杜宇 王彩丽 王慧 李海涛
【摘 要】 目的 分析TRPC6在大鼠正常肾组织和阿霉素肾病大鼠不同病理类型肾组织的表达差异，以探讨该分子在蛋白尿发生中的可能作用及相互关系。方法 采用阿霉素制备大鼠模型，分析TRPC6在不同病理类型大鼠肾组织中的表达。结果 在微小病变组表达增加（P<0.05），而在局灶节段性肾小球硬化组表达与对照组无明显差异。结论 TRPC6的表达在不同病理类型间存在差异，其表达的增强促进肾小球硬化
【Abstract】 purpose Analysis of TRPC6 and normal renal tissues in rats with adriamycin nephrosis expression in different pathological type of renal tissue of rats, to explore the molecular proteinuria occurred in May and mutual relations. Method using doxorubicin rats model, analysis of TRPC6 in different pathological type expression in rat kidney. Results expressed in tiny lesions group increased (P < 0.05), while in focal segmental glomerular sclerosis express no obvious difference with the control group. Conclusion TRPC6 expression in the differences between the different pathological type, the expression of enhanced promote glomerular sclerosis
足细胞是维持GBM结构和功能正常的主要细胞之一。它的损伤导致并增加了蛋白尿的发生[1]，加剧肾小球的硬化,。阿霉素可以直接损伤肾细胞，可能从DNA水平直接干预足突细胞的蛋白合成，造成足突细胞的形态学改变[3]. 。阿霉素肾病大鼠模型病理类型主要表现为局灶节段性肾小球硬化（FSGS）和微小病变（MCD）两种.。本文分析TRPC6在大鼠正常肾组织和阿霉素肾病大鼠不同病理类型肾组织的表达差异，以探讨该分子在蛋白尿发生中的可能作用及相互关系。
材料和方法
1．材料：健康雄性SD大鼠30只，体重200g左右（内蒙古大学动物中心提供，合格证号：SCX（蒙）2002-0001）。盐酸阿霉素（山西普德制药 10mg/支）。兔抗鼠 TPRC6：100ug/ml MAB1682 美国 Chemicon 公司。SP试剂盒（北京博奥森）。DAB显色系统（福州迈新）。
2．模型建立及分组：实验大鼠适应性喂养一周后随即分为3组：正常对照组（n=10）. MCD组，(n=10) 、FSGS组 (n=10）。MCD组测定24小时尿蛋白定量、血清白蛋白、总胆固醇、肌酐，尾静脉一次性注射盐酸阿霉素7.5mg/kg，并于注射后第7天和第14天分别测定上述指标，第14天处死对大鼠,取肾组织制备成蜡块备用。FSGS组大鼠测定上述指标后在第7天和14天分别尾静脉注射阿霉素5mg/kg， 2.5mg/kg，注射后28天和56天分别测定同样指标，第56天处死对大鼠,肾组织制备成蜡块备用。
3．免疫组化：石蜡切片脱蜡水化，采用SP法免疫组化试剂盒，检测α-actinin-4，（1:100稀释），DAB显色剂，显色3-5分钟后，所有操作按说明书进行。
4．用Olympus DP72摄象头及DP—BSW采集图像，利用IPP6.0图像分析软件，分别测定每个肾小球中TRPC6阳性面积占其整个肾小球面积的比。
5．统计学分析：计量资料以均数士标准差( )表示，多组间比较采用单因素方差分析。使用SPSS17.0软件进行统计处理.
结 果
1．大鼠的初始生化指标、尿蛋白定量及体重各组间均无显著差异（P>0.1），MCD组大鼠2周时尿蛋白、TG、CHO均明显升高，ALB明显下降与对照组比较具有显著性差异 (P<0.01)，而血肌酐无显著差异。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆FSGS组大鼠4周时尿蛋白、TG、CHO均明显升高，ALB明显下降与对照组比较具有显著性差异 (P<0.01)，8周时差异更加显著，而血肌酐始终无显著差异
2．TRPC6在各组中的所占肾小球面积百分比（见表1） ,表达差异统计如下：TRPC6在微小病变表达水平较对照组显著增多（P<0.01）,在局灶节段性肾小球硬化肾小球内的的表达水平较对照组显著增多（P<0.01），TRPC6在局灶节段性肾小球硬化组中增多较微小病变组更加显著（P<0.01）。
表1 TRPC6在不同病理类型大鼠肾小球的表达对比
组别 例数TRPC6（%）
对照组 10 12.91±1.55
MCD组10 19.47±4.21﹡﹡
FSGS10 36.47±3.91﹡﹡
注：与对照组比较， ﹡﹡ P<0.01,有显著性差异
讨 论
肾病综合征是因肾小球滤过膜通透性的改变而致使大量血浆白蛋白从尿中丢失，而引起的一系列病理生理改变的临床综合征[2]，而足细胞附着于肾小球基底膜（GBM）的外侧连同GBM和毛细血管内皮一起构成了肾小球血液滤过屏障，它是由细胞体、主突、足突(FP)三部分组成,相邻的足细胞由裂孔膈膜(SD)相连,足细胞特殊结构的维持主要依赖于以肌动蛋白为主的细胞骨架系统和一些特异性蛋白分子的表达,足细胞骨架结构是足细胞发挥正常功能的基础。其从肾小球基底膜（GBM）的脱落是启动肾小球硬化发生、发展的关键，目前在研究中发现足细胞的损伤有四个主要机制：（1）裂孔膜成分等或其结构的变化；（2）actin骨架蛋白的变化；（3）GBM的变化或者其与足细胞连接的变化；（4）足细胞表面的负电荷的变化[3、4] 足细胞是蛋白尿产生的重要原因。
瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(TRPC6)是一个非选择性阳离子通道蛋白，2005年，Winn[5]等利用免疫荧光首次发现TRPC6在正常人肾小球和肾小管均有明显表达， Moller【6】等通过免疫荧光发现TRPC6在正常人肾组织中遍布整个肾小球，尤其在毛细血管袢外周表达更强,TRPC6蛋白主要表达于足细胞初级和次级足突，尤在裂孔隔膜(SD)附近分布居多，而且TRPC6与nephrin, podocin, CD2AP等其他蛋白共同表达于相邻两个足细胞膜接合区域，与它们共同组成裂孔隔膜的一个信号复合体，称为SD复合体，共同调节足细胞功能。TRPC6的发现及其与足细胞结构蛋白的相互作用将离子通道和足细胞结构蛋白联系了起来，丰富了足细胞分子网络，拓宽了对肾小球性蛋白尿发生机制的认识，目前认为TRPC6可能通过使细胞内钙离子浓度升高、直接影响肌动蛋白支架以及组成机械敏感性钙离子通道引起蛋白尿的发生，使肾小球硬化，进一步引起终末期肾衰竭。Moller等【6】发现FSGS、微小病变性肾病患者中,TRPC6表达显著增加,并且成群分布,有节段性密集性。本研究显示TRPC6在微小病变和局灶节段性肾小球硬化肾小球内的的表达水平较对照组显著增多（P<0.01），且在局灶节段性肾小球硬化组中增多较微小病变组更加显著（P<0.01），进一步说明了TRPC6表达的强弱与尿蛋白及肾小球的硬化存在一定的关系。这提示我们是否可以通过抑制TRPC6的表达而减轻临床蛋白尿以及延缓肾小球硬化，所以，TRPC6通道阻断剂有可能成为未来新的治疗领域。
参考文献
[1]王建中，陈香美，师锁柱，等. 基质金属蛋白酶-9和金属蛋白酶组织抑制物-1在IgA肾病肾组织中的表达[J].中华内科杂志.2002,41 (2):75-78
[2]王海燕.肾脏病学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2008:1379- 1382.
[3]孙珉丹，耿兴花，陈志，等. 中国长春地区汉族人MMP-9 C-1562T 基因多态性与IgA 肾病易感性的相关性[J].中国生物制品学杂志.2009, 22(12):1190-1191.
[4]张丽萍，李绍梅，裴华颖，等.基质金属蛋白酶-9在IgA肾病患者足细胞损伤中表达变化的意义[J].中国全科医学.2010, 13 (4):1182-1184.
[5]Winn MP, Conlon PJ, Lynn KL, et al. A mutation in the TRPC6 cation channel causes familial focal segmental glomerulosclerosis [J].Science,2005,308 (5729):1801-1804.
[6]Moller CC, Wei C, Altintas MM, et al. Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease [J].J Am Soc Nephrol.2007, 18(1):29-36.
论文作者:杜宇,王彩丽,王慧,李海涛
论文发表刊物:《中华临床医师杂志》(电子版)2016年2月第4期
论文发表时间:2016/7/14
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