杨永健[1]2001年在《触发心肌细胞肥大的钙信号及信号转导特征研究》文中认为背景及目的：心肌肥厚是多种心血管疾病的共同病理过程，也是心力衰竭的重要结构基础，尽管致心肌肥厚的各种刺激因素不同，但是心肌肥厚的机制则相似，即细胞体积增大、蛋白合成增加、胚胎型心脏基因表达上调。最近Olson等报道，钙调神经磷酸酶（Calcineurin，CaN）作为细胞内Ca~(2+)敏感的信号物质，在心肌肥厚中起重要作用，其实验揭示心肌细胞内存在一条新的致心肌肥厚的信号传导通路，即CaN-NFAT_3（活化T细胞核因子）信号传导通路，如给予环孢菌素A（CsA），可通过抑制CaN活性消除心肌肥厚及改善心衰。心肌细胞内Ca~(2+)浓度（[Ca~(2+)]i）的变化主要受细胞外Ca~(2+)跨膜内流及内贮Ca~(2+)释放的调控，目前已认识到Ca~(2+)是胞浆内重要的第二信使，是多条信号传导通路的共同交汇点。蛋白激酶C（PKC）、丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）参与心肌重构的信号转导已成为人们的共识。本研究以原代培养的新生大鼠心肌细胞为模型，Angiotension（AngⅡ）刺激心肌细胞外Ca~(2+)内流和ryanodine（RY）刺激心肌细胞内贮Ca~(2+)释放，明确不同来源的细胞Ca~(2+)对其生长的影响，认识CaN信号通路在心肌细胞肥大中的发病学意义，阐明[Ca~(2+)]i对PKC、MAPK活性、ERK1/2蛋白表达、早期即刻表达基因和胚心标志基因的影响。 方法：以原代培养的乳鼠心肌细胞为模型，AugⅡ刺激细胞Ca~(2+)内流、RY刺激细胞内贮Ca~(2+)释放；~3H-TdR和~3H-leu掺入法反映心肌细胞核酸和蛋白合成速率；Fura-2/AM比率荧光成像系统分析细胞内Ca~(2+)信号变化；免疫细胞化学检测心肌细胞CaN、NFAT_3、C-fos、C-myc蛋白分布；Westernblot半定量分析心肌细胞CaN、NFAT_3、GATA_4、ERK1/2、α-actin、C-fos、C-myc蛋白表达；RT-PCR半定量分析β-MHC mRNA表达；γ－~(32)P标记底物测PKC、MAPK活性测定。 结果：主要研究结果如下： 1．Aug 11呈浓度依赖性（ 10‘～ 10”’mol／L）促心肌细胞 ［Ca’十］i增力，各刺激组［Cdh与对照组相比差异显着。RY呈浓度依赖性门”‘～10“mol／L）促心肌细胞Kahh增加，但RY在 10”’mol几水平时心肌细胞 K41i反而下降，与正常对照组相比差异显着，说明此时RY处于半失活状态。 2．Aug 11可使无血清培养新生大鼠心肌细胞勺毛eu掺入率随时间增加而增加，与对照组相比差异显着，且在10”‘～10－’mol／L范围内呈量效依赖关系；RY在 10”‘～10“ m＊／L时刺激心肌细胞勺毛eu掺入量增加呈量效依赖关系，但 10”’mol／L时降低。Aug 11可促进无血清培养新生大鼠心肌细胞’H－TdR掺入率，且在 10”’～10”’mol／L范围内呈量效依赖关系；RY在 10－‘～10－‘mol凡时，心肌细胞’H1dR掺入量增加呈量效依赖关系，10“’mol／L时则降低。应用CaN特异抑制剂CsA后观察到，CsA可抑制’H．Leu和‘H刊R掺入，且在50～20oUg几浓度范围内呈量效依赖关系。 3．CaN主要表达于正常心肌细胞胞浆，核膜周围亦可见明显表达，Aug 11、RY刺激 24 h时，CaN除表达于心肌细胞胞浆外，细胞核明显着色深染，核膜周围表达更明显。Aug 11、RY刺激心肌细胞 24 h、2 d时厂aN蛋白表达明显增加，各刺激组与对照组相比差异非常显着。 4．NFAT。表达于正常心肌细胞的胞浆及胞核，在Aug 11、RY＊”’mol／L）刺激 24 h时主要表达于心肌细胞核。Aug 11、RY刺激心肌细胞 24 h、2 d时，NFAT；蛋白表达明显增加，各刺激组与对照组相比差异非常显着。 5．CsA可明显抑帘 Aug 11（10”’mol／L）刺激的心肌细胞 CaN、NFAT。、GATA4表达增加。同样，CsA可明显抑制 RY （l”’mol／L）刺激的心肌细胞CaN、NFAT。、GATA。表达增力。 6．钉红（Ru） （ 0”’mol／L）阻断心肌细胞内＊”释放，能显着抑制 CaN蛋白表达，与对照组相比差异非常显着P＜0刀1＼硝苯唆（NI 门‘’OOI／L）刺激组CaN蛋白表达与对照组相比差异无显着性。 7．Aug 11、RY （ 0”’mol几）刺激心肌细胞 5 min时 MAPK活性明显增加，15 min时 MAPK活性增至最高水平，30 min时又下降，各刺激组与对照组相比差异非常显着。大鼠心肌细胞表达两种Eng蛋白同型体： ·Vll· ／ t”：。ERKI和 EngZ，其分子量为 42KD和 44KD。Aug 11、RY刺激心细胞 24 h时，ERKIo蛋白表达量明显高于对照组。Angll、RY刺激心肌细胞 5 min时 PKC活性明显增加，15、30 min时，PKC活性逐渐下降，各刺激组与对照组相比差异非常显着。 8．Angllllo”’mol儿帅激心肌细胞10 min时，c－pc、c－fos蛋白主要表达于胞浆；刺激 30 min时，c－myc、c－fOS蛋白主要?
赵灿, 吴永全[2]2017年在《心肌细胞钙信号与心血管疾病研究进展》文中研究说明Ca~(2+)作为一种最广泛而又最重要的细胞内第二信使参与了各种细胞的病理生理过程。在心肌细胞的收缩、舒张过程中,每一次的兴奋一收缩耦联都伴随着细胞内Ca2+浓度改变,这种浓度变化的时间及空间效应形成了心肌细胞内的钙信号。由于Ca~(2+)在生物体内具有十分重要的地位及作用,钙信号的调节机制是非常复杂的,钙信号与心血管疾病密切相关。1钙信号的基本特征钙信号有多种表现形式,如钙火花、钙瞬变、钙波、钙空穴、钙星。钙火花是钙信号的基本单元,是指心肌细胞
董世山[3]2003年在《细胞钙信号转导与肉鸡腹水综合征发生发展的关系》文中研究表明本试验旨在探讨钙信号转导与肉鸡腹水综合征(AS)发生发展的关系，阐明AS发病机理。为此进行如下试验： 1．采用贴块法、酶消化法及差速贴壁法培养鉴定肉鸡心肌细胞(CMC)和肺动脉平滑肌细胞(PASMC)。培养细胞α-actin抗原染色阳性率分别在95％以上，表明已获得高浓度的两种细胞培养物。 2．用原子吸收分光光度法测定右心室壁总钙，结果显示AS患鸡右心室壁总钙含量(71.2±6.5mg/kg)显着高于低温处理和健康肉鸡(分别为58.0±4.4，46.8±3.1，P＜0.01)。利用焦锑酸钾组化电镜技术，观察心肺组织细胞内Ca~(2+)含量和分布。发现Ca~(2+)颗粒主要散在分布于心肌胞浆、肌浆网、线粒体和肺小动脉中膜平滑肌细胞。AS患鸡Ca~(2+)颗粒的沉积量比健康肉鸡显着增多。 心肌组织总钙的增加及Ca~(2+)沉淀颗粒在CMC胞浆和肺小动脉中膜SMC的大量沉积的结果从在体水平表明Ca~(2+)信号转导异常可能与AS的发生相关。 3．以Fluo-3/AM为Ca~(2+)指示剂，在细胞外液有或无Ca~(2+)的条件下，利用Kcl、去甲肾上腺素、AngⅡ、咖啡因等工具药研究CMC和PASMC的Ca~(2+)通道。在激光共聚焦显微镜(LSCM)下观察发现，不同的Ca~(2+)通道激动剂能够使CMC和PASMC内Ca~(2+)显着升高。 本试验证明肉鸡CMC和PASMC具有电压门控、激动剂-受体门控、IP_3R和RyR等Ca~(2+)通道。 4．缺氧条件下，用LSCM观察Ca~(2+)的跨膜转运。结果显示，与常氧组比较缺氧显着引起CMC内Ca~(2+)升高(常氧99.3±13.1；缺氧129.4±24.3，p＜0.01)，但钙通道拮抗剂Verapamil(Ver)和Nifedipine(Nif)可显着抑制缺氧引起的Ca~(2+)升高(缺氧+Ver 100.9±28.2，缺氧+Nif 107.6±27.7)。 同时缺氧显着引起PASMC内Ca~(2+)升高(常氧95.0±14.6；缺氧152.6±21.9，p＜0.01)，但Ver、Nif具有显着抑制作用(缺氧+V 92.7±14.8；缺氧+N 118.2±21.8)。 缺氧是AS的主要诱因，CMC和PASMC的肥大增殖是AS的主要环节。缺氧增强CMC和PASMC的Ca~(2+)跨膜转运，从细胞水平提示钙信号转导与AS的发生发展密切相关。 5．利用免疫组化、原位杂交、图像分析研究钙信号与缺氧引起细胞癌基因c-fos、c-myc转录表达的关系。结果显示，缺氧显着引起CMC内癌基因的转录表达(c-fos蛋白：常氧159.1±37.1，缺氧240.3±49.6；c-myc蛋白：常氧149.6±24.9，缺氧236.3±55.4；c-fos mRNA：常氧149.6±22.4，缺氧205.4±57.6，P＜0.01)。Ver、Nif、环孢素A显着抑制缺氧引起的癌基因的表达(c-fos蛋白：缺氧+V 165.2±52.2，缺氧+C 190.8±33.6，缺氧+N 166.5±49.8；c-myc蛋白：缺氧+V 178.9±42.1，缺氧+C 164.8±49.5，缺氧+N 174.4±36.3；c-fos mRNA：缺氧+V 151.3±20.1，缺氧+C 166.5±22.1，缺氧+N 154.5±25.2)。 缺氧显着引起PASMC内癌基因的转录和表达(c-fos蛋白：常氧150.9±33.2，缺氧225.9±37.0；c-myc蛋白：常氧162.1±28.5，缺氧228.8±33.4；c-fos mRNA：常氧144.6±20.2；川二人 ＊SI工uS，！‘＜O01）。Ve。、一厂、环泡票八显＃抑制缺氧引起的癌基因表达（c－忆s茁R：缺氧干＼比2．3土“．6，缺氧＋CI引．6上37．3，缺氧上卜1574土兆．9：c－。几蛋白：缺于＼5＼！ 170 2＝2（．7，缺氧4C 179．l士29 2，缺氧十N 170．TteZS．5；c－fos mRNA：缺氧＋V 161工H1，缺氧一CI”．Odis，缺氧十＼IT｝7土x．引。 环抱索A可显柠抑制缺氧引起的癌基冈的转录表达，表明钙信号转导系统中的Ca‘丫CaM－CaN转导通路在 CMC肥大和 PASMC增殖过程中尺有巫要作川。钙信号转导激活引起伽C和 PASMC肥大增殖的癌基囚 C－fOS和 C－。yC的转录表达，从癌基囚表达水平表明钙信号通路可能与 AS的发生发展密切相关。 总之，本试验首次从在体、细胞利癌基回转录表达等方面，探讨了钙信号系统与AS的发生发展的关系，表明钙信号系统在AS发病过程中可能具有重要作用。
周红敏[4]2009年在《黄芪苷Ⅳ对血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌细胞肥大保护作用的研究》文中研究表明目的:研究黄芪苷Ⅳ(AstragalosideⅣ,AST)对血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)诱导新生大鼠心肌细胞肥大的保护作用并探讨其作用机制。方法:心肌细胞常规培养72h,换无血清培养基同步化24h后,分别加入不同药物孵育72h。实验分6组:①正常对照组(Control):DMEM-F12培养基;②模型组(AngⅡ):AngⅡ10~(-7)mol/L;③AST 10组:AST 10mg/L;④AST 20组:AST20mg/L;⑤AST 10+AngⅡ组:同时加入AST 10mg/L和AngⅡ10~(-7)mol/L;⑥AST20+AngⅡ组:同时加入AST 20mg/L和AngⅡ10~(-7)mol/L。采用图像分析系统测定细胞直径大小;考马斯亮蓝法测定细胞总蛋白含量;pNPP酶法测定心肌细胞肌浆网钙泵(Sarcoplasmic reticulum Ca~(2+)-ATPases,SERCA)活力;Fura-2/AM标记,荧光分光光度计测定心肌细胞内[Ca~(2+)]_i;定磷法测定钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)活性。结果:1.细胞直径:与Control组比较,AST 10、AST 20两组细胞直径的增加无统计学差异(P＞0.05),AngⅡ组的细胞直径显着增加(16.1±1.1 vs 11.1±1.0μm,P＜0.01),AST 10+AngⅡ组心肌细胞直径增加(12.8±1.0 vs 11.1±1.0μm,P＜0.01)、AST 20+AngⅡ组心肌细胞直径增加(12.4±0.9 vs 11.1±1.0μm,P＜0.01);与AngⅡ组相比,AST 10+AngⅡ组与AST 20+AngⅡ组的细胞直径分别减小(12.8±1.0 vs16.1±1.1μm,P＜0.01)、(12.4±0.9 vs 16.1±1.1μm,P＜0.01)。2.细胞总蛋白含量:与Control组比较,AST 10、AST 20两组的细胞总蛋白含量的增加无统计学差异(P＞0.05),AngⅡ组的细胞总蛋白含量明显增加(146.3±25.2 vs 95.9±20.5μg/well,P＜0.01),AST 10+AngⅡ组心肌细胞总蛋白含量增加了(121.1±23.6 vs 95.9±20.5μg/well,P＜0.05),AST 20+AngⅡ组心肌细胞总蛋白含量的增加无统计学差异(P＞0.05);与AngⅡ组相比,AST 10+AngⅡ组与AST 20+AngⅡ组的细胞总蛋白含量分别减少(121.1±23.6 vs 146.3±25.2μg/well,P＜0.01)、(114.1±18.0 vs 146.3±25.2μg/well,P＜0.01)。内[Ca~(2+)]_i的升高无统计学差异(P＞0.05),AngⅡ组的[Ca~(2+)]_i显着升高(283.9±40.7vs 150.6±27.1nmol/L,P＜0.01),AST 10+AngⅡ组的心肌细胞内[Ca~(2+)]_i升高(204.8±33.9 vs 150.6±27.1nmol/L,P＜0.01),AST 20+AngⅡ组的心肌细胞内[Ca~(2+)]_i升高(194.9±34.7 vs 150.6±27.1nmol/L,P＜0.05);与AngⅡ组相比,AST 10+AngⅡ组与AST 20+AngⅡ组的细胞内[Ca~(2+)]_i分别降低(204.8±33.9 vs 283.9±40.7nmol/L,P＜0.01)、(194.9±34.7 vs 283.9±40.7nmol/L,P＜0.01)。4.SERCA活力:与Control组比较,AST 10、AST 20两组SERCA活力的降低无统计学差异(P＞0.05),AngⅡ组的SERCA活力显着下降(0.83±0.20 vs2.07±0.45μmol/min·g pro,P＜0.01),AST 10+AngⅡ组心肌细胞SERCA活力下降(1.29±0.23 vs 2.07±0.45μmol/min·g pro,P＜0.01),AST 20+AngⅡ组心肌细胞SERCA活力下降(1.42±0.37 vs 2.07+0.45μmol/min·g pro,P＜0.01);与AngⅡ组相比,AST 10+AngⅡ组与AST 20+AngⅡ组的SERCA活力均升高(1.29±0.23 vs0.83±0.20μmol/min·g pro,P＜0.01)、(1.42±0.37 vs 0.83+0.20μmol/min·g pro,P＜0.01)。5.CaN活性:与Control组比较,AST 10、AST 20两组CaN活性的升高无统计学差异(P＞0.05),AngⅡ组的CaN活性明显增加(0.490±0.080 vs0.297±0.072μmol/mg pro,P＜0.01),AST 10+AngⅡ组心肌细胞CaN活性升高(0.385±0.089 vs 0.297±0.072μmol/mg pro,P＜0.05),AST 20+AngⅡ组心肌细胞CaN活性的升高无统计学差异(P＞0.05);与AngⅡ组相比,AST 10+AngⅡ组与AST 20+AngⅡ组的CaN活性分别升高(0.385±0.089 vs 0.490±0.080μmol/mg pro,P＜0.05)、(0.355±0.085 vs 0.490±0.080μmol/mg pro,P＜0.01)。结论:本文首次报道AST对AngⅡ诱导心肌细胞肥大有明显的保护作用,其作用机制可能与提高SERCA活力,降低细胞内[Ca~(2+)]_i,抑制钙超载有关。本文还首次报道AST对AngⅡ诱导心肌细胞肥大保护作用的机制可能与其降低心肌细胞CaN的活性,抑制Ca~(2+)-CaN信号转导通路有关。
米春娟[5]2004年在《运动对大鼠心传导系统形态学、心肌细胞钙变化特征的动态研究》文中进行了进一步梳理运动过程中，心脏机械力学的变化具有潜在致心律失常的作用，产生这种作用的生物学基础尚未完全阐明，但有肯定的证据说明人类心脏存在机械—电反馈作用。临床观察发现，心肌肥厚、心脏扩大的患者容易发生心律失常，目前对于运动性心肌肥大的大量实验已经证明运动过程中会产生心肌肥厚及心脏扩大，在运动临床诊断中，运动性心律失常时有发生。因此推测，运动尤其是大强度或力竭性运动存在着潜在致心律失常作用。窦房结是心脏的起博点，它控制着整个心脏节律性收缩，因此心脏产生心律失常可能与窦房结形态与功能变化有关；钙离子是心肌细胞内重要的第二信使，它的变化与心律失常关系密切。本研究试图从心脏的窦房结细胞形态与心肌细胞钙离子调控观察入手，揭示不同强度运动对大鼠窦房结形态结构、心肌细胞钙离子调控与运动心脏相关的免疫组织化学指标的影响，为运动性心律失常的研究及防治提供理论依据和参考。 3月龄雄性SD大鼠(由西安交通大学医学院动物管理中心提供)48只，体重248±24g,国家标准啮齿类动物干燥饲料喂养，自由饮食，温度17℃-23℃，湿度40％-60％。适应性喂养一周后进行实验。将大鼠随机分为3组：正常对照组，有氧训练组和大强度疲劳组。适应训练：动物适应喂养1Week,后开始训练，采用递增强度的方式进行跑台运动，起始速度为15m/min，时间为20min。运动负荷参照Bedford的研究进行(1979)。对照组：正常笼内生活状态，不运动。有氧训练：训练频率为5d/week，递增速度3m/min、时间5min，运动至速度为20m/min，时间为60min后增加跑台坡度为5％。疲劳训练：训练频率为6d/week，递增速度3m/min、时间5min，运动至速度为35m/min，时间为60±10min后增加跑台坡度为10％。整个训练过程可用电刺激来强迫大鼠进行跑台训练(电刺激＜1mA)，训练过程共持续8Weeks。将所有动物在第8Week训练完后次日进行心电图测试，之后依次分别进行光镜取材、电镜取材及免疫组化的取材。其中用于电镜观察的材料取出后迅速置于2.5％的戊二醛中；用于光镜观察和免疫组化的材料放入4％的多聚甲醛中进行固定。剩余的大鼠继续训练一天，并于第二天进行细胞分离，将不同训练组大鼠的心肌细胞分别分为2大组:加Fluo一3从M和加STDBT组，每一大组再分为2小组:(l)心肌细胞+异丙肾上腺素;(2)心肌细胞+盐酸维拉帕米+异丙肾上腺素;分别进行钙荧光强度测定。将培养皿置于ACAS57O载物台上，在激光共聚焦显微镜下动态扫描细胞内荧光强度变化(激发波长488lun，发射波长522nln，采样频率488Hz)共聚焦系统由Bio一Red公司提供的软件控制，在Pentium90计算机中运行，每皿选2一3个视野，以平均荧光强度(IF)变化表示细胞游离钙浓度([C扩+]i)的相对水平。对所有实验数据运用51脚即lot seientifie Granhing system进行T检验。实验结果以均数士标准差(X士SD)表示。 实验结果发现: 1.不同强度训练对大鼠体重增长无不良影响，有氧及疲劳训练增加大鼠心重/体重，提示不同强度训练可诱导大鼠心脏发生不同程度的心肌肥大。 2.有氧训练组大鼠心电图各项指标与安静对照组大鼠无显着性差异，说明有氧训练对心脏功能的影响是良性的，而疲劳训练组大鼠心电图与安静对照组比较出现明显异常，表明疲劳训练对心功能的影响除了心肌结构发生变化外，其心肌电生理活动也受到不同程度的影响。 3.大鼠在参加不同强度训练后，PC、TC不仅数量上趋于减少，单位面积内出现机率减少，而且细胞形态、胞质成分、核内染色质等均发生了显着变化。 4.在安静对照组和有氧训练组的心肌细胞内，核钙的荧光强度明显高于胞体的荧光强度，有氧训练组大鼠心肌细胞的核钙荧光强度明显低于安静对照组，提示有氧训练可能对心肌细胞核钙的摄取及释放起到影响作用。 5‘安静组加入维拉帕米后，钙离子浓度明显高于有氧训练组，说明有氧训练组大鼠的L一型钙通道丰度和功能明显降低，随着异丙肾上腺素的加入，有氧训练组大鼠的心肌钙荧光强度进一步下降，说明其细胞内肌浆网的“钙诱导释放(ClcR)机制”能力有所下降。 6.大鼠参加8周的有氧训练后，心肌血管内皮生长因子阳性表达显着增强，而大强度训练对大鼠心肌毛细血管无显着影响。 7.大鼠在参加不同强度训练后，神经型一氧化氮合酶在心肌细胞的表达均显着升高;诱导型一氧化氮合酶在心肌细胞的表达均显着高于安静对照组;有氧训练使心肌细胞内皮型一氧化氮合酶活性增强，但大强度训练使其活性逐渐下降。 8.有氧训练组和大强度训练组大鼠心肌中核转录因子(N’F.Kbp65)活性明显低于安静对照组。 9.有氧运动可导致心肌Bax蛋白表达量增加，Bcl一2蛋白的表达量减少，Bax/Bcl一2比值增加，引起细胞凋亡;大强度运动组大鼠心肌细胞的Bax与Bcl一2蛋白的阳性表达情况均与安静对照组无显着差异性。提示细胞凋亡可能参与了心肌肥厚早期的形成过程。 10.在有氧训练大鼠中，窦房结细胞的Bcl一2和Bax蛋白的阳性表达明显低于安静对照组，而大强度训练组大鼠的窦房结细胞中Bd一2蛋白的阳性表达也明显低于安静对照组，却显着高于有氧训练
丁文文[6]2015年在《虎杖苷通过调控钙稳态和Calcineurin/NFAT3信号通路抑制心肌肥大》文中进行了进一步梳理研究背景：心肌肥厚以心肌细胞蛋白合成增加和细胞体积增大为主要特征,是心脏功能从代偿期向失代偿期演变,心脏结构从可逆性改变向不可逆性改变发展的关键阶段,是心力衰竭的重要病理生理基础。虽然一定程度的心肌肥厚可以减轻室壁压力,帮助心肌代偿性适应增加的压力负荷,但是细胞内持续的促肥厚信号刺激是导致心衰进展的主要不利因素。迄今为止,已经发现多种信号通路参与心肌肥大的发生。其中,钙调控的信号通路在病理性的肥大的发展中,伴有十分重要的作用,因此,调控心肌的钙信号可以治疗心肌肥厚。心肌的钙稳态是钙蛋白相互调控作用的结果。在收缩期,心肌细胞膜去极化时,L型钙通道激活,胞外的少量的钙经由钙通道进入胞内,触发肌质网(SR)释放更多的钙,使胞浆钙浓度升高,引起心肌的收缩。在舒张期,胞浆高浓度的钙能迅速的回收到肌质网,主要是通过肌细胞膜上的钙泵,钠/钙交换体,以及肌质网钙泵实现。钙通道阻滞剂能够抑制L-型钙通道活性,临床上已经证明,在多中动物模型中均可以治疗心肌肥大,然而,由于心肌收缩对钙的依赖性,钙拮抗剂具有抑制心肌收缩力、降低心脏功能的作用,而且,阻滞非心肌钙通道能引起多种副作用,如低血压,便秘,水肿等,因此,研发摒除上述缺点的有效抗心肌肥大的新药一直是该领域研究的热点。虎杖苷(Polydatin, PD)是从中药虎杖中提取出的单体,分子结构为3,4',5叁羟基芪-3-β-单-D-葡萄糖苷,又名白藜芦醇苷。2010年,Gao JP et al首次报道了,虎杖苷能够通过抑制神经激素而减少心肌肥大和心肌重构,那么,在体实验虎杖苷是否具有直接的对抗心肌肥大作用或者是否能够延缓心衰的进程,我们不得而知。最近的研究表明,虎杖苷能调控钙稳态和心肌收缩,在急性刺激的成年大鼠心肌细胞上,虎杖苷能显着性的降低收缩期的钙瞬变,令人有趣的,虎杖苷能轻微的增加心肌的收缩力而不是降低,因此我们提出假设,虎杖苷能够抑制肥大刺激所引起的钙信号的上调而具有抗心肌肥大的作用,同时并不影响心肌收缩力。已有文献报道,虎杖苷没有改变正常动物的血压和体循环血流动力学,如果假设是正确的,那么有理由猜测虎杖苷是非常理想的治疗心肌肥大的药物。因此,本研究以苯氧肾上腺素所诱导的乳鼠心肌细胞肥大和主动脉缩窄所诱导的成年小鼠肥大为模型,研究虎杖苷治疗心肌肥大的效果,更进一步探讨,虎杖苷是否是通过钙稳态和心肌收缩,钙调蛋白所调控的钙调神经磷酸酶(Calcineurin)-T细胞核因子(NFAT)信号通路起作用的,这个信号通路已经被证实在多种病理性心脏肥大中具有十分重要的作用。本文集中研究,不管是在体还是离体,虎杖苷是通过抑制钙信号和钙调神经磷酸酶-T细胞核因子来降低心肌肥大的发生。目的：本文以苯氧肾上腺素所诱导的乳鼠心肌细胞肥大和压力负荷所诱导的成年小鼠肥大为出发点,首先探讨虎杖苷能否介导抑制苯氧肾上腺素心肌肥大和主动脉缩窄诱导的心肌重构；其次,研究虎杖苷对钙信号和心肌收缩的影响；最后,从细胞信号转导的角度讨论虎杖苷是否通过作用于Calcineurin/NFAT信号通路抑制心肌肥大。方法：1实验方法1.1实验分组设计离体实验,分别设立对照组(Con),虎杖苷单独作用组(PD),苯氧肾上腺素组(PE),苯氧肾上腺组+虎杖苷(PE+PD),白藜芦醇单独作用组(RV),苯氧肾上腺组+白藜芦醇(PE+RV),苯氧肾上腺组+硝苯地平(PE+Nife),苯氧肾上腺组+虎杖苷+硝苯地平(PE+PD+Nife),苯氧肾上腺素组+他克司莫(PE+FK506),苯氧肾上腺组+虎杖苷+他克司莫(PE+PD+FK506),检测不同的基因蛋白表达。在体实验,分别设立假手术组(Sham),主动脉缩窄手术(TAC),虎杖苷单独作用组(PD),主动脉缩窄+虎杖苷(TAC+PD)。1.2心肌肥大基因的表达以及心脏功能的测定离体部分,分离乳鼠心肌细胞,饥饿24h, PE (20μmol/L), PD(乙醇溶解,50μmol/l)刺激72h。Western blot检测各组ANP和β-MHC的表达,以及心肌细胞面积。在体部分,采用小动物超声对小鼠不同时间点的心脏结构和功能进行评估,其中PD组(β-环糊精溶解,PD用量50mg/kg/day),术后一周开始灌胃,直到13周结束,TAC+PD(β-环糊精溶解),术后一周开始灌胃直到13周结束。1.3心肌肥大钙信号的测定应用Zeiss LSM-780倒置共聚焦显微镜系统检测PD对乳鼠心肌细胞以及成年小鼠心肌细胞钙信号的影响,包括各组收缩,钙瞬变(AF/Fo), T50(钙瞬变半衰期),rise time(钙瞬变达到峰值的上升时间)。1.4心肌肥大Calcineurin-NFAT3信号通路活性与蛋白的测定应用试剂盒检测Calcineurin活性,Western Blot检测Calcineurin蛋白表达以及NFAT3核转移情况。结果：第一部分：虎杖苷抗心肌肥厚作用(一)离体实验PD抗心肌肥厚作用1、PD减少ANP和β-MHC蛋白表达我们首先观察了,不同处理组对细胞ANP和β-MHC蛋白水平的影响,结果显示,各组之间的ANP和β-MHC蛋白水平均有显着性差异(F值分别为6.259、13.728；P值分别为0.017、0.002)。与Control组相比,PE组心肌细胞ANP (ANP/β-actin:1.00±0.00 vs.1.96±0.42, P=0.017)和β-MHC (β-MHC/β-actin: 1.00±0.00 vs.2.22±0.35, P= 0.002)的表达水平显着上调,而PE+PD组可以部分抑制上述两种基因的表达水平(P<0.05-0.001)。细胞面积测定结果显示：与PE(1914.62±530.47)组相比,PE+PD组心肌细胞面积(1475.80±483.27)显着降低。2、PD和RV抗心肌肥厚作用比较不同处理组对细胞β-MHC的mRNA水平,ANP和β-MHC蛋白水平的影响,结果显示,各组之间的β-MHC的RNA水平ANP和β-MHC蛋白水平均有显着性差异(F值分别为6.206、4.126、9.319；P值分别为0.005、0.021、0.001)。与对照组相比,β-MHC的RNA水平增加到1.99±0.35(P<0.01)。PD(50μM)和RV (25μM)单独处理组对β-MHC的RNA水平无显着趋势。而PE+RV降低为1.42±0.26(vs PE, P<0.05), PE+PD组降低为1.43±0.35(vs PE, P<0.05)。而PE+RV组和PE+PD组两组间无差异(P>0.05)。其次,与对照组相比,ANP的蛋白水平增加到1.99±0.34 (P<0.01), PD (50μM)和RV(25μM)单独处理组对ANP的蛋白水平无显着趋势。而PE+RV降低为1.36±0.23(vs PE,P<0.05), PE+PD组降低为1.24±0.39(vs PE, P<0.05)。而PE+RV组和PE+PD组两组间无差异(P>0.05)。与对照组相比,PE组β-MHC蛋白水平增加到2.22±0.35 (P<0.01), PD (50μM)和RV (25μM)单独处理组对β-MHC的蛋白水平无显着趋势。而PE+RV降低了1.70±0.39(vs PE, P<0.05), PE+PD组降低到1.68±0.30(vsPE,P<0.05)。而PE+RV组和PE+PD组两组间无差异(P>0.05)。但PE+RV组与对照组比较,P<0.05, PE+PD与对照组比较,P<0.05,都具有显着差异。(二)在体实验PD抗心肌肥厚作用1、PD抑制心肌重构我们观察了5w、13w小鼠的LVPWs和LVPWd,结果显示,在5w、13w时,各组间的LVPWs数值具有显着差异(F值分别为20.797、15.915；P值分别为0.000、0.000)。各组间的LVPWd数值具有显着差异(F值分别为11.234、11.359；P值分别为0.000、0.001)。与同时期的Sham组相比较,TAC组的LVPWs和LVPWd显着增加,而PD处理能够显着的抑制增高的后壁厚度。同样的,与Sham组比较,在5w时,TAC组的LVIDs和LVIDd显着减小,13w时显着增大,而PD处理后,与TAC比较,TAC+PD组,5w时能显着的抑制心腔的缩小,13时能显着的抑制心腔的扩大。2、PD改善心功能我们观察了不同时间点各组的LVFS和EF。结果显示,5w、13w时,LVFS各组间有显着性差异(F值分别为7.948、12.597；P值分别为0.000、0.000)。EF各组间有显着性差异(F值分别为6.180、11.228；P值分别为0.008、0.001)。与Sham (30.69±3.93)相比,TAC组5w时,LVFS增高为44.11±6.09,P<0.01,与Sham组(52.94±4.23)比较,EF增高为71.99±5.78,P<0.01,有显着差异。在13w时,二者显着低于Sham,其中,LVFS降低为21.36±4.48 (vs sham 32.94±1.69),P<0.01,有显着差异。EF降低到38.00±7.12 (vs sham,54.25±2.48),P<0.01,有显着差异。PD处理后,与Sham比较,5w时,TAC+PD组,LVFS和EF平稳的增加,P>0.01,无统计学意义。而13w时,PD处理后,TAC+PD组远没到失代偿阶段,与TAC比较,TAC+PD组的LVFS增高到34.45±4.11,P<0.01,具有统计学差异,而EF增高到56.93±5.27,P<0.01,差异显着。而PD单独处理组,与Sham比较,无显着差异。3、PD抑制心肌肥厚小鼠HW/BW我们在13w,观察了不同处理组对小鼠的HW/BW的影响,结果显示不同处理组间具有显着性差异(F值为0.000；P值为21.143)。相比于Sham(0.504%±0.01%)组,TAC组的HW/BW也是显着增高到0.627%±0.04%,P<0.01而PD治疗后,与TAC组比较,TAC+PD组心重体重比下降到0.549%±0.03%,P<0.01,但TAC+PD组与Sham组比较,升高了8.9%,P值小于0.01。4、PD抑制心肌肥厚小鼠ANP和β-MHC表达在13w提取各组的组织蛋白,检测观察了不同处理组对小鼠的ANP和β-MHC蛋白表达水平,结果显示不同处理组ANP和β-MHC蛋白表达水平具有显着差异(F值分别为9.396、62.264；P值分别为0.013、0.000)。相比于Sham(1.00±0.00)组,TAC组小鼠心肌ANP和β-MHC的表达水平显着上调,ANP升高到2.32±0.55, P<0.01, p-MHC增高到2.92±0.29,P<0.01,而TAC+PD组可以部分抑制上述2种基因的表达水平。与TAC组比较,TAC+PD组的ANP降低为1.48±0.50 (vs TAC,2.32±0.55), P<0.05, β-MHC降低为1.89±0.30(vs TAC,2.92±0.29), P<0.01,其中,与Sham组比较,TAC+PD组的P-MHC显着增加,P<0.05。第二部分：虎杖苷对心肌钙信号的作用1、PD对乳鼠心肌钙信号的影响在培养的NRVMs上,我们检测了各种处理对钙信号的影响,包括△F/Fo, rise time, Tso,结果显示,各组间均有统计学差异。其中△F/Fo, rise time, T50分别为13.18、6.898、12.453；P值分别为0.000、0.000、0.000)。与Con(4.52±1.18)比较,PE刺激能使AF/Fo增高到6.32±2.12 (vs con,4.52±1.18), P<0.01, SR回收Ca2+的时间(钙瞬变半衰期,T50)、显着延长为170.13±48.42 (vs con,137.63±20.52),P<0.01。此外持续性的PE刺激,导致钙瞬变的上升时间(rise time)显着增加到74.29±27.9 (vs con,53.13±18.49), P<0.01, PD单独处理组使正常细胞钙瞬变有下降的趋势,P>0.05,无统计学意义。但是,与PE组相比,PE+PD (4.86±1.47)组能显着降低PE所诱导增加的钙瞬变(vs PE, P<0.01),与PE组相比,PE+PD组的rise time和T50的分别降低为143.54±17.83,P<0.05,和57.344±18.07,P<0.05,差异均具有统计学意义。2、PD对成年小鼠心肌钙信号的影响在5w时,我们分离个成年小鼠单个细胞,检测PD对钙信号的影响,包括△F/F0,Shortening, T50,方差分析结果表明,各组间分别具有差异(F值分别为6.017、10.817、10.985；P值分别为0.000、0.000、0.000)。与Sham组(1.80±0.60)比较,TAC组钙瞬变(△F/F0)增加到2.47±0.96,P<0.01,而T50延长为196.33±35.18 (vs sham,172.00±15.19), P<0.01,与TAC相比,TAC+PD组能显着降低到1.83±0.83,P<0.01,并且T50降低到165.00±34.89,P<0.01。与Sham组(4.69±1.53)比较,TAC组在5w时,心肌收缩力增加到6.56±3.13,P<0.01,与Sham比较,TAC+PD组分离出的单个心肌细胞的钙瞬变无显着变化,P>0.05,但收缩力却显着增高到6.49±2.69(P<0.01)。第叁部分：PD抑制Calcineurin/NFAT3促肥厚信号通路1、PD离体抑制Calcineurin/NFAT3信号通路在培养的NRVMs上,我们观测了PD对Calcineurin/NFAT信号通路的影响,结果显示,Calcineurin蛋白无显着差异(F值为3.108；P值为0.089), Calcineurin的活性,各组间的F值分别为8.252；P值分别为0.008。与正常组(1.00±0.00)比较,PE显着增高Calcineurin活性增加到2.03±0.40,P<0.01,差异显着。但Calcineurin蛋白有上升的趋势,无统计差异。紧接着,PE组NFAT3转移入核,PE组的核蛋白NFAT3显着增加了1倍,P<0.05,而PE组胞浆的NFAT3是降低了,P<0.05,PD单独处理组对细胞的Calcineurin的活性,NFAT3蛋白无显着变化。但是PD处理却能显着降低PE所致的上升的Calcineurin活性。结果显示与PE组比较,PE+PD组的Calcineurin活性降低为1.30±0.10(vs PE),P<0.05,差异具有统计学意义。核蛋白NFAT3减少了62.5%,P<0.05,胞浆蛋白NFAT3显着升高了,P>0.05。2、PD在体抑制Calcineurin/NFAT信号通路TAC小鼠5w时,提取组织蛋白,我们在组织上观测了PD对Calcineurin/NFAT信号通路的影响,结果显示Calcineurin蛋白,Calcineurin活性,各组间的F值分别为12.398、5.889、3.613、4.482；P值分别为0.003、0.038。与Sham组比较,TAC组的Calcineurin蛋白增加了1.43倍,Calcineurin活性增加了将近一倍,P值均小于0.01。核蛋白NFAT3显着上升,而胞浆NFAT3显着下降。同时,相比于TAC组,TAC+PD组的Calcineurin蛋白的活性下降到1.32±0.20(P<0.05)和Calcineurin蛋白表达显着降低为1.65±0.30(P<0.05),同时,与TAC组比较,TAC+PD组的核蛋白NFAT3显着降低,胞浆NFAT3显着增加。结论：1.PD可增强心肌细胞的抗肥厚能力。2.PD具有抗抑制心脏重构、改善心功能的作用,延缓从心肌肥厚过度到心力衰竭的病理生理进程。3.PD能修复肥大所引起的异常的钙信号,且不降低心肌收缩力。4.PD抑制Calcineurin/NFAT促肥厚信号通路。
周鹏, 许师明, 徐明, 张幼怡, 王世强[7]2005年在《心肌细胞钙信号转导与心衰的微观生理机制》文中研究说明心肌细胞收缩活动是由胞内钙致钙释放产生的钙瞬变调控的。当心肌细胞兴奋时,细胞膜上电压依赖性L型钙通道被激活,产生的钙内流激活肌质网钙释放通道(又叫ryanodine受体)产生钙火花,大量钙火花总和产生钙瞬变从而启动收缩过程。为研究钙致钙释放分子过程的生理
董世山, 利凯, 王迎春, 高铭宇, 徐彤[8]2006年在《钙信号转导与缺氧诱发肉鸡肺动脉平滑肌细胞癌基因c-fosc、-myc表达的关系》文中指出利用细胞免疫组化、原位杂交技术研究钙信号与缺氧诱发肺动脉平滑肌细胞(PASMC)癌基因c-fos、c-myc表达的关系。结果显示,钙通道拮抗剂verapamil(V)、nifedipine(N)、Cyclosporin A(C)显着抑制缺氧引起的c-fos和c-mycmRNA的表达(其中c-fosmRNA:缺氧组198.1±32.8,缺氧+V组161.6±24.1,缺氧+N组173.7±35.8,缺氧+C组159.0±32.8,P<0.01;c-mycmRNA:缺氧组187.1±22.4,缺氧+V组150.5±22.6,缺氧+N组155.1±25.4,缺氧+C组148.9±29.7,P<0.01)。同时显着抑制缺氧引起的c-fos和c-myc蛋白的表达(其中c-fos蛋白:缺氧组225.9±37.0,缺氧+V组162.3±33.6,缺氧+N组157.4±28.9,缺氧+C组151.6±37.3,P<0.01;c-myc蛋白:缺氧组228.8±33.4,缺氧+V组170.2±26.7,缺氧+N组170.7±28.5,缺氧+C组179.1±29.2,P<0.01)。verapamil和nifedipine能够显着抑制缺氧引起的癌基因表达,表明钙信号转导参与了缺氧引起PASMC癌基因的表达过程。Cyclosporin A可显着抑制缺氧引起的癌基因的转录表达,表明钙信号转导系统中的Ca2+/CaM-CaN转导通路在PASMC增殖过程中具有重要作用。PASMC增殖是肉鸡腹水综合征的主要特征,钙信号转导激活引起PASMC增殖的c-fos和c-myc的转录表达,表明钙信号转导可能与肉鸡腹水综合征的发生发展密切相关。
蔡翔宇[9]2013年在《STIM1分子生化特性研究及其生理功能探索》文中进行了进一步梳理钙离子信号调节着细胞的收缩、分泌、活动、转录、分化、凋亡等一系列重要的生理功能。而细胞中多种多样的钙泵和细胞膜上不同性质的钙离子通道则正是钙离子信号产生的基础。在非兴奋性细胞中,胞外钙离子的进入主要通过钙池操纵的钙内流(Store-operated calcium entry, SOCE)通道完成。它主是指在内质网钙库清空后,细胞膜上的通道被激活,胞外钙离子内流从而使内质网钙库重新充盈的过程。通过对SOCE通道分子身份的研究,确定位于细胞膜上的通道组成部分Orai1和位于内质网膜上的钙离子浓度感受器STIM1这两个分子是SOCE的主要参与者。随着单细胞技术,电生理技术以及激光共聚焦显微镜等一系列细胞实验技术的发展,人们对于STIM1激活Orai1的过程以及二者之间相互作用区域有了一定的了解。特别是STIM1N端的钙离子结合区域结构的解析,使人们对于SOCE的触发机制有了更好的认识。但是目前对于STIM1C端行使激活通道功能的大部分区域的结构一直未知。因此,对于STIM1与Orai1之间的相互作用以及通道激活的细节都了解的不是很清楚。本文通过系统地对STIM1C端的不同长度区域进行纯化和晶体筛选,最终得到了STIM1C端激活Orai1最短区域SOAR的纯化蛋白。通过结晶条件的筛选,得到了用于结构解析的晶体并对其结构进行了解析。结合人类SOAR晶体结构提供的信息以及本实验室其它实验组的结果,本文对STIM1激活Orai1的可能机制进行了推测：STIM1分子在静息状态时可能主要以二体形式存在,其激活区域被位于C端内部和SOAR前部的抑制螺旋(IH)所抑制从而处于关闭状态。当钙库清空时,钙离子从EF-hand上解离,N端构象发生变化。引发C端发生一系列改变,转变为比较伸展的状态从而使SOAR从C端释放出来,在靠近膜周的位置发生聚集并最终激活膜上的Orai1通道。在功能方面,本文对STIM1, Orai1分子在病理性心肌肥大过程中所扮演的角色进行了探索。发现使用SiRNA干扰STIM1, Orai1后,可以中和由病理性信号刺激的心肌肥大现象。并且由STIM1,ORAI1介导的信号途径与蛋白激酶D3(Protien kinase D3, PDK3)介导的信号途径存在着交互作用。本文对于STM1分子SOAR区域的研究,为揭示STM1激活Orai1通道的分子机制提供了重要的结构生物学信息,对于研究SOCE的调控过程具有重要意义。下一步的工作将主要集中在Orai1通道关闭失活的调控方面。此外,本文还探索了STM1, Orai1分子介导的钙离子信号在心肌肥大过程中的作用,为更好地理解心肌肥大过程中涉及的信号通路提供了新的思路。在未来的工作中,将对STM1如何被激活并最终通过什么样的途径导致心肌肥大的细节等问题加以研究,为临床方面心肌肥大的治疗提供新的可能靶点。
罗益智[10]2017年在《MG53对心肌细胞心电稳定性的调控》文中研究表明背景介绍:MG53(Mitsugumin53)是一种横纹肌特异性表达的TRIM/RBCC家族蛋白,别名为TRIM72。TRIM/RBCC家族成员蛋白在其氨基的末端具有叁个高度保守的结构域,分别称为环指结构,锌指结构(B-box)和螺旋结构。MG53特异性的在横纹肌(心肌细胞,骨骼肌细胞)中表达,它主要是以囊泡的形式包吐并定位于细胞膜之下,并且在细胞膜的损伤修复中起重要的作用。在心肌细胞和骨骼肌细胞中,通过转染腺病毒使细胞过表达MG53,发现MG53过表达能增强囊泡转运,出芽和包吐作用。然后在MG53敲除小鼠中发现,通过将MG53敲除后,基因敲除鼠表现出肌营养不良,而细胞膜的修复功能缺失与肌营养不良有紧密的关联。在细胞膜受到损伤时,MG53通过感受胞内氧化环境的变化,能够触发富含MG53的囊泡富集到细胞膜损失的部位。此外,MG53可以通过与dysferlin,caveolin-3的相互作用,从而增强囊泡的出芽和转运,并对细胞膜进行修复。表明MG53这一心脏特异性表达基因在心电稳定性维持中起重要作用。同样,这些表型也可能是与细胞膜的修复功能缺失有紧密的关联。最近有报道发现,在心肌缺血再灌注损伤中,MG53介导损伤细胞膜修复作用从而对心肌起保护作用,并且在缺血预适应中起重要的保护作用。心肌的缺血进而会导致心肌缺氧,从而会发生一连串的病理生理反应,例如细胞出现钙超载,同时细胞膜的损伤会导致离子通道的重构,从而导致心律失常。MG53已被证实在缺血预适应中起重要的保护作用。但与此同时有文献表明,过表达MG53将引起糖尿病心肌病。然而MG53对心肌细胞细胞钙信号的调控作用以及对其是否影响离子通道重构还罕见报道。方法与结果:本研究以原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞/SD成年大鼠心肌细胞/MG53敲除鼠为模型,通过利用腺病毒载体的技术使细胞内过表达/敲低表达MG53,来观察在正常生理条件下,MG53对心肌细胞钙信号的调节以及动作重构的影响。我们研究发现超表达MG53能使得心肌细胞钙火花的发放频率增高,并且我们发现过表达MG53会使得动作电位时程显着减短。MG53敲低时心肌细胞钙火花的发放频率显着减少,动作电位时程显着延长。Ik1电流密度显着降低。同样我们发现相比于对照组,MG53基因敲除小鼠动作电位显着延长,IKs1和IKs2电流密度显着降低。结论:双向调控MG53都会显着影响钙火花的发生,但调节MG53的表达并未引起其他钙信号指标的改变,因此我们推测MG53通过增加肌浆网钙库的Ry R的活性从而降低了管腔内诱导零星的钙火花Ca2+水平阈值。于此同时我们发现调节MG53表达会引起动作电位重构,因此可作为临床上治疗心律失常疾病提供一个新的靶点。
参考文献：
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[9]. STIM1分子生化特性研究及其生理功能探索[D]. 蔡翔宇. 南开大学. 2013
[10]. MG53对心肌细胞心电稳定性的调控[D]. 罗益智. 深圳大学. 2017