董瑞
（成都市食品药品检验研究院 四川 成都 610041）
【摘要】 目的:建立番泻叶口服液的微生物限度检查方法。方法:测定番泻叶口服液对5种试验菌的回收率，确定适宜的检测方法，并对控制菌的检查方法进行验证。结果:采用常规法检查，供试品对5种试验菌的人工染菌回收率均高于70%。控制菌阳性对照菌生长良好。结论:此方法可用于番泻叶口服液微生物限度检查。
【关键词】 番泻叶口服液；微生物限度检查；方法验证
【中图分类号】R93 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）32-0393-03
Validation of microbial limit test method of folium sennaeDONG Rui Chengdu institute for drug control,Chengdu,610041,China
【Abstract】OBJECTIVE To establish a method for the microbial limit test of folium sennae .METHODS The inspection method was tested by determination of recovery rate of five different bacterial in folium sennae. And validation was performed on control bacterial. RESULTS The routine method was feasible according to the tset of five kinds of bacterial with recovery rate over 70%. The positive control bacterial grew well.CONCLUSION This method can be used for microbial limit testing of folium sennae.
【Key words】 folium sennae; microbial limit test; validation
番泻叶的主要成分是蒽醌类衍生物，有效成分番泻苷A、B吸收后分解成具有泻下活性的主要产物大黄酸茵酮[1-5]，直接兴奋骨盆运动神经节而使大肠收缩 ，加速肠蠕动，促进粪便排出；番泻总苷能改变细胞膜对离子的通透性，使水、钠吸收减少，通过增加肠腔内容积继而刺激肠壁反射性地使小肠和结肠的蠕动增强，从而产生腹泻作用[6]。
番泻叶口服液为口服给药制剂。按照《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查法标准规定，本品细菌数每1 mL不得过100 cfu，霉菌和酵母菌数每1 mL不得过100 cfu，大肠埃希菌每1 mL不得检出。本品在进行微生物限度检查时，应建立适合于本品的方法。为了确证方法的有效性，按《中国药典》2010年版要求，对番泻叶口服液微生物限度检查法进行了方法验证[7]。
1. 材料
1.1 仪器
洁净工作台（苏净集团安泰公司）、电热恒温水浴箱（上海医疗器械七厂）、隔水式恒温培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）、LRH 250 生化培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）
1.2 菌种
大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]，均来源于中国药品生物制品检定所，均为第4代培养物。
1.3 培养基及试剂
营养肉汤培养基 改良马丁培养基 营养琼脂培养基
改良马丁琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂培养基 胆盐乳糖培养基
0.9％无菌氯化钠溶液 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
以上培养基均由北京三药科技开发公司生产，按标签说明进行配制。
1.4 实验样品
番泻叶口服液（批号：131217 140225 140301）
2. 方法与结果
2.1 细菌数计数方法的验证
2.1.1常规法测定细菌数的方法验证
2.1.1.1菌液制备 取经35 ℃培养22 h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含50～100 cfu/mL的菌悬液，做活菌计数备用；
2.1.1.2供试液制备 取本品10 mL，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL，混匀得1:10供试液。
2.1.1.3回收率测定
2.1.1.3.1供试品对照组 取1:10供试液1 mL，平行制备2个平板，测定供试品本底细菌数；
2.1.1.3.2菌液组 分别取上述3种试验菌悬液1 mL，注入平皿，每株试验菌平行制备2个平皿，倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，测定所加的试验菌数。
2.1.1.3.3试验组 取1:10供试液1 mL和大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液1 mL，分别注入平皿中，倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，35 ℃培养3天，计数；
2.1.1.4结果：三次独立的平行试验结果如下表所示
试验组菌回收率：(试验组菌数-供试品对照组菌数)/菌液组菌数×100%。
由表1可以看出，本品采用常规法（1 mL/皿）检查细菌数，在三次独立的平行试验中，供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的人工染菌回收率均高于70%，因此，本品细菌计数可采用常规法（1 mL/皿）。
2.2 霉菌和酵母菌数计数方法的验证
2.2.1常规法测定霉菌和酵母菌数的方法验证
2.2.1.1菌液制备 取经25 ℃培养24 h的白色念珠菌改良马丁培养基培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含50～100 cfu/ml的菌悬液，做活菌计数备用；
取经25 ℃培养7 d的黑曲霉菌改良马丁琼脂培养基斜面培养物，加5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液（用管口带有薄的纱布的无菌毛细吸管吸出胞子悬液）至无菌试管中，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含50～100 cfu/ml的孢子悬液，做活菌计数备用。
2.2.1.2供试液制备 取本品10 mL，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL，混匀得1:10供试液。
2.2.1.3回收率测定
2.2.1.3.1供试品对照组 取1:10供试液1 mL，平行制备2个平板，测定供试品本底霉菌和酵母菌数。
2.2.1.3.2菌液组 分别取上述2种试验菌悬液1 mL，注入平皿，每株试验菌平行制备2个平皿，倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，测定所加的试验菌数。
2.2.1.3.3试验组 取1:10供试液1 mL和白色念珠菌、黑曲霉菌悬液1ml倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，25 ℃培养5天，计数。
2.2.1.4结果 试验组菌回收率：(试验组菌数-供试品对照组菌数)/菌液组菌数×100%
从表2可以看出，本品采用常规法检查霉菌和酵母菌数，在三次独立的平行试验中，供试品对白色念珠菌和黑曲霉的人工染菌回收率均高于70%，因此，本品霉菌和酵母菌计数可采用常规法（1 mL/皿）。
2.3 控制菌检查方法的验证
2.3.1大肠埃希菌检查方法的验证
2.3.1.1 供试液制备
取本品10 mL，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100 ml，混匀得1:10供试液。
2.3.1.2 菌液制备
取经35 ℃培养22 h的大肠埃希菌的营养肉汤培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至约含50～100 cfu/mL的菌悬液，做活菌计数备用；
2.3.1.3 常规法检查大肠埃希菌
2.3.1.3.1 试验组
取1:10供试液10 mL及制备好的大肠埃希菌悬液1 mL加入到100 mL的胆盐乳糖培养基中，35 ℃培养22小时。吸取0.2 mL培养物接种至5 mLMUG培养基中，35 ℃培养，于5小时、24小时在366 nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，观察颜色变化。
2.3.1.3.2 阳性对照组
取制备好的大肠埃希菌菌悬液1 mL加入到100 mL的胆盐乳糖培养基中培养，其他操作同2.3.1.3.1。
2.3.1.3.3 供试品对照组
取1:10供试液10 mL加入到100 mL胆盐乳糖培养基中，其他操作同 2.3.1.3.1。
2.3.1.3.4阴性对照组 取10 mL pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液加入到100 mL胆盐乳糖培养基中，其他操作同2.3.1.3.1。
2.3.1.3.5 结果
由表3可知，阴性对照组和供试品对照组中，紫外灯下观察和靛基质反应均呈阴性，而试验组加入大肠埃希菌培养后， 366 nm紫外下呈现荧光，且加入靛基质后，液面呈玫瑰红色，都和阳性对照组一样。因此，本品大肠埃希菌可采用常规法（胆盐乳糖培养基100 mL）进行检查。
3. 讨论
本品可采用常规法进行细菌计数、霉菌和酵母菌计数以及控制菌的检查。根据验证结果将微生物限度检查方法记录如下：取本品10 mL，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL，摇匀，得1:10供试液。细菌计数、霉菌和酵母菌计数以及控制菌均采用常规法进行检查（中国药典2010年版一部附录），应符合规定。
【参考文献】
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[6]沈映群．中药药理学[M]．北京：人民卫生出版社，2000：34
[7]国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京：中国医药科技出版社，2010：附录79．
论文作者:董瑞
论文发表刊物:《医药前沿》2015年11月第32期
论文发表时间:2016/5/6
标签：培养基论文; 氯化钠论文; 大肠论文; 本品论文; 酵母菌论文; 方法论文; 琼脂论文; 《医药前沿》2015年11月第32期论文;