永州市中医院 湖南省永州市 425000
【摘 要】目的：探讨调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型腹膜淋巴孔密度及尿中Na+浓度的影响。方法：取S180细胞接种于小鼠腹腔造成肝癌腹水模型，随机分为空白对照组（NS）、模型组（M）、调营饮组（T），造模后第五天用调营饮汤剂连续灌胃，观察对小鼠腹膜淋巴孔密度的影响及及尿中Na+浓度。结果：T组腹膜淋巴孔密度明显大于NS组和M组（P<0.01），T组尿Na+浓度明显大于NS组和M组，比较差异有显著性意义（P<0.05）。结论：调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型有明显促进腹膜淋巴孔开放，分布密度增加，钠离子排出增多，可能是其消腹水作用机制之一。
【关键词】调营饮；S180；肝癌腹水；小鼠
Abstract：Objective To study effect of TIAOYINYIN mixture on concentration of the peritoneal lymphatic stomata in S180 ascites liver cancer mice，such as density of distribution.Methods：Thirty-two special pathogen free（SPF）Kunming mice were randomized into 3 groups：blank contral group（NS），model contral group（M），TIAOYINYIN mixture model group（T），Make the mold 5nd days to start for the medicine，after 9nd measure the mice.Results：Compared to NS group and model group，TIAOYINYIN mixture could significantly enhance density of distribution（P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：These experiment study showed TIAOYINYIN Mixture regulating peritoneal lymphatic stomata，improving the drainage from peritoneal cavity in the malignant ascites.
[KEY WORDS] TIAOYINYIN Mixture，S180 liver cancer ascites，mice
原发性肝癌（Primary hepatic cancer，PHC）为常见肿瘤，腹水（Ascites）是肝癌常见的并发症之一；肝癌腹水中医学称之为” 鼓胀”，又称“水蛊”、“ 蛊胀”、“ 蜘蛛蛊”等，被历代医家列为四大难证之一[1，2]。调营饮是治疗肝癌腹水的常用方，疗效肯定，现通过动物实验研究，探讨调营饮可能的作用机理。
1.实验材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物：健康昆明种小鼠36只，SPF级，雄性，4-6同周龄小鼠，体重20-24g，由湖南中医学院实验动物中心提供。
1.1.2实验试剂和仪器：调营饮汤剂由永州市中医院药剂科提供；台盼蓝液的配制：取苔盼蓝0.049g溶于双蒸水1Oml，过滤分装储藏于室温备用；湖南师范大学JSM-6360LV型电子扫描显微镜。永州市中医院检验科半自动生化析仪。
1.1.3 瘤株：小鼠S180肝癌株由上海中科院细胞库所保种瘤株。
1.2方法
1.2.1造模
取S180肝癌细胞株，接种于健康昆明小鼠腹腔，取腹腔传代第8日小鼠，选择腹水饱满小鼠，脱颈椎处死，固定于蜡板上，腹部皮肤用碘酒、酒精消毒后，在超净台内于无菌条件下消毒鼠腹，抽取乳白色腹水为瘤源，将获取的活体腹水细胞用生理盐水1：3稀释，小心摇匀，然后用苔盼蓝染色，显微镜下计数存活瘤细胞数，并调整浓度到每毫升含有106个瘤细胞，存活率95%。用75%的酒精消毒实验小鼠腹部后，将肿瘤细胞悬液以每只0.2ml分别接种到小鼠腹腔。全程严格无菌操作，40min内完成[3]。
1.2.2动物分组和给药：按照完全随机设计，遵照均衡性原则，先将小鼠按体重分层，然后查随机数字表将小鼠随机分成空白对照组（NS）、模型组（M）组、调营饮组（T），每组12只小鼠，用75%的酒精消毒实验小鼠腹部后，将肿瘤细胞悬液以每只0.2ml分别接种到除NS组的其它两组小鼠腹腔，造模后第5日，诊断性穿刺小鼠腹腔，如能抽取到腹水，证明造模成功。从造模后第5天开始NS组、M组以0.2 mL/10 g生理盐水灌胃，1次/d，连续5天，T组予成药0.03g/10g剂量灌胃[4，5，6]，1次/d，连续5天；平均每只小鼠每天给等量鼠料4g/（只?d）；一周换垫料2次，每日换新鲜水1次。
1.2.2观察指标及测定方法：
1.3.1尿Na+离子浓度测定
造模后第九天各组灌胃后，用自制代谢笼收集每组各小鼠2小时尿液，采用半自动生化析仪测定尿中Na+离子浓度。检测Na+采用６-氢氧化锑钾直接比浊法，原理如下：在分散剂和除干扰剂存在下，Na+与６-氢氧化锑钾在分散剂的作用下形成均一的浊度，在620nm波长下检测吸光度大小。简述操作程序如下：（1）分别向标准管、样品管加入试剂0.3ml（2）向标准管加入标准液20ul（3）向样品管加入样品20ul（4）分别向标准管、样品管加入促进剂200ul（5）形成混浊后各管加1ml乙醇稀释液，混匀后测定（6）半自动生化析仪用蒸馏水调零（7）620nm波长下检测吸光度，根据结果换算成Na+离子浓度。
做完尿液标本后拉颈处死小鼠，取小鼠右膈腹膜切成5mmx 5mm，分别用2.5％戊二醛和1％娥酸双固定，2％单宁酸液导电处理，丙酮梯度脱水，醋酸异戊脂置换。HITACH C02临界点干燥仪处理，GTKO IB-5型离子溅射仪镀膜，JSM-6360LV扫描电镜观察，加速电压20 kV，放大3500倍。数据测量用扫描电镜自带的smile view软件进行，在扫描电镜拍下的图片上测量淋巴孔密度（个/0.1mm2）[7]。
1.3.统计方法
应用SPSS15.0统计软件进行统计分析，实验数据用“ ”形式表示，结果之间多样本比较用F检验进行方差分析，组间均数两两比较用t检验，以P<0.05和P<0.01表示差异的显著性。
2.结果
2.1 尿中Na+离子浓度
T组尿中平均Na+浓度明显高于NS组和M组，差异有显著性意义（P<0.01）。结果见表1。
注：与NS组比较*P<0.05，**P<0.01；与M组比较△P<0.05，△△P<0.01；
2.1各组腹膜淋巴孔分布密度情况
T组腹膜淋巴孔平均密度均明显大于NS组和M组，差异有显著性意义（P<0.01），结果见表2。
注：与NS组比较*P<0.05，**P<0.01；与M组比较△P<0.05，△△P<0.01。
图1 调营饮组（T组）实验小鼠第九天
图2 调营饮组（T组）腹膜淋巴 ⅹ3500倍
讨论
在我国，临床上大部分原发性肝癌是与乙肝病毒感染有关，90%以上合并肝硬化，腹水为终末期肝癌的典型临床表现，对大多数患者而言，缓解腹水引起的症状是治疗的主要目标[8]。目前临床采取的治疗方法较多，疗效有限，各有优缺点。现在采用中西医结合治疗恶性腹水，不但改善症状显著还能延长生存期，且副作用小，显示出其优势，是今后一个发展方向[8]。腹膜淋巴孔是腹膜毛细淋巴管在腹膜间皮上的开口，有主动的物质吸收功能。腹膜腔-腹膜淋巴孔-腹膜下小管和淋巴引流单位-淋巴陷窝-腹膜淋巴管-脉管系是腹膜腔内物质转归的直捷通路，也是巨噬细胞进入腹膜腔执行免疫功能的重要途径，在腹水的转归方面意义重大。
中医方面肝癌腹水的发生与感受湿热邪毒或长期饮食不节、嗜酒过度、七情内伤等引起机体阴阳失衡有关，形成气滞、血瘀、水停腹中，肝气郁结，气滞血瘀，是形成鼓胀的基本条件，脾脏功能受损，运化失职，遂致水湿停聚；肾脏的气化功能障碍，不能蒸化水液而加重水湿停滞，是形成鼓胀的重要因素，病位涉及肝、脾、肾三脏。在病机上由于本病本虚标实，虚实挟杂，调营饮为临床常用方，治予活血化瘀、行气利水。方中当归、川芎、赤芍等以活血化瘀；莪术、延胡索、大黄以行气活血；瞿麦、槟榔、葶苈子、赤茯苓、桑白皮等以行气利尿；陈皮、大腹皮、白芷理气消胀；细辛、肉桂温阳利水；炙甘草、姜、枣调和诸药。共奏活血化瘀、行气利水之功。
本实验研究显示：调营饮T组尿中平均钠离子浓度明显高于NS组和M组。血浆渗透压是影响组织液回流的一个重要因素，提高血浆渗透压有益于腹水的消除，其中降低Na+摄入、促进尿Na+排出、调整离子渗透压是消除腹水的一个重要手段。结果显示本方能使小鼠S180肝癌腹水模型尿中钠离子排出增加，减轻水钠潴留，可能是其消腹水作用机制之一。调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型有明显促进腹膜淋巴孔开放，分布密度增加，T组腹膜淋巴孔密度明显大于NS组和M组（P<0.01）。腹膜淋巴孔密度改变，尿离子浓度的影响，可能与调营饮消腹水作用密切的联系，调营饮通过促进调节性媒介物质的释放，引起腹膜淋巴孔开放，尿离子的排出增加，从而引起小鼠尿量有明显增加，消腹水利尿作用十分明显。调营饮中是什么成分促进调节性物质的释放；其具体的机制是什么，有那些媒介物质参与其中，我们将在以后的实验中继续探讨，为其临床应用提供理论基础。
参考文献：
[1] 华海青.原发性肝癌病机特点探讨[J].中国中医基础医学杂志，2004，10（2）：38-39
[2] 周永兴.现代肝硬化诊断治疗学[M]．人民军医出版社，2008，52（3）：55-56
[3] 盛庆寿.青蒿琥酯对S180肝癌小鼠的抑瘤作用及对肿瘤组织VEGF、FasL的影响[J].广州中医药大学学报，2008，36-39
[4] 李仪奎.中药药理实验方法学第2版[M].上海科技出版社，1994，779-780
[5] 陈谦，孙慧，李强等.医学实验肝癌动物模型的研究进展.中华实验外科杂志，2006：23（3）：377- 378.
[6] 徐静，李旭.肝癌动物模型的建立[M].实用肝脏病杂志，2005；8（2）：116-118
[7] 李慧，李继承.腹膜淋巴孔研究的新进展[J].中国医学科学院学报，2007，22（6）：585-586
[8] 吴孟超.中医药在肝癌防治中的作用、地位和存在的问题.中西医结合学报[J]，2003；1（3）：163-164.
永州市中医院 湖南省永州市 425000
【摘 要】目的：探讨调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型腹膜淋巴孔密度及尿中Na+浓度的影响。方法：取S180细胞接种于小鼠腹腔造成肝癌腹水模型，随机分为空白对照组（NS）、模型组（M）、调营饮组（T），造模后第五天用调营饮汤剂连续灌胃，观察对小鼠腹膜淋巴孔密度的影响及及尿中Na+浓度。结果：T组腹膜淋巴孔密度明显大于NS组和M组（P<0.01），T组尿Na+浓度明显大于NS组和M组，比较差异有显著性意义（P<0.05）。结论：调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型有明显促进腹膜淋巴孔开放，分布密度增加，钠离子排出增多，可能是其消腹水作用机制之一。
【关键词】调营饮；S180；肝癌腹水；小鼠
Abstract：Objective To study effect of TIAOYINYIN mixture on concentration of the peritoneal lymphatic stomata in S180 ascites liver cancer mice，such as density of distribution.Methods：Thirty-two special pathogen free（SPF）Kunming mice were randomized into 3 groups：blank contral group（NS），model contral group（M），TIAOYINYIN mixture model group（T），Make the mold 5nd days to start for the medicine，after 9nd measure the mice.Results：Compared to NS group and model group，TIAOYINYIN mixture could significantly enhance density of distribution（P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：These experiment study showed TIAOYINYIN Mixture regulating peritoneal lymphatic stomata，improving the drainage from peritoneal cavity in the malignant ascites.
[KEY WORDS] TIAOYINYIN Mixture，S180 liver cancer ascites，mice
原发性肝癌（Primary hepatic cancer，PHC）为常见肿瘤，腹水（Ascites）是肝癌常见的并发症之一；肝癌腹水中医学称之为” 鼓胀”，又称“水蛊”、“ 蛊胀”、“ 蜘蛛蛊”等，被历代医家列为四大难证之一[1，2]。调营饮是治疗肝癌腹水的常用方，疗效肯定，现通过动物实验研究，探讨调营饮可能的作用机理。
1.实验材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物：健康昆明种小鼠36只，SPF级，雄性，4-6同周龄小鼠，体重20-24g，由湖南中医学院实验动物中心提供。
1.1.2实验试剂和仪器：调营饮汤剂由永州市中医院药剂科提供；台盼蓝液的配制：取苔盼蓝0.049g溶于双蒸水1Oml，过滤分装储藏于室温备用；湖南师范大学JSM-6360LV型电子扫描显微镜。永州市中医院检验科半自动生化析仪。
1.1.3 瘤株：小鼠S180肝癌株由上海中科院细胞库所保种瘤株。
1.2方法
1.2.1造模
取S180肝癌细胞株，接种于健康昆明小鼠腹腔，取腹腔传代第8日小鼠，选择腹水饱满小鼠，脱颈椎处死，固定于蜡板上，腹部皮肤用碘酒、酒精消毒后，在超净台内于无菌条件下消毒鼠腹，抽取乳白色腹水为瘤源，将获取的活体腹水细胞用生理盐水1：3稀释，小心摇匀，然后用苔盼蓝染色，显微镜下计数存活瘤细胞数，并调整浓度到每毫升含有106个瘤细胞，存活率95%。用75%的酒精消毒实验小鼠腹部后，将肿瘤细胞悬液以每只0.2ml分别接种到小鼠腹腔。全程严格无菌操作，40min内完成[3]。
1.2.2动物分组和给药：按照完全随机设计，遵照均衡性原则，先将小鼠按体重分层，然后查随机数字表将小鼠随机分成空白对照组（NS）、模型组（M）组、调营饮组（T），每组12只小鼠，用75%的酒精消毒实验小鼠腹部后，将肿瘤细胞悬液以每只0.2ml分别接种到除NS组的其它两组小鼠腹腔，造模后第5日，诊断性穿刺小鼠腹腔，如能抽取到腹水，证明造模成功。从造模后第5天开始NS组、M组以0.2 mL/10 g生理盐水灌胃，1次/d，连续5天，T组予成药0.03g/10g剂量灌胃[4，5，6]，1次/d，连续5天；平均每只小鼠每天给等量鼠料4g/（只?d）；一周换垫料2次，每日换新鲜水1次。
1.2.2观察指标及测定方法：
1.3.1尿Na+离子浓度测定
造模后第九天各组灌胃后，用自制代谢笼收集每组各小鼠2小时尿液，采用半自动生化析仪测定尿中Na+离子浓度。检测Na+采用６-氢氧化锑钾直接比浊法，原理如下：在分散剂和除干扰剂存在下，Na+与６-氢氧化锑钾在分散剂的作用下形成均一的浊度，在620nm波长下检测吸光度大小。简述操作程序如下：（1）分别向标准管、样品管加入试剂0.3ml（2）向标准管加入标准液20ul（3）向样品管加入样品20ul（4）分别向标准管、样品管加入促进剂200ul（5）形成混浊后各管加1ml乙醇稀释液，混匀后测定（6）半自动生化析仪用蒸馏水调零（7）620nm波长下检测吸光度，根据结果换算成Na+离子浓度。
做完尿液标本后拉颈处死小鼠，取小鼠右膈腹膜切成5mmx 5mm，分别用2.5％戊二醛和1％娥酸双固定，2％单宁酸液导电处理，丙酮梯度脱水，醋酸异戊脂置换。HITACH C02临界点干燥仪处理，GTKO IB-5型离子溅射仪镀膜，JSM-6360LV扫描电镜观察，加速电压20 kV，放大3500倍。数据测量用扫描电镜自带的smile view软件进行，在扫描电镜拍下的图片上测量淋巴孔密度（个/0.1mm2）[7]。
1.3.统计方法
应用SPSS15.0统计软件进行统计分析，实验数据用“ ”形式表示，结果之间多样本比较用F检验进行方差分析，组间均数两两比较用t检验，以P<0.05和P<0.01表示差异的显著性。
2.结果
2.1 尿中Na+离子浓度
T组尿中平均Na+浓度明显高于NS组和M组，差异有显著性意义（P<0.01）。结果见表1。
注：与NS组比较*P<0.05，**P<0.01；与M组比较△P<0.05，△△P<0.01；
2.1各组腹膜淋巴孔分布密度情况
T组腹膜淋巴孔平均密度均明显大于NS组和M组，差异有显著性意义（P<0.01），结果见表2。
注：与NS组比较*P<0.05，**P<0.01；与M组比较△P<0.05，△△P<0.01。
图1 调营饮组（T组）实验小鼠第九天
图2 调营饮组（T组）腹膜淋巴 ⅹ3500倍
讨论
在我国，临床上大部分原发性肝癌是与乙肝病毒感染有关，90%以上合并肝硬化，腹水为终末期肝癌的典型临床表现，对大多数患者而言，缓解腹水引起的症状是治疗的主要目标[8]。目前临床采取的治疗方法较多，疗效有限，各有优缺点。现在采用中西医结合治疗恶性腹水，不但改善症状显著还能延长生存期，且副作用小，显示出其优势，是今后一个发展方向[8]。腹膜淋巴孔是腹膜毛细淋巴管在腹膜间皮上的开口，有主动的物质吸收功能。腹膜腔-腹膜淋巴孔-腹膜下小管和淋巴引流单位-淋巴陷窝-腹膜淋巴管-脉管系是腹膜腔内物质转归的直捷通路，也是巨噬细胞进入腹膜腔执行免疫功能的重要途径，在腹水的转归方面意义重大。
中医方面肝癌腹水的发生与感受湿热邪毒或长期饮食不节、嗜酒过度、七情内伤等引起机体阴阳失衡有关，形成气滞、血瘀、水停腹中，肝气郁结，气滞血瘀，是形成鼓胀的基本条件，脾脏功能受损，运化失职，遂致水湿停聚；肾脏的气化功能障碍，不能蒸化水液而加重水湿停滞，是形成鼓胀的重要因素，病位涉及肝、脾、肾三脏。在病机上由于本病本虚标实，虚实挟杂，调营饮为临床常用方，治予活血化瘀、行气利水。方中当归、川芎、赤芍等以活血化瘀；莪术、延胡索、大黄以行气活血；瞿麦、槟榔、葶苈子、赤茯苓、桑白皮等以行气利尿；陈皮、大腹皮、白芷理气消胀；细辛、肉桂温阳利水；炙甘草、姜、枣调和诸药。共奏活血化瘀、行气利水之功。
本实验研究显示：调营饮T组尿中平均钠离子浓度明显高于NS组和M组。血浆渗透压是影响组织液回流的一个重要因素，提高血浆渗透压有益于腹水的消除，其中降低Na+摄入、促进尿Na+排出、调整离子渗透压是消除腹水的一个重要手段。结果显示本方能使小鼠S180肝癌腹水模型尿中钠离子排出增加，减轻水钠潴留，可能是其消腹水作用机制之一。调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型有明显促进腹膜淋巴孔开放，分布密度增加，T组腹膜淋巴孔密度明显大于NS组和M组（P<0.01）。腹膜淋巴孔密度改变，尿离子浓度的影响，可能与调营饮消腹水作用密切的联系，调营饮通过促进调节性媒介物质的释放，引起腹膜淋巴孔开放，尿离子的排出增加，从而引起小鼠尿量有明显增加，消腹水利尿作用十分明显。调营饮中是什么成分促进调节性物质的释放；其具体的机制是什么，有那些媒介物质参与其中，我们将在以后的实验中继续探讨，为其临床应用提供理论基础。
参考文献：
[1] 华海青.原发性肝癌病机特点探讨[J].中国中医基础医学杂志，2004，10（2）：38-39
[2] 周永兴.现代肝硬化诊断治疗学[M]．人民军医出版社，2008，52（3）：55-56
[3] 盛庆寿.青蒿琥酯对S180肝癌小鼠的抑瘤作用及对肿瘤组织VEGF、FasL的影响[J].广州中医药大学学报，2008，36-39
[4] 李仪奎.中药药理实验方法学第2版[M].上海科技出版社，1994，779-780
[5] 陈谦，孙慧，李强等.医学实验肝癌动物模型的研究进展.中华实验外科杂志，2006：23（3）：377- 378.
[6] 徐静，李旭.肝癌动物模型的建立[M].实用肝脏病杂志，2005；8（2）：116-118
[7] 李慧，李继承.腹膜淋巴孔研究的新进展[J].中国医学科学院学报，2007，22（6）：585-586
[8] 吴孟超.中医药在肝癌防治中的作用、地位和存在的问题.中西医结合学报[J]，2003；1（3）：163-164.
论文作者:黄崇政,唐成,雷秋娥,刘勇
论文发表刊物:《航空军医》2015年9期供稿
论文发表时间:2015/12/17
标签：小鼠论文; 腹水论文; 腹膜论文; 肝癌论文; 淋巴论文; 浓度论文; 离子论文; 《航空军医》2015年9期供稿论文;