丁奕健[1]2001年在《兔成骨细胞的培养及生长因子对其体外增殖影响的实验研究》文中指出目的：大型颌骨缺损历来是临床修复的难点，尽管可供选择的治疗手段很多，但很少有一种方法能比较理想地解决修复问题，获得令人满意的效果。骨组织工程的提出为解决这一难题提供了新的途径。成骨细胞作为骨组织工程的种子细胞，它的获取和培养是组织工程中最基础和最为重要的环节。在成骨细胞多种来源中，骨髓来源最为优越。骨髓来源的成骨细胞由骨髓内骨祖细胞分化而来，但骨祖细胞数量有限，增殖较慢，难以适应种子细胞库大量细胞的需要。本实验采用兔骨髓基质细胞作为骨组织工程种子细胞的来源筛选培养兔成骨细胞，并观察其生物学特性，为从骨髓途径获取筛选种子细胞并应用于骨组织工程修复颌骨缺损提供一定的实验依据；并探讨胰岛素样生长因子Ⅱ（insulin-like growth factor Ⅱ，IGFⅡ）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）、转化生长因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）这3种生长因子单独及交互联合应用后对成骨细胞增殖的影响，希望能选择一种合适的促进成骨细胞增殖的方法，为成骨细胞适应骨组织工程种子细胞库的大量需要提供一定的实验基础。 方法：抽取日本大耳白兔骨髓液经离心后得骨髓单个核细胞，经 兔成骨细胞的培养及生长因子对其体外增殖影响的实验研究 PBS液洗涤后以 IX 10fynd的细胞浓度进行培养，2周后得到贴壁生长的单 层细胞。随后进入传代培养，通过倒置显微镜、HE染色、扫描电镜、透 射电镜、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色、I型胶原免疫组化染 色、钙染色等手段对获得的细胞进行生物学特性研究。然后将细胞与载体 材料聚乳酸（PLA）、膨体聚四氟乙烯（OPTFO复合培养1周后回植自体兔肌 肉内，4周、巴周后植人部位取材，组织学方法观察其体内成骨能力。并采 用体外培养的第5代成骨细胞，用鹰陛蓝比色法，观察胰岛素样生长因子 11、碱性成纤维细胞生长因于、转化生长因子·p这叁种生长因于单独及交 互联合应用后对成骨细胞体外增殖的影响。 结果：在形态学上，本实验所培养的细胞能够贴壁，呈多种形态， 有粗细不均的胞浆突起，并且呈集落样生长，可相互重迭成复层生长，并 形成细胞结节。电镜下可见典型的蛋白质合成结构；胞浆富含线粒体、粗 面内质网和高尔基体，表明合成分泌功能旺盛，符合成骨细胞的形态及生 长特性。在生化和”组织化学上，培养细胞富含ALP活性，主要合成1型胶 原，并且在条件培养基中可以钙化（Von Kossa染色阳性）。符合成骨细胞 鉴定的标准。且细胞经连续传代，形态与功能不变。成骨细胞经体外增殖， 与载体复合培养后生长良好。植入体内后早期（4周时）形成的骨基质结 构疏松，。周围仍有较多成骨细胞，晚期（8周时）则可见形成的骨样组织 结构致密，内有骨细胞位于骨陷窝中，与典型的骨组织结构基本相似。 在相同培养条件下，叁种生长因子均能促进成骨细胞增殖，IGF．H、 bFGF这两种生长因于在0．l－10．ong／thl浓度范围内与兔成骨细胞增殖呈剂 量·效应关系，并以10．onglml这个浓度促增殖作用最为显着，浓度超过该 值后，促增殖作用反而下降。TGF－D在0。olghl时促增殖作用最为显着， 随着浓度增高，作用下降。选择较佳效应浓度的3种生长因于与兔成骨细 胞培养 1天后，除 10．0 il bFGF外，其余促增殖作用均不显着，3天后 第2页 兔成骨细胞的用养及生长因于对其体外增殖影响的实验研究 出现促增殖差异，5天后，生长因子促进兔成骨细胞增殖作用达到最大，7 天后，作用减弱。叁种生长因子交互作用时，对兔成骨细胞的增殖有协同 作用，均促进兔成骨细胞的增殖，并以生长因于 bFGF＋GF·11与 bFGF＋IGF·H可GF小联合作用效果较为显若。 结论： 二．兔骨髓基质细胞经体外培养后生长活跃，具有与成骨细胞相似的形态 特征及生长特点；具有较强的ALP活性，能分泌I型胶原，能体外钙化； 细胞一载体复合物植入体内八周后能形成骨组织。表明：我们从兔骨髓中 筛选培养成功的细胞是兔成骨细胞，从骨髓中获取成骨细胞的方法是可行 的。 2．叁种生长因于均能促进兔骨髓成骨细胞的增殖，生长因子促增殖作用 有剂量依赖性和时间依赖性，叁种生长因子交互作用时有协同作用，提示 生长因子在体外可促进兔成骨细胞增殖，可作为在较短时间快速获得骨组 织工程种子细胞一成骨细胞的一种有效的途径。
曹之强, 丁奕健, 刘建华, 王慧明, 吴求亮[2]2003年在《b-FGF、IGF-Ⅱ、TGF-β影响兔成骨细胞体外增殖的实验研究》文中进行了进一步梳理目的 研究碱性成纤维细胞生长因子 (b -FGF)、胰岛素样生长因子Ⅱ (IGF -Ⅱ )和转化生长因子- β(TGF- β)单独及交互联合作用 ,对兔成骨细胞体外增殖的剂量效应及时间效应。方法 采用细胞培养技术及噻唑蓝比色法 ,观察3种生长因子对兔成骨细胞体外增殖的调节作用。结果 b-FGF和IGF -Ⅱ在0.1～10.0ng/ml浓度范围内与兔成骨细胞增殖呈剂量效应关系。TGF - β 在低浓度 (0.01ng/ml)时可促进兔成骨细胞的增殖 ,随着浓度的增加 ,促增殖作用明显减弱。5d后 ,生长因子促进兔成骨细胞体外增殖作用达到最大。3种生长因子联合应用效果迭加。结论 3种生长因子均能促进兔骨髓来源成骨细胞的体外增殖 ,其作用有剂量依赖性和时间依赖性。提示探索最佳生长因子组合可有效促进成骨细胞增殖
王辉[3]2016年在《RGD多肽修饰国产多孔钽修复兔桡骨节段性骨缺损的实验研究》文中进行了进一步梳理第一章RGD多肽修饰国产多孔钽支架材料的制备目的：利用环RGD多肽表面修饰国产多孔钽支架材料,探讨RGD多肽修饰前、后多孔钽支架材料的形貌特征及亲水性变化。方法：1 RGD多肽修饰多孔钽支架材料制备方法：多孔钽片经消毒后浸泡于浓度为100μmol/L的环RGD多肽磷酸盐缓冲液中,室温下不停振动反应24h,PBS冲洗3次,在层流分流室自然干燥,后经紫外线照射消毒,备用。2多孔钽形貌特征观察：大体及扫描电镜观察经RGD多肽修饰前、后多孔钽。3支架材料亲水性测定：取RGD多肽修饰前、后的各6枚钽片分别称重(W1),于室温下浸泡于去离子水中24h,滤纸除去多余水分,电子天平准确记录其重量(W2)。利用支架材料吸水率计算公式(吸水率=[(W2-W1)/W1]×100%),测定两组样品吸水率,并行统计学分析。结果：1多孔钽经RGD多肽修饰前、后形貌特征变化：大体观察两组支架材料外观颜色均为灰黑色,表面光洁。表面及断面可见蜂窝状孔隙,分布均匀。扫面电镜观察两组支架材料表面可见孔径约400-600μm的微孔结构,孔隙内部有直径为50～200μm的连通小孔。其中RGD多肽修饰后支架材料表面可见斑点状涂层,分布薄厚均匀。2支架材料亲水性测定：测得RGD多肽修饰前、后多孔钽吸水率分别为1.98±0.37%,4.83±0.30%。RGD多肽修饰后多孔钽支架材料吸水率明显高于修饰前支架,经统计学分析两者比较有显着性差异(P<0.01)。结论：RGD多肽修饰国产多孔钽支架形貌特征未发生明显变化,而其亲水性明显提高。第二章RGD多肽修饰国产多孔钽支架材料对成骨细胞增殖、黏附影响的体外实验目的：通过体外实验研究探讨RGD多肽修饰多孔钽支架材料对成骨细胞增殖、早期黏附等生物学行为的影响,为国产多孔钽作为骨组织工程支架材料修复骨缺损进行体内实验及临床应用提供实验依据。方法：1成骨细胞分离培养：取新生24 h内新西兰乳兔4只,无菌条件下取颅盖骨,剪成1mm×1mm的小块,置入5ml 0.25%胰蛋白酶离心管中37℃消化30min,加入5ml 0.1％II型胶原酶37℃振荡消化60min,离心后所得沉淀物加入完全培养基,吹打成细胞悬液,使细胞浓度达105/ml,接种于25cm2培养瓶中。待细胞生长至铺满培养瓶底80-90%时,进行传代,取生长状态良好的第2代细胞用于实验。2细胞形态学观察：倒置相差显微镜下观察细胞生长情况并记录下各个时期的细胞形态变化。3成骨细胞鉴定：取生长状态良好的第2代细胞,接种于预置无菌盖玻片的12孔板内,当细胞长满80～90%时,进行ALP染色,鉴定成骨细胞。4实验分组及成骨细胞在多孔钽支架材料培养,形态学及生长情况观察：实验分组A组：环RGD修饰多孔钽组,B组：单纯多孔钽组。空白对照组：将成骨细胞接种于不放支架的24孔板。将第2代生长良好的成骨细胞与多孔钽复合培养,经倒置相差显微镜观察成骨细胞形态变化及生长情况。5 RGD多肽修饰多孔钽对成骨细胞黏附的影响：取生长状态良好的第2代成骨细胞,将其调整成浓度为1×106/ml单细胞悬液,用微量移液器吸取100μ1(1×105个细胞)接种到各组支架表面,于2h、4h分别取出各组支架样本,利用沉淀法检测各组支架成骨细胞黏附率,并行统计学分析。通过扫面电镜观察4h时两组钽支架表面成骨细胞黏附形态、数量情况。6 RGD多肽修饰多孔钽支架材料对成骨细胞增殖的影响：取浓度为2.5×105/ml的单细胞悬液200μl(5×104个细胞)接种到各组支架表面,培养1d、3d、5d、7d,在每个时间点培养基内加入MTT溶液,使用BIO-RAD酶联免疫检测仪(测定波长为490nm,参比波长为650nm)测定各组光吸收值(OD值),绘制各组成骨细胞增殖曲线图,并对不同时间点各组成骨细胞增殖率进行统计学分析。通过扫面电镜观察3d时两组钽支架表面成骨细胞形态及生长增殖情况。结果：1成骨细胞分离培养及鉴定：刚接种的原代细胞悬浮于培养基中,倒置相差显微镜下可见细胞呈透亮的圆球形,且大小一致；接种6h时,细胞有部分贴壁,24h左右细胞完全贴壁铺伸。第3d时,细胞数量增多,体积增大,细胞借伪足样突起相互连接。第6-7d时细胞数量继续增多,相互融合几乎铺满培养瓶底部,成单层或不规则样改变。第2代细胞形态趋于单一化,呈长梭形或多角形。经ALP染色可见细胞浆内可见蓝染颗粒,细胞核为红色,证实为成骨细胞。2倒置相差显微镜下观察成骨细胞与多孔钽支架材料复合培养形态特征及生长情况：两组多孔钽材料边缘黏附的细胞逐渐数量增多,排列密集,形态良好,但A组细胞数量、密集程度均高于B组。3成骨细胞黏附率的测定：在2h、4h两个时间点上,A组黏附率均高于B组及空白对照组,比较差异有统计学意义(P<0.05)；而B组与空白对照组黏附率相近,二者无统计学差异(P>0.05)。各组细胞黏附率在2h、4h两时间点之间比较均有统计学差异(P<0.05)。4成骨细胞增殖率的测定：第1、3、5、7d四个时间点各组间比较,A组OD值均高于B组及空白对照组,并且差异具有统计学意义(P<0.05);而B组与空白对照组OD值相近,差别无统计学意义(P>0.05)。5扫描电镜下观察成骨细胞在支架上的形态特征及生长情况：在4h时,A组支架材料上成骨细胞伸展变形较好,而B组支架材料上成骨细胞多数为类圆形,伸展变形较慢,同时A组支架材料表面黏附细胞较密集,数量明显高于B组。在第3d时,两组支架材料上成骨细胞生长状态均良好,细胞之间结合紧密,其中A组多孔钽表面的细胞密度及细胞分泌胞外基质的情况均优于B组。结论：1国产多孔钽支架材料具有良好的生物相容性,无细胞毒性,对成骨细胞的黏附、增殖没有影响。2 RGD多肽修饰多孔钽支架材料对成骨细胞的增殖、黏附有促进作用,有望成为骨组织工程的理想支架。第叁章RGD多肽修饰国产多孔钽支架修复兔桡骨节段性骨缺损的实验研究目的：建立兔桡骨节段性骨缺损模型,通过影像学、组织学、生物力学等多种检测方法评价RGD多肽修饰多孔钽支架体内生物相容性及骨缺损的修复能力,从而为国产多孔钽临床应用提供体内实验依据。方法：1材料准备及分组：将多孔钽材料制成直径为3.5mm,长15mm的圆柱体,经浓度为100μmol/L的RGD多肽溶液修饰后(操作步骤见第一章),紫外线照射消毒,备用。选取105只6-8月龄新西兰大白兔,随机抽取分为5组,A组：多孔钽+RGD多肽组24只,B组：多孔钽+筋膜包裹组24只,C组：单纯多孔钽组24只,D组：异种骨组24只,E组：空白组9只。2手术步骤：麻醉成功后右前肢切口周围备皮,消毒后取右前臂桡侧中段纵形切口,长约3.5cm,以桡骨弧顶为中心,用卡尺测量出15mm长度,用微型摆锯低速截骨,造成一1.5cm节段性骨缺损,生理盐水冲洗伤口后,以嵌插方式分别植入A、B、C、D组植入物。其中B组筋膜瓣制作：沿桡骨中段切开皮肤,游离并切取约30mmx25mm富含毛细血管网的带蒂筋膜瓣,包裹嵌插至桡骨骨缺损处的植入物。E组为空白组,只做截骨,未加植入物。逐层闭合伤口。术后给予预防感染治疗。3术后实验兔一般情况：观察动物饮食、日常活动及伤口愈合情况。4X线检查：分别于术后当日、4、8、16周行实验兔右桡骨正位X线检查,观察界面骨愈合情况。5大体观察：术后4、8、16周叁个时间点,切除各组桡骨标本表面软组织,肉眼观察骨缺损部位的大体修复情况。6组织学检查：术后4、8、16周叁个时间点,各组标本经脱钙、石蜡切片HE染色及不脱钙硬组织切片甲苯胺蓝染色观察植入物材料与宿主骨界面及材料内部新生骨生长情况。7植入物与骨界面扫描电镜观察：上述叁个时间点观察A、B、C、D组界面、材料表面及孔隙内部类骨样组织生长情况。9生物力学检测：取术后16周A、B、C、D组完整桡骨及对侧正常桡骨标本行叁点弯曲试验,检测修复后桡骨生物力学性能。9 Micro-CT扫描评估：取术后16周A、B、C、D组以植入物为中心,截取长度为2.5cm带尺、桡骨标本行Micro-CT扫描、叁维重建及新生骨计量学分析。结果：1术后动物一般情况：术后3-7天后动物饮食、精神逐渐恢复正常,切口部位无红肿、渗液及化脓等,均为I期愈合；2周后肢体活动基本恢复正常,跛行消失,体重恢复到术前水平。2 X线观察：术后当日X线可见各组植入物位置良好,无明显位移。术后4、8、16周叁个时间点可见随时间延长各组植入物与宿主骨界面结合越来越牢固,骨折线逐渐消失,其中D组骨痂塑形良好,骨髓腔部分再通；在A、B、C叁组中,A组界面骨痂生成最多,塑形良好；E组术后16周仍可见骨缺损,两断端骨质逐渐硬化,髓腔封闭。3大体标本观察：术后4、8、16周叁个时间点A组材料表面逐渐被骨样组织包裹,界面与宿主骨结合牢固,塑形良好。B、C组界面结合牢固,表面材料孔隙大部分可见骨样组织填充,靠近界面部分表面被骨组织覆盖。D组植入材料逐渐降解,材料降解部分被新生骨样组织替代,有明显的毛细血管医长入,材料与宿主骨界面融合良好、牢固。术后4周空白组断端可见少量骨痂生长,16周时断端骨质硬化,光滑,髓腔已经封闭,缺损处无骨性连接形成。4组织学检查：术后4、8、16周各组标本经脱钙、石蜡切片HE染色及不脱钙硬组织切片甲苯胺蓝染色,光镜观察可见随着时间推移,A-C叁组钽-宿主骨界面新生骨组织数量逐渐增多并沿多孔钽孔隙长入材料内部,骨组织由幼稚到成熟；D组异种骨逐渐降解并被新生骨组织包裹替代；而E组(空白对照组)骨缺损始终存在,洞壁被薄层纤维膜内衬。5植入物与骨界面扫描电镜观察：术后4、8、16周叁个时间点观察可见A、B、C叁组钽-骨界面、材料表面及孔隙内部骨胶原及成骨细胞逐渐增多,新生骨逐渐成熟并过度为板层骨,钽-骨界面缝隙逐渐结合紧密；D组新生骨组织逐渐增多,并分化为成熟状小梁骨。6生物力学检测：术后16周对A、B、C、D组及对照组正常完整桡骨行叁点弯曲试验测定最大载荷力及抗弯曲强度,结果显示A、B、C、D四组无论是最大载荷力还是抗弯曲强度均低于正常桡骨组,并且有统计学差异(P<0.01)。A、B、C、D四组间比较,A组力学性能最高,B、C组次之,D组最低,经单因素方差分析各组间差异均有统计学意义(P<0.01)。7 Micro-CT扫描观察：术后16周,A、B、C、D四组植入物界面、表面均有大量骨组织覆盖,内部不同程度新生骨组织填充。新生骨体积分数定量分析结果显示D组新生骨组织百分比高于A、B、C叁组,其中A组与D组无统计学差异(P>0.05),B、C组与D组有统计学差异(P<0.01); A, B, C叁组间有统计学差异(P<0.01)。结论：国产多孔钽材料具有良好的生物相容性,RGD多肽修饰多孔钽支架材料骨传导能力更强,修复兔桡骨节段性骨缺损效果肯定。
董树君[4]2009年在《新型纳米改性生物玻璃/PLGA复合材料的制备及骨缺损修复的实验研究》文中指出近年来,生物活性玻璃/聚乙交-丙交酯(BG/PLGA)复合材料以其良好的骨传导性、骨诱导性、生物降解性能、较高的机械性能得到了广泛的关注。研究结果表明,BG/PLGA复合材料能很好地把两组分各自所具有的生物可降解性、骨传导性及骨诱导性能有机地结合起来,但由于无机粒子和聚酯两相界面缺乏有效粘连,复合材料一旦暴露在生理环境中,易于未等缺损完全修复而过早地失去其有效强度。因此我们采用全新的方法对纳米BG粒子表面进行化学接枝改性,得到表面接枝聚乳酸的生物活性玻璃粒子,而后将纳米改性生物活性玻璃与聚乙交-丙交酯(PLGA)应用熔体模压-颗粒浸出法及超临界CO2发泡法制备叁维多孔支架,提高无机填料与PLGA基体间的界面结合力,改善了BG在PLGA基体间的分散性,制备了新型高性能BG/PLGA复合材料,并以PLGA为对照,对该复合材料进行体外细胞学相关评价及兔颅骨缺损的动物体内骨修复实验检测其诱导成骨的能力。结果表明改性生物活性玻璃纳米粒子可以均匀地分散在PLGA基体中,通过加入合适比例的改性纳米生物玻璃,可改善聚酯类材料的表面界面性质,使之更有利于成骨细胞在材料表面的生长和增殖,提高了聚酯类材料的生物活性,同时联合应用溶解模压-颗粒浸出法及超临界CO2发泡法制备叁维多孔支架,能够有效提高复合物支架的孔隙率、改善孔隙表面形貌及其粗糙度,从而进一步提高了复合物支架的生物学性能。
朱书涛[5]2008年在《模拟微重力下胶原/壳聚糖/β-TCP修复体复合兔成骨细胞和软骨细胞体外培养的实验研究》文中研究说明关节软骨缺损是临床的难题之一,自体关节软骨移植存在来源有限、创伤大、费用高等缺点,异体关节软骨移植难以排除免疫源性的问题。随着组织工程的发展,利用人工再生组织来修复关节软骨缺损,为临床解决这一难题提供了新的思路和方法。虽然关节软骨组织工程的研究已经取得了很大进展,但仍有大量的问题等待解决。尤其是软骨和软骨下骨的分层、断裂问题,和宿主的整合问题,关节软骨修复的长期效果等。研究目的将胶原、壳聚糖与β-磷酸叁钙(Tricalcium Phosphate,TCP)有机复合,模仿体内关节软骨的分层结构,增加支架材料的力学强度,构建胶原/壳聚糖/β-TCP层状梯度支架材料。分别将扩增的经成骨诱导的兔骨髓间充质干细胞(BoneMesenchymal Stem Cells,BMSCs)和软骨细胞植入其中体外微重力下培养,对照组采用普通培养板培养,观察成骨细胞和软骨细胞在胶原/壳聚糖/β-TCP层状梯度修复体中的黏附、增殖及生物学性状变化,以评价该复合材料作为关节软骨组织工程支架的可行性,并观察模拟微重力对细胞及构建组织的效用。研究方法以细胞和支架材料为实验对象,以普通培养和微重力培养分两组对照。MTT实验分组:5个时间组:1天、3天、5天、7天、9天。5个平行孔/组,两培养组共50孔。1.成骨细胞和材料复合:用全骨髓贴壁筛选法培养新西兰兔原代BMSCs,体外扩增后进行成骨诱导,3周后检测细胞碱性磷酸酶活性和钙结节生成情况,诱导成功后和修复体复合体外普通培养和旋转培养仪模拟微重力培养,进行MTT检测比较两组细胞增殖情况并观察模拟微重力对细胞的影响;培养1周后行扫描电镜检查观察成骨细胞在修复体材料内黏附生长情况;4周后,细胞和材料复合物脱钙、石蜡包埋、切片,行苏木精一伊红染色及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色,观察成骨细胞的生物学性状变化及模拟微重力对复合物的力学影响。2.软骨细胞和材料复合:取新西兰幼兔的关节软骨消化培养软骨细胞体外培养扩增,取2、3代细胞行s—100细胞免疫化学染色,收集前4代软骨细胞作为种子细胞和修复体复合体外普通培养和旋转培养仪模拟微重力培养,进行MTT检测比较两组细胞增殖情况并观察模拟微重力对软骨细胞的影响;培养7天后行扫描电镜检查观察软骨细胞在修复体材料内黏附生长情况;4周后,细胞和材料复合物进行脱钙、石蜡包埋、切片,行苏木精—伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察软骨细胞的生物学性状变化及模拟微重力对复合物的力学影响。统计学分析:MTT实验中,相同时间点两组之间的比较用两独立样本t检验;同组不同时间点比较采用完全随机设计单因素方差分析(One-way ANOVA);两组整体之间比较采用重复测量数据的方差分析。α=0.05为统计学检验水准。研究结果1.细胞形态:初接种时BMSCs呈球形,悬浮在培养液中,24h后开始贴壁,细胞呈长梭形,少量多角形,约1周左右细胞铺满培养瓶。加入成骨诱导培养液后细胞生长相对缓慢,其形态发生了改变,细胞逐渐增大,进而出现重迭生长。2周后细胞间可见圆形或卵圆形的钙化结节,结节周围细胞呈放射状分布。碱性磷酸酶染色阳性,Von Kossa法检测出钙化结节。体外单层培养的软骨细胞呈球形,悬浮在培养液中,5h后开始贴壁,细胞呈扁平状,大多数叁角形,少量多角形,约1周细胞铺满培养瓶,呈“铺路石”样。第2、3代细胞S—100免疫细胞化学染色胞浆内呈阳性反应。2.细胞/支架光镜下观察:细胞悬液滴加于经预湿处理的复合支架材料上,支架材料迅速膨胀,证明细胞扩散到支架内。接种24h后,倒置显微镜下见材料不透明,无法观察其内细胞生长情况,但可见大量成骨细胞或软骨细胞贴附在材料旁培养板内。3.MTT检测:成骨细胞和材料复合后,除第1天两组之间无显着性差异外(P=0.706),其余时间点两组之间有显着性差异(P＜0.05),模拟微重力组明显比培养板组细胞增殖力高。两组之间整体比较也有统计学意义(P=0.000),证明模拟微重力对成骨细胞在修复体内的增殖比普通培养起到了更好的促进作用。软骨细胞和材料复合后,不同时间点两组之间有显着性差异(P＜0.05),模拟微重力组明显比培养板组细胞增殖力高。两组之间整体比较也有统计学意义(P=0.000),证明模拟微重力对软骨细胞在修复体内增殖比普通培养起到了更好的促进作用。4.扫描电镜:培养7d后,细胞成团地吸附于修复体表面及孔隙侧壁,并可见细胞间通过突起相互连接,或伸出伪足贴附于支架孔隙壁上;从复合支架材料中间切开,普通培养组见其内部有少量细胞贴附于孔隙侧壁,模拟微重力组则可见到大量细胞,细胞数量比普通培养组明显增多。5.HE染色和免疫组化结果:成骨细胞和材料:4周后,材料表面可见大量细胞,内部可见部分细胞聚集成团;细胞呈长梭形,细胞团中有基质分泌,沉积于细胞周围;Ⅰ型胶原免疫组织化学染色示胞浆内呈阳性反应。软骨细胞和材料:4周后,材料表面可见大量细胞黏附成层状,内部亦可见细胞聚集成团;细胞呈圆形或椭圆形,细胞团中有基质分泌,沉积于细胞周围,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示胞浆内呈阳性反应。普通培养组的细胞多聚集在修复体表面,细胞数量明显多于修复体内部,而模拟微重力组材料表面和材料内部细胞数量相差不大,内部细胞数量明显比普通培养组多。结论1.成功培养出兔原代软骨细胞和BMSCs,并成功诱导BMSCs为成骨细胞,为进一步的细胞和材料的接种提供了数量充足和生物学性能良好的种子细胞。2.胶原/壳聚糖/β-TCP层状梯度复合体模拟了正常关节软骨分层结构,细胞相容性好,能提供细胞生长的叁维环境。3.转壁式旋转培养仪产生的模拟微重力可以使软骨细胞和成骨细胞在修复体内高密度生长,能更好的促进细胞增殖和细胞外基质分泌,提高了组织工程化关节软骨体外培养的质量,为关节软骨组织工程的研究开辟了新的道路。
李林[6]2010年在《藻酸钙/RGD复合软骨细胞、成骨细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究》文中指出目的：观察藻酸钙/RGD与软骨细胞、成骨细胞复合体修复兔膝关节软骨全层缺损的短期效果及可行性。为临床上应用软骨组织工程方法修复关节软骨缺损提供一定的试验基础。方法：分别取1周龄内的日本大耳白兔的双膝关节软骨及颅盖骨,分别用酶消化法和翻转干沽法分离得到原代软骨细胞和成骨细胞,然后传代培养,得到足够软骨细胞和成骨细胞后,与RGD和藻酸钠混合,选用成年日本大耳白兔36只,随即分成A、B、C叁组：A：实验组；B：对照组；C：空白组。分别于两侧股骨髁间窝造成全层软骨缺损模型,然后做相应处理：A组植入藻酸钙/RGD+细胞复合物；B组植入藻酸钙/细胞复合物；C组缺损旷置。常规饲养,分别于术后4、8、12周取材,观察软骨缺损修复情况,并对其进行评估。结果：动物实验显示实验组软骨缺损以透明软骨修复为主；对照组以透明软骨修复为主,但软骨质量明显低于试验组；空白组则以纤维组织填充为主。结论：RGD能明显促进细胞的粘附,从而更好的维持细胞的表型；应用软骨组织工程方法修复软骨缺损短期效果良好,能较好的修复关节软骨缺损,恢复关节外形及功能。
杨森[7]2014年在《兔骨髓间充质干细胞定向成骨诱导复合异种松质骨修复兔尺骨骨缺损的实验研究》文中进行了进一步梳理目的研究经定向成骨诱导的兔骨髓间充质干细胞复合异种松质骨移植修复兔尺骨骨缺损的能力及特点，为骨组织工程治疗骨缺损选择理想的种子细胞来源及合适的支架材料寻求一种新的方法。方法先取新生24h内新西兰大白兔颅盖骨，采用改良酶消化法提取兔成骨细胞（osteoblast，OB）；再取2周龄新西兰大白兔四肢长骨，采用密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞（BMSCs）。通过细胞形态学观察、细胞化学染色、MTT法测定细胞增殖等检测，对两种原代细胞进行鉴定。取第3代BMSCs和OB，应用Transwell双层细胞培养板将两种细胞共同培养，实验共设叁组：A组上室接种OB，B组和C组上室均未接种细胞，B组使用成骨诱导培养液培养，C组使用BMSCs生长液培养作为空白对照，叁组培养下室均接种BMSCs。通过细胞形态学观察、茜素红染色、BMSCs上清液中碱性磷酸酶和骨钙素测定，RT-PCR检测骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达，对诱导后的细胞进行鉴定。取检疫合格的猪股骨髁部松质骨，经处理制成异种松质骨。使用前BMSCs生长液浸泡6h，晾干后接种定向成骨诱导的BMSCs，体外培养一周，显微镜下观察成骨诱导的BMSCs在异种松质骨支架上的粘附、生长情况，MTT法测定支架材料上细胞增殖情况。取6月龄新西兰大白兔36只，采用完全随机抽样的方法，抽取30只新西兰大白兔每组15只作为实验组和对照组，其余6只作为空白对照组，随机选取一侧前肢制作尺骨中段15mm节段性骨缺损模型。按照植入物不同分为叁组：实验组：缺损处植入成骨诱导的BMSCs复合异种松质骨；对照组：缺损处植入异种松质骨；空白对照组：不植入任何材料。于术后4、8、12周3个时间点每组处死5只实验动物取标本，通过X线检查、标本大体观察和骨缺损区HE染色，及术后12周兔尺骨缺损区几何参数测量，比较各组骨缺损的修复情况。结果1.细胞的提取和鉴定：密度梯度离心法提取BMSCs，操作简单、细胞纯度高，得到的细胞呈长梭形；改良酶消化法提取成骨细胞，耗时短、细胞产出率高，得到的细胞呈短梭形或多角形。两种原代细胞经鉴定为骨髓间充质干细胞和成骨细胞。2. BMSCs定向成骨诱导分化：Transwell双层细胞培养板法和成骨诱导液培养法两组细胞上清液中AKP、OCN含量在同时间检测点上检测结果显示两者无明显差异（P>0.05），两组成骨诱导后的细胞茜素红染色均为阳性，RT-PCR检测两组成骨诱导的细胞OCN和CollagenⅠ的mRNA均有表达。3.异种松质骨的制备与成骨诱导的BMSCs复合培养：经去抗原处理后的异种松质骨，外观呈白色至淡黄色、疏松多孔状。接种细胞后显微镜下观察细胞在异种松质骨支架材料上生长良好，MTT法测定结果显示随着培养时间增加细胞数量增多。4.骨缺损修复实验：X线观察:术后4、8、12周显示实验组骨缺损区骨痂量明显多于对照组及空白对照组。X线评分结果：各组均随时间延长得分逐渐增多，实验组与其他各组相比差异均有统计学意义(P <0.05)。HE染色:术后4、8、12周实验组形成的编织骨量明显多于对照组和空白对照组。术后12周标本几何参数测量：实验组尺骨骨痂中分处的冠状径、矢状径和骨痂厚度明显大于对照组和空白对照组，统计学分析差异有统计学意义(P <0.05)。结论1.密度梯度离心法提取BMSCs和改良酶消化法提取成骨细胞是较为优良的原代细胞提取方法。2.Transwell双层细胞培养板法能使BMSCs定向诱导为成骨细胞，但不适合大规模应用。3.经检测猪骨组织与成骨诱导的BMSCs组织相容性好，异种骨可作为组织工程骨的支架材料。4.成骨诱导的BMSCs复合异种松质骨具有良好的修复性能，可以成为骨缺损修复的一种新途径。
张耀[8]2008年在《催乳素对体外培养奶牛成骨细胞作用的研究》文中研究说明目的:观察不同浓度催乳素对体外培养的奶牛成骨细胞增殖、分化、蛋白分泌及相关蛋白基因表达功能的影响。方法:无菌取出新生奶牛的肋骨,采用组织块培养法获取成骨细胞,进行原代、传代培养,取第二代细胞通过形态学观察、碱性磷酸酶染色、钙化结节染色等方法鉴定后作为试验模型,将用含20%胎牛血清的DMEM培养液配制的不同浓度的催乳素(0.01、0.1、1.0、10.0μg╱mL)与第二代奶牛的成骨细胞共同培养。采用MTT法观察催乳素对成骨细胞增殖功能的影响(用波长570nm处OD值表示);氨基安替吡啉测酚法(金氏法)观察对成骨细胞分化功能的影响(用碱性磷酸酶活性表示);放射免疫法观察对成骨细胞分泌骨钙素和肿瘤坏死因子-α的影响(用放免活性单位—ng/mL表示);RT-PCR法观察对成骨细胞骨钙素mRNA和肿瘤坏死因子-αmRNA表达影响。结果:采用组织块培养法获得的细胞具有典型成骨细胞的形态特征,细胞碱性磷酸酶染色呈阳性且阳性率达90%以上,钙化结节经茜素红染色呈阳性,符合成骨细胞的生物学特性,表明培养的细胞为高纯度的成骨细胞。加催乳素培养后测定细胞的增殖结果显示:不同浓度的催乳素均表现为抑制成骨细胞的增殖作用。0.1、1.0、10.0μg/mL试验组与对照组比较差异不显着(P＞0.05),0.01μg╱mL试验组与对照组比较差异极显着(P＜0.01),各浓度催乳素抑制奶牛成骨细胞的增殖作用不存在时间-效应关系。加催乳素培养后测定碱性磷酸酶(ALP)活性结果显示:不同浓度的催乳素均表现为抑制成骨细胞碱性磷酸酶的分泌。与对照组相比,0.1、1.0、10.01μg/mL试验组均可抑制碱性磷酸酶的分泌,但与对照组比较差异不显着(P＞0.05),0.01μg/mL试验组与对照组比较差异极显着(P＜0.01)。加入不同浓度催乳素培养7d后,0.1、1.0、10.0μg╱mL试验组表现为抑制骨钙素的分泌,与对照组比较差异不显着(P＞0.05);0.01μg╱mL试验组则表现为促进骨钙素的分泌,与对照组比较差异极显着(P＜0.01)。加入不同浓度催乳素培养7d后,较对照组,肿瘤坏死因子-α的分泌均呈不同程度增多,其中1.0μg╱mL和10.0μg╱mL试验组与对照组比较差异显着(P＜0.05),0.01μg╱mL和0.1μg╱mL试验组与对照组比较差异极显着(P＜0.01)。催乳素作用10d后提取细胞总RNA,进行RT-PCR检测BGP mRNA和TNF-αmRNA表达情况,试验结果显示:0.1、1.0、10.0μg/mL试验组较对照组BGP mRNA表达量均降低,0.01μg╱mL试验组较对照组BGP mRNA表达量升高;0.01、0.1、1.0、10.0μg╱mL试验组较对照组TNF-αmRNA表达量均升高。结论:在一定浓度范围内(0.01μg╱mL～10.0μg╱mL),催乳素抑制体外培养奶牛成骨细胞的增殖。在一定浓度范围内(0.01μg╱mL～10.0μg╱mL),催乳素抑制体外培养奶牛成骨细胞的分化。在一定的浓度范围内(0.01μg╱mL～10.0μg╱mL),低浓度催乳素促进成骨细胞BGP蛋白的分泌,而高浓度催乳素则抑制成骨细胞BGP蛋白的分泌。在一定浓度范围内(0.01μg╱mL～10.0μg╱mL),催乳素使成骨细胞TNF-α蛋白的分泌均呈不同程度增多。一定的浓度范围内(0.01μg╱mL～10.0μg╱mL),催乳素对成骨细胞BGP和TNF-αmRNA表达的影响趋势,同催乳素干预成骨细胞分泌相关蛋白的趋势一致。
于婷[9]2009年在《新型电活性可降解纳米复合骨修复材料的制备及生物活性研究》文中研究说明羟基磷灰石(HA)是人体骨组织和牙齿的主要无机成分,人工合成的HA由于其成分和结构与骨骼相似,且与骨组织具有很强的键合能力,在骨科具有广泛的应用前景。聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)是已被FDA许可应用于临床的生物可降解高分子材料。将纳米化HA(n-HA)与PLGA复合可以显着提高PLGA的力学强度和成骨性能,因而成为近年来的研究热点。为改善纳米粒子的分散性,本研究采用低聚乳酸表面接枝改性的n-HA(op-HA),与PLGA共混制成新型纳米复合材料op-HA/PLGA,并采用熔体模压/颗粒浸出法制备出不同孔隙率的叁维组织工程支架。分析支架材料的孔隙结构特征和力学强度。通过细胞培养、流式细胞仪、Realtime-PCR评价成骨细胞在材料表面的粘附、扩展、增殖和成骨相关基因的表达情况;通过动物实验,研究支架材料对兔桡骨缺损的修复效果。探讨op-HA/PLGA的生物活性和支架材料的最佳致孔剂比例。在上述工作基础上,为进一步提高材料的生物活性和智能性,将可生物降解的导电高分子聚苯胺(PA)和聚乳酸(PLA)的嵌段共聚物(PAP)与op-HA/PLGA以一定比例复合,制备电活性可降解纳米复合骨修复材料(PAP/op-HA/PLGA)。通过细胞毒性实验、全身急性毒性实验和热原实验来评价材料的生物安全性;同时,在一定的脉冲电刺激作用下,研究该电活性材料对成骨细胞的粘附、生长和增殖能力以及成骨相关基因表达的影响;通过动物植入实验,评价支架材料对兔桡骨缺损的再生修复功能。研究结果表明,op-HA/PLGA复合材料由于掺入了HA纳米粒子,其细胞粘附、扩展和增殖能力,以及I型胶原等成骨相关基因的表达水平均明显提高;叁维支架材料的力学性能和动物骨骼修复效果以85%致孔剂为最佳。电活性纳米复合材料PAP/op-HA/PLGA具有良好的生物相容性,在脉冲电刺激的作用下,明显增强成骨细胞的粘附、生长和增殖能力,促进成骨活性基因的表达;将该材料与op-HA/PLGA结合应用,在脉冲电刺激作用下,可显着提高骨骼的愈合速度和愈合质量。该新型智能材料显示了良好的骨科临床应用前景。本研究通过对op-HA/PLGA纳米复合材料和电活性PAP/op-HA/PLGA纳米复合材料的生物相容性、成骨活性和骨修复能力进行详细深入研究,为新材料的制备和临床应用提供了实验依据。
范伟[10]2004年在《VEGF基因修饰组织工程骨促进兔大段骨缺损修复的实验研究》文中认为骨缺损是临床中常见疾患，传统治疗手段主要是通过自体骨、同种异体骨或异种骨移植达到骨缺损的修复。以上方式存在供体受限、免疫排斥反应以及疾病传播等问题。近年来，基因工程和组织工程技术的不断发展，为临床骨缺损修复提供了更多的治疗选择。利用组织工程骨修复大段骨缺损成为目前研究的热点。组织工程骨的构建包括种子细胞、支架材料以及细胞因子叁大要素。体外构建的组织工程骨是细胞与材料的复合体，自身无营养来源，植入体内后，需血液-细胞间液为种子细胞提供营养。若植入区血供不良或植入物血管化过程较长，附着在支架上的种子细胞可因缺乏营养而出现代谢紊乱，细胞增殖、分化及分泌功能受损甚至死亡，最终导致移植物失效而变为单纯的骨传导材料，成骨能力下降。因此，组织 3<WP=9> 重庆医科大学博士学位论文工程骨植入体内后的快速血管化，是保证植入物中种子细胞成活、增殖、分泌，最终达到加快骨缺损修复的前提。目前，该方面的研究尚处于起步探索阶段。 本实验拟采用体外构建的 VEGF 基因修饰组织工程骨，植入兔大段骨缺损区，观察、检测其在体内的再血管化及促进骨缺损修复的作用。 本实验从五个方面进行研究，主要方法、结果及结论如下：1. 生物衍生骨支架材料—脱蛋白骨的制作及检测 将新鲜成年新西兰大耳白兔干骺端松质骨，采用过氧化氢-乙醚法制作生物衍生骨材料－脱蛋白骨（DPB）。经倒置相差显微镜、扫描电镜观察及多项理化指标检测，证实用该法制得的 DPB 具有与原骨组织基本相同的孔隙－网架叁维结构系统，其孔径、孔隙率、孔间交通率以及孔内表面结构均符合组织工程骨的要求，材料中蛋白质、脂质成份基本被完全去除，消除了免疫源。由松质骨来源制作的 DPB 是一种较理想的组织工程骨支架材料。2. 兔成骨细胞的分离、培养和鉴定 将出生前 1 周胎兔的颅骨组织，采用酶消化－组织块联合培养法分离、培养出原代成骨细胞并进行传代培养。经对细胞进行镜下形态学观察、细胞化学及酶学等鉴定，证实本实验所分离培养出的细胞为成骨细胞，具有良好的增殖生化能力。经对传代培养和冻存复苏后培养的成骨细胞进行观察，其细胞形态学特征及增殖分化能力与原代细 4<WP=10> 重庆医科大学博士学位论文胞无明显差异。是构建组织工程骨较理想的种子细胞。3. pEGFP/VEGF121 重组质粒的构建及其在成骨细胞中的表达 以人胎脑文库为模板，通过 PCR 方法扩增出人 VEGF 121 基因，构建入增强绿色荧光蛋白 pEGFP-C1，成功构建重组质粒 pEGFP/VEGF121。经酶切鉴定和测序报告分析，证实质粒构建的正确性。脂质体法体外转染成骨细胞，荧光显微镜观察及 ELISA 法检测证实，重组质粒可在成骨细胞表达 VEGF 蛋白，证明该重组质粒构建成功。4. 组织工程骨的体外构建 将第4代成骨细胞和转染VEGF基因的成骨细胞分别与DPB支架材料在体外复合培养。DPB 材料在接种前经预湿处理，细胞悬液的配制选用处于对数生长期细胞，每个材料中接种细胞数为 6×105 。通过消化法、倒置相差显微镜和扫描电镜观察，证实两种细胞与 DPB 经体外复合培养后，在 DPB 材料外表面、孔内表面均有生长。随培养时间的延长，材料中细胞数量也随之增多，并出现细胞间连接融合，部分细胞有伪足伸出与材料表面呈锚着状生长。由此表明，本实验中制作的生物衍生骨支架材料 DPB 与成骨细胞具有良好的细胞相容性。体外成功构建了组织工程骨和 VEGF 基因修饰组织工程骨，为下一步应用于兔大段骨缺损修复奠定了基础。5. VEGF 基因修饰组织工程骨体内再血管化及成骨活性观察 将兔大段骨缺损模型分为 A、B 两组进行实验。兔双侧桡骨中段切取 15mm，制备大段骨缺损模型。A 组缺损区左侧植入单纯 DPB 材 5<WP=11> 重庆医科大学博士学位论文料作为对照侧，右侧植入组织工程骨作为实验侧；B 组左侧缺损区植入物与 A 组实验侧相同，右侧缺损区植入 VEGF 基因修饰组织工程骨。在 1、2、4、6、12W，采集 A、B 两组植入物分别行 1.血生化指标检测；2.大体标本观察；3.组织形态学观察；4.超微结构观察；5.微血管墨汁染色观察；6.VEGF 免疫组化检测；7.骨矿含量测定；8.RT-PCR检测 VEGF 基因转录水平等。 本部分实验结果表明， VEGF 基因修饰组织工程骨，在植入动物骨缺损区后，第 1 周植入物周围及材料内部即形成大量网状细小血管，并在第 2 周继续保持较多水平，随后血管逐渐增粗、减少、纵向走行；组织工程骨血管形成情况较之滞后 1 周以上，单纯 DPB 材料则更差。VEGF 蛋白表达在第 1 周最高，随后逐渐下降，渐于正常。骨形成以VEGF 基因修饰组织工程骨最快，较组织工程?
参考文献：
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[2]. b-FGF、IGF-Ⅱ、TGF-β影响兔成骨细胞体外增殖的实验研究[J]. 曹之强, 丁奕健, 刘建华, 王慧明, 吴求亮. 浙江医学. 2003
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[4]. 新型纳米改性生物玻璃/PLGA复合材料的制备及骨缺损修复的实验研究[D]. 董树君. 吉林大学. 2009
[5]. 模拟微重力下胶原/壳聚糖/β-TCP修复体复合兔成骨细胞和软骨细胞体外培养的实验研究[D]. 朱书涛. 南方医科大学. 2008
[6]. 藻酸钙/RGD复合软骨细胞、成骨细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究[D]. 李林. 遵义医学院. 2010
[7]. 兔骨髓间充质干细胞定向成骨诱导复合异种松质骨修复兔尺骨骨缺损的实验研究[D]. 杨森. 郑州大学. 2014
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[9]. 新型电活性可降解纳米复合骨修复材料的制备及生物活性研究[D]. 于婷. 吉林大学. 2009
[10]. VEGF基因修饰组织工程骨促进兔大段骨缺损修复的实验研究[D]. 范伟. 重庆医科大学. 2004