1.长沙市中医医院肛肠科 湖南长沙 410100；2.湖南中医药大学第二附属医院肛肠科 湖南长沙 410005
【摘 要】目的：研究STC模型小鼠在白术七物颗粒剂干预下结肠组织c-kit改变情况，从而发现白术七物颗粒剂在治疗STC中的可能作用机制。方法：将112只小鼠随机分成空白组、模型1、2、3、4、5、6组，共7组，每组16只，雌雄各半。除空白组外，模型各组小鼠皮下注射盐酸吗啡2.5mg.kg-1.d-1，建立STC模型。STC小鼠模型建立成功后，剩余70只小鼠，雌雄各半，空白组不变，余60只小鼠随机分成模型组、白术七物颗粒剂低、中、高剂量组、麻仁软胶囊组、莫沙必利组，每组10只，雌雄各半。除空白组、模型组外，余各组给予相应的药物灌胃。应用RT-PCR、HE染色及免疫组化方法检测白术七物颗粒剂对STC模型小鼠结肠组织c-kit的分布和表达。结果：白术七物颗粒剂治疗组小鼠结肠组织中c-kit阳性表达细胞表达增加，分布相对较密集。平均光密度值增高。结论：白术七物颗粒剂通过增加STC小鼠结肠组织的c-kit含量治疗STC。白术七物颗粒剂治疗STC的作用机制是通过调节结肠组织中c-kit的含量来实现的。
【关键词】白术七物颗粒剂；STC模型小鼠；c-kit
慢传输型便秘（STC），亦称特发性STC，指结肠传输功能低下，内容物在肠腔传输缓慢所引起的便秘，主要表现为排便次数减少，便意减弱，甚至消失并伴有腹胀。STC属于功能性便秘的一种常见类型，约占慢性便秘患者的42.0%[1]。随着人们生活水平的提高，饮食习惯的改变，社会人口老龄化及精神心理因素等的影响，STC患者数量逐年上升，降低了人们的生活质量。该病目前发病机制不清，症状顽固，病程较长，故探讨STC的发病机制及有效治疗已成为近年来的研究热点。
导师何永恒教授经过多年潜心研究并结合大量的临床实践，组方白术七物颗粒剂，治疗便秘，有确切的临床疗效。通过观察白术七物颗粒剂对STC模型小鼠结肠组织中c-kit分布和表达影响，研究白术七物颗粒剂治疗STC的可能作用机制，为STC的中医中药治疗提供实验依据，为临床治疗提供理论参考。
1.实验材料
1.1实验动物
1.1.1造模期：ICR小鼠112只，SPF级，雌雄各半，体重18～22g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2011-0003；动物质量合格证编号：NO.43004700016427。饲养在湖南斯莱克景达实验动物有限公司动物实验中心SPF级实验室，温度20～26℃，相对湿度40%～70%，实验动物使用许可证号：SYXK（湘）2014-0012。适应实验环境1天，按性别、体重随机分为7组：空白组、模型组1、模型组2、模型组3、模型组4、模型组5、模型组6，每组16只，雌雄各半。
1.1.2给药期：验证造模成功后所剩的ICR小鼠70只，雌雄各半。空白组小鼠10只仍设置为空白组，模型各组60只小鼠，按体重、性别重新随机分为6组：模型组、白术七物颗粒剂低剂量组、白术七物颗粒剂中剂量组、白术七物颗粒剂高剂量组、麻仁软胶囊组、莫沙必利组，每组10只，雌雄各半。
1.2实验药品
盐酸吗啡注射液：1ml：10mg，东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号：150201-1。白术七物颗粒剂（槟榔、沉香、木香、乌药、生白术、生地黄、升麻）：湖南中医药大学第二附属医院提供。全方生药量125g。麻仁软胶囊：佛山手心制药有限公司（原阿特维斯（佛山）制药有限公司），批号：1507519。构穆酸莫沙必利片：成都康弘药业集团股份有限公司，批号：150413。生理盐水：100ml/袋，湖南康源制药有限公司，批号：150722201D 10。活性碳：长沙莱奥有限公司。TRIzol试剂：BIOMIGA。DEPC：Amresco。SYBR Green qRCR Mix、反转录试剂盒：GeneCoPoeia。三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇：上海生工生物有限公司。c-kit一抗、二抗：北京博奥森生物科技有限公司。DAB：北京博奥森生物科技有限公司。伊红、苏木素：湖南中医药大学形态实验室提供。
1.3实验器材
电子天平：长沙湘平科技有限公司，型号：ES-100E。滤纸：抚顺市东阳工贸有限公司，规格：60cm×60cm。立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂，型号：YXQ-LS-SⅡ。电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司，型号：101-1AB型。低温台式高速离心机：赫西仪器装备有限公司，型号：HR/T 16M。净化工作台：苏州净化设备有限公司，型号：SW-CJ-1D。电泳仪：北京六一，型号：DYY-2C。PCR仪：德国EPPendorf，型号：MASTERCYCLER。凝胶成像系统：上海天能，型号：Tanon 1600R。定量PCR仪：Life Technologies，型号：StePOne? Real-Time PCR System。电子恒温不锈钢水浴锅：上海南阳仪器有限公司，型号：HHS-2。自动双重纯水蒸馏器：上海亚荣生化仪器厂，型号：S2-93。石蜡切片机：中国浙江金华，型号：KD2258。电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司，型号：DNP-9162。显微摄像图像分析系统：麦克奥迪实业集团公司，型号：Motic B5。双目生物摄像显微镜：日本，型号：OLYMPUS BX43。
2.实验方法
2.1造模期：造模前：收集各笼中小鼠24h粪便，晾干称重，进行统计分析，比较在造模之前各组小鼠的粪便性状和重量是否存在差异。造模：STC小鼠模型的制备方法按许海尘[2]的文献报道进行，具体如下：模型小鼠皮下注射盐酸吗啡注射液，每天1次，每次2.5mg/kg，连续注射45天。隔日测量小鼠体重，根据体重调整注射剂量。空白组注射等量生理盐水。按Bristol分级观察各组小鼠粪便性状，以笼为单位隔日记录各组小鼠粪便重量。造模后：观察小鼠体征变化；观察小鼠粪便性状；测量小鼠24 h粪便干重；计算小鼠肠道推进率。
2.2给药期：验证模型成功后第二天开始灌胃给药。根据文献制定给药方法及剂量折算如下[3]。白术七物颗粒剂低剂量组：生药量16.3g/kg；白术七物颗粒剂中剂量组：生药量32.6g/kg；白术七物颗粒剂高剂量组：生药量65.2g/kg；麻仁软胶囊组：给药剂量为0.6mg/kg莫沙必利组：给药剂量为2.0g/kg。空白组和模型组按0.2ml/10g体重灌生理盐水。各组均按0.2ml/10g体重灌胃给药，连续给药14天，每日一次。隔日测量小鼠体重，根据体重调整灌胃剂量。观察各组小鼠粪便性状，隔日记录各组小鼠粪便重量。在给药期间，所有小鼠自由摄食与饮水。
2.3指标检测：将70只小鼠脱颈椎处死，取部分结肠组织3cm，纵向剪开，在预冷的生理盐水中清洗去除内容物。将结肠组织分成2段，每段约1.5cm，一段标本迅速放入液氮冷冻保存备用，一段标本放入装有固定液的小瓶中固定备用。应用RT-PCR、HE染色和免疫组化用于指标检测c-kit分布和表达。
2.4统计方法：采用SPSS17.0软件进行数据统计分析，实验数据均以表示，采用单因素方差分析和多重比较（P<0.05 具有统计学意义，P<0.01 具有高度统计学意义）。
3.结果
3.1造模期
3.1.1一般体征观察
112只小鼠无死亡；与空白组比较，模型各组小鼠活动较倦怠少动；模型各组小鼠饮食、小便、毛色正常，无显著差异。
3.1.2造模前、后体重
造模前，与空白组比较，模型各组小鼠体重无显著差异。经过45天造模，与空白组比较，模型各组小鼠体重未见明显减轻。
3.1.3造模前、后24小时排便重量
造模前，与空白组比较，模型各组小鼠24小时排便重量无显著差异（P＞0.05），无统计学意义，见表2。造模后，与空白组比较，模型各组小鼠大便明显干结，呈分离的硬团状或团块状粪便，排便粒数明显减少，排便重量明显减轻，有明显差异（P＜0.05），有统计学意义，见表1。
3.4 HE染色结果分析
光镜下切片定位观察：空白组小鼠结肠组织可见粘膜层、环肌层、纵肌层，基本保留纵肌层、环肌层、粘膜下层、部分粘膜层。神经元细胞光镜下观察呈椭圆形，胞质嗜碱，细胞核大。模型组小鼠结肠组织神经元细胞减少，同时见炎症细胞浸润粘膜层，评分为++或+++。各治疗组小鼠结肠神经元细胞明显恢复，结肠组织炎症细胞浸润减少，评分大部分为±或-。见图1-7。
3.5免疫组化分析
c-kit阳性细胞染色后胞浆中染色颗粒多呈浅棕色、棕黄色或棕褐色。模型组结肠组织中c-kit阳性细胞表达减少，分布稀疏，各治疗组结肠组织中c-kit阳性细胞表达呈不同程度的增加，分布密集。见图8-14。
4.讨论
STC的中医病机多数人认为表现在“气虚、阴虚”两方面，属于虚秘范畴。老年便秘“中气不足、阴亏血损”的病机曾在朱丹溪的《丹溪心法》中提出。针对此病因病机，根据《卫生家宝》的“降气”沉香四磨汤和名中医魏龙骧的“运下”白术汤，导师何永恒教授辩证分析得出“益气养阴、行气运下”法的代表方剂白术七物颗粒剂。具体用药为：生白术、槟榔、沉香、生地黄、木香、乌药、升麻共七味药。方中生白术为君药，益气健脾，用量最大；槟榔为臣药：消积降气；沉香为臣药：降气温中；生地黄为臣药：滋阴清热、养血生津；木香为臣药：健脾宽中，善行肠胃之气；乌药为臣药：行气温中。五药共助白术补脾益气。升麻为佐药，升举阳气。诸药配伍，使腑气得畅，脾滞得运，便秘自除，共奏“益气养阴、行气运下”之功。
Cajal间质细胞（ICC）[4]是可以产生慢波、调节神经递质及传导电兴奋的一类特殊细胞，主要位于胃肠道平滑肌和神经细胞之间，并且与胃肠运动关系密切。ICC的特异性标志物是胃肠道原癌基因 c-kit，它主要分布于细胞表面，结合其配体干细胞因子（Stem cell factor，SCF）后，造成磷酸化的效应分子引发细胞间信号的瀑布级链反应，继而调控多条信号通路，其中包含有磷酸肌醇-3激酶（PI-）等下游底物，最终使胞浆内的转录因子活化，从而调节基因表达并达到控制细胞增殖、分化和生长。
RT-PCR结果：与空白组比较，模型组c-kit含量显著降低（P＜0.01），有高度统计学意义。与模型组比较，白术七物颗粒剂低剂量、白术七物颗粒剂中剂量组、麻仁软胶囊组c-kit含量无显著差异（P＞0.05），无统计学意义；白术七物颗粒剂高剂量组c-kit含量显著升高（P＜0.01），有高度统计学意义；莫沙比利组c-kit含量明显升高（P＜0.05），有统计学意义。与白术七物颗粒剂高剂量组比较，白术七物颗粒剂低剂量组c-kit含量显著降低（P＜0.01），有高度统计学意义；白术七物颗粒剂中剂量组c-kit含量明显降低（P＜0.05），有统计学意义；麻仁软胶囊组、莫沙比利组c-kit含量无显著差异（P＞0.05），无统计学意义。见表3。
免疫组化结果：与空白组比较，模型组c-kit平均光密度显著降低（P＜0.01），有高度统计学意义。与模型组比较，白术七物颗粒剂低剂量、白术七物颗粒剂中剂量组、麻仁软胶囊组c-kit平均光密度无显著差异（P＞0.05），无统计学意义；白术七物颗粒剂高剂量组c-kit平均光密度显著升高（P＜0.01），有高度统计学意义；莫沙比利组c-kit平均光密度明显升高（P＜0.05），有统计学意义。与白术七物颗粒剂高剂量组比较，白术七物颗粒剂低剂量组、白术七物颗粒剂中剂量组、麻仁软胶囊组、莫沙比利组c-kit平均光密度无显著差异（P＞0.05），无统计学意义。
实验研究结果表明，白术七物颗粒剂治疗组小鼠结肠组织中c-kit阳性表达细胞表达增加，分布相对较密集。平均光密度值增高。白术七物颗粒剂通过增加ICC的c-kit含量，加快电兴奋传递，增强结肠运动，从而达到治疗STC的作用。
5.结论
白术七物颗粒剂通过增加ICC的c-kit含量，加快电兴奋传递，增强结肠运动，从而达到治疗STC的作用。
参考文献：
[1]Mugie SM，Benninga MA，Di Lorenzo C.Epidemiology of constipation in Children and adults：a systematic review[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol：2011，25（1）：3-18.
[2]许海尘，慢传输型便秘模型的建立及其机制探讨.医学研究生学报，2004，17（6）：502.
[3]陈奇.中药药理实验方法学[M].第二版.人民卫生出版社，2006：354.
[4]吴本升，陈玉根.慢性传输性便秘病理基础研究[J].长春中医药大学学报，2012，28（5）：824-825.
第一作者：
鲁海燕 长沙市中医医院肛肠科，湖南，长沙，410100
通讯作者：
何永恒 湖南中医药大学第二附属医院肛肠科，湖南 长沙，410005
基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号：81302977）湖南省自然科学基金资助项目（编号：13JJ3101）
论文作者:鲁海燕1,何永恒2（通讯作者）林仁敬2,徐胜艳2
论文发表刊物:《中国蒙医药》2017年4月第4期
论文发表时间:2017/4/24
标签：白术论文; 小鼠论文; 模型论文; 结肠论文; 颗粒剂论文; 统计学论文; 剂量论文; 《中国蒙医药》2017年4月第4期论文;