体很小，镜检法有一定缺陷，并且缺乏特异性，故寻求一种快速、特异的诊断方法就成了当务之急。本试验利用血清学技术，摸索了酶联免疫吸附试验(ELISA)的最佳工作条件。自行采集血液，提纯抗原，用常规方法免疫家兔，制备阳性血清，进行酶联免疫吸附试验，并与镜检法作比较，证明ELISA作为诊断羊附红细胞体病的一种方法具有特异、灵敏、快速、高效的优点。以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体为酶标二抗，最佳工作条件为抗原稀释度64倍、阳性血清稀释度160倍、酶标二抗稀释度1000倍，一抗和二抗的最佳反应时间为1h。对羊附红细胞体的最小检出量为50.30μg／ml。与支原体、大肠杆菌、葡萄球菌无交叉反应，证明该方法具有良好的特异性。ELISA方法适合于大规模养殖场对附红细胞体病的调查，从整体水平上把握该病的流行情况，为控制该病的传播提供依据。
朱凝瑜[2]2010年在《猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法及小鼠病理模型的建立》文中进行了进一步梳理本研究建立了猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法,通过不同传播途径建立小鼠感染模型,并对通过腹腔注射建立的模型进行了病理组织学研究,主要工作如下:一、猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法的建立及应用将通过水浴-过滤法分离纯化的具有较强感染力的附红细胞体,按常规程序免疫家兔与小鼠,得到高效价的阳性血清。并通过反应条件的优化(捕获抗体1:200稀释,4℃包被过夜,1 %明胶溶液37℃封闭1 h,检测抗体1:400稀释,37℃作用2 h,酶标二抗1:8000稀释,37℃作用1 h,37℃显色10 min)及敏感性(最低检出量为3.812μg/ml)、特异性、重复性实验(组间、组内的变异系数分别为6. 57 %、4.58 %)的验证,建立了稳定的双抗夹心ELISA检测方法。对上海地区采集的91份猪血样的临床检测中,本试验建立的双抗夹心ELISA方法,检出阳性率为53.8 %;略低于PCR检测结果阳性率57.1 %,高于瑞氏-姬姆萨染色镜检法(34.1 %)。说明本方法具有较高的可行性,且操作简便,为诊断试剂盒的研制奠定了基础,适用于基层大规模检测。二、猪附红细胞体传播途径的初步研究本实验利用SPF昆明小鼠作为模型动物,将从阳性猪血中分离纯化的附红细胞体,以腹腔注射方式感染小鼠,以健康猪血分离物注射小鼠作为阴性对照,同时设立了饮水组(在小鼠日常饮水中加入纯化的附红细胞体)、接触组(小鼠本身未做处理,但与攻毒组同笼饲养)及空白组(小鼠未作任何处理),欲对其传播途径进行初步的研究。采集小鼠血液,应用显微镜检、PCR及双抗夹心ELISA法对附红细胞体体内感染消长时间及分布情况进行检测。镜检表明,附红细胞体感染的首现期为注射后第1 d,第5 d感染率达到高峰(80 %左右),随后逐渐降低。在整个实验过程中,腹腔注射组小鼠红细胞变形严重,PCR和双抗夹心ELISA检测始终为阳性。而其他各组小鼠红细胞未见明显变形,且PCR和双抗夹心ELISA检测均为阴性。表明该病原不易通过口腔、胃肠道黏膜及空气,呼吸分泌物,唾液等传播,为进一步研究其传播途径鉴定了基础。叁、猪附红细胞体小鼠病理模型的建立在确定附红细胞体能通过腹腔注射感染小鼠的基础上,研究感染后临床症状、剖检、组织病理变化,为进一步揭示猪附红细胞体的致病机理奠定基础,为其诊断提供一种手段。研究结果显示感染组小鼠没有表现出明显的特征性临床症状,但相对于对照组小鼠出现了精神萎靡,食欲不振,呼吸急促等现象。组织石蜡切片表明心、肝、脾、肺、肾脏出现了不同程度的病变,而十二指肠未见明显变化。对照组小鼠的内脏器官则均未出现明显病理变化。组织冰冻切片免疫荧光结果显示,荧光颗粒均未附着在组织上,而是散在分布于组织间隙中。表明附红细胞体的靶细胞只有红细胞,为该病的病理学研究打下一定的基础。
杜凯[3]2007年在《边缘无浆体病分子诊断ELISA和温氏附红细胞体PCR检测方法的建立》文中研究表明边缘无浆体病和附红细胞体病是影响养牛业的两种主要的寄生虫疾病。两种病的临床表现均表现为贫血、黄疸、食欲不振、消瘦等。边缘无浆体和附红细胞体都是寄生于血液中的寄生虫，染色镜检很难区分，因此本实验室分别建立边缘无浆体和附红细胞体的实验室检测方法用于它们的临床调查。无浆体病(Anaplasmosis)是由边缘无浆体(A.marginle)经蜱传播而引起的一种传染性血液寄生虫病。本病广泛存在于世界各种地理条件之下，本病主要引起牛、羊、鹿等家畜发病，严重的可以致死，牛死亡率可达80％。它是阻碍养牛业发展的几种主要蜱传播疾病中分布最广的一种。本文选取边缘无浆体部分基因构建载体并进行表达，以此表达蛋白为抗原建立边缘无浆体间接ELISA检测方法，用于调查边缘无浆体的流行病学。并为边缘无浆体检测试剂盒的建立奠定基础。根据GenBank公布的边缘无浆体MSP5基因序列(AY714547)设计一对引物，用PCR方法从无菌颈静脉采集姬姆萨染色镜检边缘无浆体为阳性的牛血的DNA模板中扩增MSP5基因582bp的片断。将该片段克隆到原核表达载体pGEX-KG中，构建原核表达载体KG-MSP5，转化BL21，在IPTG的诱导下表达大小约46kD的蛋白。利用BugBuster GST Bind Purification Kit将其纯化，经Western blot分析表明，该蛋白具有良好的免疫反应活性。将可溶性表达产物变性和复性后包被酶标板建立了间接ELISA方法，特异性试验表明其只能特异性地与边缘无浆体反应。与试剂盒(cELISA方法，VMRD，Inc.)同时检测478份临床样品，符合率为98.54％。利用该方法对湖北省、江苏省、新西兰、澳大利亚、加拿大466份临床样品进行调查，结果表明湖北省样品中边缘无浆体阳性率分别为12.89％，而江苏省、新西兰、澳大利亚、加拿大样品中未检测到边缘无浆体。附红细胞体病是由附红细胞体(Eperythrozoon)寄生于多种动物的红细胞表面、血浆及骨髓中引起的一种人畜共患病。关于附红细胞体的分类地位目前仍有争议，传统的分类学方法将附红细胞体列为立克次氏体，但是近年来16S rRNA基因的系统发育分析的结果表明，附红细胞体更接近于支原体(Mycoplasma)。近几年，国内对该病的报道日益增多，它给畜牧业造成巨大的损失。到目前为止，温氏附红细胞体还没有能够纯培养。实验室检测方法也一般以显微镜镜检为主，在红细胞表面或血浆中能看到温氏附红细胞体的存在。但是显微镜镜检的敏感性和特异性较差，而且及易造成假阳性。血清学方法也存在着没有较好的抗原制备方法以及不能区分是否是正在感染虫等局限性。近来，DNA杂交、PCR等实验方法提高了检测方法的灵敏度。为建立特异、敏感、快速的温氏附红细胞体诊断方法，根据本实验室已测得的温氏附红细胞体16S rRNA基因序列(Genbank登陆号为AY946266)，设计一对种特异性引物，建立了温氏附红细胞体的PCR诊断方法。特异性试验和敏感性试验表明，此诊断方法只能特异性地扩增温氏附红细胞体的16S rRNA基因序列的特异性片段，检测温氏附红细胞体最低DNA量为1.78fg。利用该方法对湖北省和江苏省温氏附红细胞体感染情况进行了流行病学调查，结果显示阳性感染率分别为10.3％和3.5％，从分子生物学水平证明了温氏附红细胞体在两省的存在。根据临床样品调查结果显示，本文建立的PCR方法比姬姆萨染色镜检准确特异，姬姆萨染色镜检方法易出现假阳性。
王健[4]2006年在《温氏附红细胞体对牛血液生化指标的影响及双抗体夹心ELISA、PCR诊断方法的建立》文中研究表明采集自然感染温氏附红细胞体的牛血,用柠檬酸钠抗凝,制成血压片和姬姆萨染色的血涂片,光学显微镜下观察红细胞及附红细胞体的形态。附红细胞体单个或聚合在一起存在于血浆中,附有附红细胞体的红细胞发生变形,姬姆萨染色后附红细胞体被染成淡紫色。对采集的血液按其镜检感染率进行分组,分别测定其一氧化氮(NO)含量、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果显示,随着附红细胞体感染强度的增加,血浆中相应的NO和MDA含量逐渐升高,SOD活力逐渐降低。表明这叁种生化指标的变化与附红细胞体的感染有关。 无菌采集自然感染附红细胞体的抗凝血,通过PBS-T缓冲液洗涤、高速低温离心和超声波裂解等方法获得纯化的温氏附红细胞体抗原。将该抗原按常规方法免疫家兔,制备了兔抗温氏附红细胞体的高免血清。运用辛酸硫酸铵法提取血清中的免疫球蛋白IgG,聚丙烯酰胺(PAGE)垂直板电泳结果显示所提取的IgG纯度较高,并且此法操作简便,表明其是一种实用高效的抗体提纯方法。 将提取的免疫球蛋白IgG,用过碘酸钠改良法制备酶标抗体,建立了从血液中检测奶牛温氏附红细胞体抗原的双抗体夹心ELISA。试验最佳条件为,抗体最适包被量为156μg/mL,酶标抗体最适工作浓度为1∶400稀释,抗原及酶标抗体的作用时间分别为37℃1h,封闭液为5%犊牛血清,底物显色时间为15min。对温氏附红细胞体抗原的最低检出量为6.64μg/mL。全血及带有附红细胞体的红细胞与纯化抗体反应的最大稀释倍数分别为1∶160和1∶40,可按照此浓度检测血液中的附红细胞体抗原。对该方法进行特异性阻断试验、交叉性试验和重复性试验,结果表明它是一种特异、灵敏、快速的诊断方法,并适合作群体检测。 从河北省不同地区采集奶牛血样222份,应用建立的双抗体夹心ELISA检测方法对其进行检测,结果阳性检出率为91.0%,说明本省奶牛群中温氏附红细胞体感染普遍。本次调查揭示了河北省牛群尤其是规模化牛场中温氏附红细胞体的感染情况,从而为牛附红细胞体病的综合防制提供可靠依据。 本试验根据温氏附红细胞体的16 S rRNA基因参考序列的保守区,利用软件Primer 5.0设计合成了一对特异性引物,对温氏附红细胞体的基因组DNA进行了PCR检测,扩增出一段985 bp的DNA序列,EcoR Ⅰ酶切鉴定得到两条500 bp左右的条带,与预期结果一致,说明该方法扩增出了温氏附红细胞体的特异性条带。通过敏感性、特异性、重复性和扩大性试验证明,该方法具有特异、灵敏、快速的优点,可用于牛附红细胞体病诊断和流行情况监测。
李继连[5]2011年在《羊附红细胞体双抗体夹心ELISA诊断方法的建立》文中研究表明羊附红细胞体病是一种人畜共患病,其病原体为羊附红细胞体(E.ovis)。为了准确快速诊断该病,为及时进行有效防治提供技术支撑,本试验探索一种准确高效的羊附红细胞体特异性抗原制备技术,以此建立特异、灵敏的双抗体夹心ELISA检测方法。采集红细胞感染率>90%的羊附红细胞体阳性抗凝血,分别应用水浴法和药物体外驱虫法对羊附红细胞体进行解离,观察分离前后附红细胞体感染率(%)、红细胞感染强度(个)、附红细胞体数(1×104/mm3)、杂质含量和附红细胞体的运动性五项指标；提取附红细胞体抗原,制备全蛋白悬液,测定蛋白质含量,比较解离效果。将两种方法制备的羊附红细胞体抗原全蛋白进行SDS-PAGE试验,观察条带是否一致。结果显示,200mL血液中加入1mL双向红链灭,4℃作用36h,即可达到较好分离效果。与水浴法相比,解离后,红细胞感染率和感染强度明显下降,蛋白含量增加,收率高,纯度好。SDS-PAGE结果显示,体外驱虫法所制备的附红细胞体抗原全蛋白悬液,其抗原蛋白带与水浴法相同。应用体外驱虫法粗制羊附红细胞体抗原全蛋白,采用切胶技术、水平电泳技术和透析方法将其纯化后,再应用SDS-PAGE和免疫印迹试验筛选出有免疫原性的特异性抗原蛋白成分。再次纯化这些成分,并免疫家兔,制备并提纯抗体,进一步建立特异、灵敏的血清学检测方法—双抗体夹心ELISA方法。结果表明,粗制抗原主要由4条带组成,纯化后经分析分子量分别为115.35kDa,74.13 kDa,68.87 kDa,32.96 kDa。免疫印迹试验中,只分子量为115.35kDa和68.87 kDa的两条带与阳性血清反应,因此认定为羊附红细胞体特异性抗原蛋白。其余两条带或只一部分成阳性,或不反应。双抗体夹心ELISA试验结果表明,特异性免疫抗原蛋白浓度为1.8mg/mL,免疫家兔35天后,兔血清抗体效价高达1：5120；敏感性试验结果显示抗原最低检出量为3.55μg/mL,较应用粗制抗原制备抗体建立的ELISA方法敏感度提高。特异性试验结果显示,纯化抗体只与羊附红细胞体反应,而与肺炎支原体、大肠杆菌、葡萄球菌不反应；由交叉性试验结果可见,用纯化抗体检测抗原时,只有羊附红细胞体呈阳性反应,不与其他动物附红细胞体的抗原反应,说明本试验特异性好。从张家口地区某些羊场采取血样100份,应用本检测方法进行检测,结果羊附红细胞体阳性率为79%,优于镜检法(阳性率为62%),差异显着(P<0.05)。
孙英峰[6]2007年在《猪附红细胞体套式PCR诊断方法的建立及人工感染动物模型的研究》文中提出附红细胞体病(Eperthrozoonsis)是附红细胞体(Eperthrozoon,简称附红体)寄生于红细胞表面、血浆、组织液及脑脊液中,引起贫血、黄疸、发热等的一种人、畜、禽共患的传染性疾病。近几年,国内对猪附红细胞体病的报道日益增多。为明确该病的发病、感染状况,本研究在对发病猪场进行疫情调查、临床症状、剖检病理变化、鲜血压片和血液推片染色诊断方法检查的基础上,建立套氏PCR诊断方法,并对该病建立人工感染动物模型,证实不同动物在附红细胞体的传播过程中发挥着重要作用。本研究包括叁个试验:试验一,猪附红细胞体病套氏PCR诊断方法的研究;试验二,猪附红细胞体病动物感染模型的建立;试验叁,猪附红细胞体病在多种动物中交叉感染的研究。试验一猪附红细胞体病套氏PCR诊断方法的研究以无菌法采取自然发病的猪附红细胞体病的血液,用阿氏液抗凝后,从血液中分离纯化E.suis,提取DNA。根据GenBank收录的猪附红细胞体16S rRNA基因序列为例,设计两对特异引物,建立了一种快速、准确检测猪附红细胞体的套式PCR方法,凝胶电泳定性,经扩增后得到了一长度为498 bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段;结果表明,建立的套氏PCR检测方法具有高度的特异性和敏感性,能够客观的反映附红细胞体病发病情况,可用于附红细胞体病的检测。试验二猪附红细胞体病动物感染小鼠模型的建立用多种诊断方法确定阳性血液样品,分别经腹腔、皮下及肌肉感染小鼠,定期采血,进行常规血涂片染色,并从血液中分离纯化E.suis,提取DNA,进行套式PCR法扩增,凝胶电泳定性,得到目的片段;在整个实验过程中未见感染小鼠明显的临床症状;附红细胞体的感染方式有以下几种:腹腔、皮下及肌肉感染。可以用小鼠建立猪附红细胞体动物感染动物模型,进行抗附红细胞体药物筛选。试验叁猪附红细胞体病在多种动物中交叉感染的研究首先将诊断为阳性的猪附红细胞体血液,进行附红细胞体分离纯化,然后将纯化的猪附红细胞体人工感染大鼠、家兔和雏鸡叁种实验动物,并用常规的诊断方法及所建立的套氏PCR方法进行检测,证明了猪附红细胞体在大鼠与家兔之间存有交叉感染,并同时说明了猪附红细胞体具有相对的宿主特异性,为防止该病的交叉的感染并造成流行提供了理论基础。
雷晓思[7]2015年在《猪源附红细胞体分离鉴定PCR方法的建立及小附红细胞体人工感染试验》文中进行了进一步梳理感染猪的附红细胞体分为附红细胞体和小附红细胞体两大类。而国内还未见有关小附红细胞体分离和动物感染试验的报道。通过小附红细胞体病原的分离鉴定及动物感染试验,有助于了解小附红细胞体的生物学特性及致病性。本试验从上海地区2个屠宰场,采集猪抗凝血736份,提取血液基因组DNA作为模板,设计合成两对特异性引物并验证了具有高度敏感性和良好特异性,用两对特异性的引物进行16s RNA基因部分序列的PCR扩增、克隆、序列测定及生物信息学分析。结果显示,在736份血样中,猪源附红细胞体阳性率为13.72%(101/756),其中小附红细胞体阳性率为7.34%(54/736),猪附红细胞体阳性率为4.76%(35/736),混合感染比例为1.63%(12/736),2个屠宰场3次采集的样品阳性率差异极显着(χ2==132.841,P<0.001)。嘉定区某屠宰场3月份的阳性率为2.41%,5月份的阳性率为33.21%,5月份极显着高于3月份(χ2=81.484,P<0.001)。在DNA扩增阳性血样中,分别选取4份小附红细胞体引物扩增产物和4份猪附红细胞体引物扩增产物,亚克隆到pMD18-T载体后进行测序。小附红细胞体扩增片段序列完全一致,长度均为483 bp, BLASTn软件在线分析显示所获得序列与GenBank公布的小附红细胞体Indiana株16S rRNA基因(登录号：NR 121759)序列同源性达100%。猪附红细胞体扩增片段序列也完全一致,长度均为482 bp, BLASTn软件在线分析显示所获得序列与GenBank公布的猪附红细胞体Morioka5、6、8株16SrRNA基因(登录号分别为：AB610847、AB610848、AB610849)和ZJ NB01株16S rRNA基因(登录号：KC907396.1)序列同源性达100%,猪附红细胞体扩增片段与小附红细胞体扩增片段的同源性仅为93.6%。用小附红细胞体阳性血样通过肌肉注射方法接种广西巴马去脾仔猪,采集血样进行特异性PCR检测及序列分析。结果表明：试验组5头仔猪中有2头在接种12d、5头在接种15d均检出小附红细胞体基因,人工感染猪血样与接种原血样DNA扩增产物基因序列完全一致。这证明已经成功建立了小附红细胞体人工感染猪的试验。本研究通过试验数据证明了国内确实有猪感染小附红细胞体,小附红细胞体和猪附红细胞体在16sRNA基因片段上存在差异。通过人工肌肉接种,首次建立了小附红细胞体猪感染试验模型,为小附红细胞体的生物学特性和致病性研究打下了基础。
刘冰[8]2007年在《猪附红细胞体动物感染模型的建立》文中认为猪附红细胞体病(Eperythrozoonosis suis)是由猪附红细胞体(Eperythrozoon suis)寄生于猪红细胞表面、游离于血浆及骨髓中而引起的以仔猪发热、贫血和黄疸，母猪流产等症状为特征的疾病。该病常与其它猪病混合发生，临床上防治困难，给养猪业造成了巨大经济损失。但迄今为止，国内外对该病病原学、流行病学、免疫学等方面的研究还不够深入，以至于不能够制定有效的预防措施，因此非常需要建立一个合适而稳定的猪附红细胞体动物感染模型，以期为进一步了解猪附红细胞体奠定基础。本研究以昆明小白鼠为实验动物，通过摘除脾脏和注射地塞米松等方法降低其免疫力，然后以腹腔注射方式接种猪附红细胞体。经血液涂片镜检、PCR、ELISA、临床观察及病理剖检进行检测和鉴定。结果表明，各接种组小白鼠在人工感染猪附红细胞体后的第1—2d，血液样本PCR检测均为阳性；摘除脾脏处理组、注射地塞米松处理组以及摘除脾脏／注射地塞米松处理组小白鼠红细胞感染率在人工感染后第4—5d相继达到高峰，未处理组小白鼠在感染后第7d红细胞感染率达到高峰；序列分析表明，感染小白鼠体内的猪附红细胞体与接种的猪附红细胞体吉林株之间同源性为100％，表明猪附红细胞体在小白鼠体内建立了感染；接种后各处理组小白鼠血清中猪附红细胞体抗体效价出现短暂升高，随后逐渐降低；而未处理组小白鼠接种后血清中猪附红细胞体抗体效价逐渐升高，至21d时达到最高值。在试验期间，未接种组(健康对照组)小白鼠一直未出现异常临床表现，而摘除脾脏和注射地塞米松处理组的小白鼠在接种后19—21d后，相继出现猪附红细胞体感染的典型临床症状，说明本研究成功地建立了猪附红细胞体小白鼠动物感染模型。
陈明[9]2006年在《奶牛附红细胞体病PCR检测方法的建立及其病原生物学初步研究》文中认为奶牛附红细胞体病是一种日益受到人们关注的人畜共患病，病原是牛温氏附红细胞体。该病近年来给我国养牛业造成了较严重的经济损失。针对目前国内还尚未在分子水平上证实该病原的存在，对其分类学地位不清楚及镜检作为检测该病普遍采用的方法存在许多不足等情况。本文对奶牛附红细胞体的16SrRNA基因进行了克隆、测序，并依此建立系统发肓进化树，旨在从分子水平上确定其分类学地位。并且根据所得16SrRNA基因序列设计引物，建立了奶牛感染附红细胞体的PCR诊断方法。 本研究利用原核生物16SrRNA基因通用引物27F和1492R对分离纯化的疑似奶牛附红细胞体进行16SrRNA基因的PCR扩增及克隆测序。测序结果表明，目的片段长度为1439bp，其核苷酸序列与国外已发表的牛温氏附红细胞体(E．wenyoni)的16SrRNA基因片段同源性高达97.1％，暂称为中国广西株(E．wenyoni-CGX)；系统发育进化树显示，E．wenyoni-CGX和其它血营养菌在系统进化关系上组成了一个大的进化分支，与支原体科、支原体属的病原最接近(75％)，而与立克次氏体科的病原较远(55％)。分析结果支持了Neimark等和Messick等提出的将这类血营养菌划归入支原体科、支原体属的建议。 同时，根据测序得到的奶牛附红细胞体16SrRNA基因序列，设计一对种
刘永夏[10]2012年在《应用重组MSG1蛋白检测猪附红细胞体抗体的ELISA方法的建立及其单克隆抗体的制备》文中提出猪附红细胞体（Mycoplasma suis, M.suis）是一种寄生于猪红细胞表面、血浆及骨髓中的微生物，能够引起猪的发热、贫血、黄疸等临床症状的人畜共患性传染病。鉴于临床猪附红细胞体病造成的巨大的经济损失，对于猪附红细胞体研究成果向实践转化的需求显得尤为迫切。其中对MSG1蛋白的研究相对较多，将其作为研究对象较为合适，于是确定了本课题研究思路。采用人工构建的重组大肠杆菌进行MSG1蛋白的体外表达，对蛋白在大肠杆菌BL21菌株的表达情况进行了初步分析；随后将此蛋白作为检测抗原建立ELISA方法进行临床猪附红细胞体病的检测，并设立了敏感性试验、特异性试验、符合性试验和重复性试验，对建立的ELISA方法进行有效性评估；最后将MSG1蛋白接种小鼠，建立杂交瘤细胞系，筛选阳性克隆，获取单克隆细胞株，进行单克隆抗体的生产。通过试验，发现猪附红细胞体MSG1蛋白在BL21菌株表达系统能以包涵体的形式进行大量表达，并且获得了纯化MSG1蛋白；MSG1蛋白有良好的抗原性，以MSG1蛋白建立的ELISA方法用于临床检测猪附红细胞体病感染率为46.25%，其中阳性样本对已知小鼠抗血清有明显的阻断作用，并且与其他一些抗原无交叉反应，此ELISA方法的特异性和敏感性分别可达到97.06%和95.92%，较间接血凝试验(IHA)有更高的检出率；通过建立的杂交瘤技术，获得了两株能稳定分泌抗体的单克隆细胞系。本试验的成果为进一步研究MSG1蛋白奠定了基础，为猪附红细胞体病的诊断提供了方法和手段，为进一步建立更快、更直观、更简便的检测方法提供了物质基础和依据。
参考文献：
[1]. 羊附红细胞体生物学特性研究及其PCR和ELISA检测方法的建立[D]. 杨鹏华. 河北农业大学. 2004
[2]. 猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法及小鼠病理模型的建立[D]. 朱凝瑜. 上海交通大学. 2010
[3]. 边缘无浆体病分子诊断ELISA和温氏附红细胞体PCR检测方法的建立[D]. 杜凯. 华中农业大学. 2007
[4]. 温氏附红细胞体对牛血液生化指标的影响及双抗体夹心ELISA、PCR诊断方法的建立[D]. 王健. 河北农业大学. 2006
[5]. 羊附红细胞体双抗体夹心ELISA诊断方法的建立[D]. 李继连. 中国农业科学院. 2011
[6]. 猪附红细胞体套式PCR诊断方法的建立及人工感染动物模型的研究[D]. 孙英峰. 山东农业大学. 2007
[7]. 猪源附红细胞体分离鉴定PCR方法的建立及小附红细胞体人工感染试验[D]. 雷晓思. 四川农业大学. 2015
[8]. 猪附红细胞体动物感染模型的建立[D]. 刘冰. 延边大学. 2007
[9]. 奶牛附红细胞体病PCR检测方法的建立及其病原生物学初步研究[D]. 陈明. 广西大学. 2006
[10]. 应用重组MSG1蛋白检测猪附红细胞体抗体的ELISA方法的建立及其单克隆抗体的制备[D]. 刘永夏. 山东农业大学. 2012
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